ゼブラフィッシュの幼虫の複数の困難な標的組織をトランスフェクションするために心室インジェクションを用いた遺伝子モルホリノアプローチを逆転

本手順の全体的な目的は、幼魚の心室内にモルフォリノオリゴヌクレオチドを注入し、遺伝子をノックダウンさせることで、再生過程におけるそれらの機能を評価することです。まず幼魚を麻酔し、アガロースモールドの溝に配置します。次に、注入針を心室に挿入します。

次に、心臓内の溶液が排出されるようパルス間に待機時間を設けながら、形態溶液を心室に4回から6回注入します。最後に、尾鰭を切除し、3日間再生させます。最終的に、オープンソースソフトウェアであるFiji ImageJのライントレースツールを用いて、鰭の再生領域を測定することで、鰭の再生への影響を評価できます。

トランスジェネシスや変異導入などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、直接注入に適さない幼虫組織において、Morpholinoを用いて遺伝子のノックダウンが可能であることです。直径0.75 mmのガラスキャピラリーをニードルプラーにセットし、規定のパラメータで引き延ばします。時計職人用ピンセットを用い、マイクロメーター付き接眼レンズを備えた実体顕微鏡下で、引き延ばしたキャピラリーを破断させ、直径20 µmのニードルを作成します。次に、ゴム製の回転砥石を備えた旋盤を用いてニードルを研磨し、20 µmのベベル（斜面）を形成します。凍結乾燥されたMorpholinoを1×PBSに溶解し、最終濃度7.5 mMのMorpholinoストック溶液を調製します。

Morpho注入溶液を作成するため、Morphoストック溶液 2.5 µL と 1 mM endo Porterストック溶液 2.8 µL を混合し、最終濃度をMorpho 3.5 mM、endo porter 0.5 mM とします。10 µLチップを装着したマイクロピペットを用いて、ベベル付きガラス針に Morpho溶液 5 µL を充填します。次に、空気圧ピコポンプに接続されたマイクロマニピュレーターのニードルホルダーにガラス針を挿入します。

注入角度を約45度に調整し、針を単一の平面方向にのみ移動させるようにします。次に、マイクロインジェクターの値を以下のように設定します。保持圧（hold pressure）を20 pounds per square inchまたはPSI、噴射圧（ejection pressure）を15 PSI、ゲーティング範囲を100 millisecond、周期値（period value）を10.9 millisecondsに相当する1.9に設定します。1X PBSで作成した1.5% agaroseの融液20 millilitersを準備し、10 centimeterのペトリ皿に注ぎます。

次に、溝付きの注入型を温めたアガロースに入れ、硬化したゲルの表面に、幼魚を麻酔するための溝を形成します。幼魚をtrican 20 mg/Lを含むアクアリウム水100 mLに入れます。幼魚が接触への反応を停止した後、プラスチック製のパストラルピペットを用いて、幼魚の腹側が溝の垂直なアガロース壁に面するように、濡れたアガロース型の溝へと慎重に移動させます。

arosプレートを実体顕微鏡下に配置し、心室が注射針とは反対側を向くようにします。次に、針を下げて心室に約1〜2 µm挿入します。このとき、深く挿入しすぎないように注意してください。

次に、Morpho溶液を3 nLパルス分心室に注入し、心臓内から溶液が消失するまで待機してから、さらに5パルス分を注入します。その後、針を抜き、乾燥を防ぐために1×PBSを入れたペトリ皿に入れます。続いて、E3培地を満たした転送ピペットを用いて、幼魚を新鮮なE3培地を含むペトリ皿に慎重に移し、細胞へのMorphoの取り込みと維持を確実にします。注入の効果を評価するため、実験期間中、12〜24時間ごとに注入を繰り返します。

魚を麻酔後、E3培地で満たした平らで濡れたアロスプレートに置き、明視野および蛍光を備えた実体顕微鏡を用いて撮影します。再生に関する画像の解析には無料ソフトウェアのFiji Image Jを使用し、ライントレースツールを用いて再生成長量を測定します。まず、メインメニューのFijiメインウィンドウにファイルをドラッグ＆ドロップして、画像のキャリブレーションを行います。

ドロップダウンメニューからanalyzeをクリックして、すべての画像のスケールを設定します。set scaleをクリックし、チェックボックスをクリックしてglobalオプションをオンにします。次に、画像を再度ドラッグ＆ドロップし、ツールバーで再生成長量を測定します。

フリーハンド選択ツールを選択し、測定する領域を囲みます。最後に、Ctrl Mを押します。これにより、囲まれた領域の値を平方ピクセルで示す新しい結果ウィンドウが開きます。ここで示されているように、注射から数分以内に、morpho endo porter溶液が血管系を通じて、鰭（ひれ）のひだや脳などのさまざまな組織に分布し、少なくとも12時間以上にわたって保持されます。

幼生期の鰭の遠位構造の再生を評価するため、鰭ひだの遠位端、脊髄、脊髄を欠く遠位部、ここには見えないが遠位の体幹筋、および直接注射では標的としにくいが連続的な脳室注射後にモルフォリノを取り込んでいると思われる色素細胞を除去した。したがって、この手法により、個別に標的とすることが困難な組織へのモルフォリノ送達を比較的容易に促進でき、再生中の鰭における複数の組織での遺伝子機能を同時に評価することが可能となる。再生に関与する特定の遺伝子の重要性を解析するため、幼生期の鰭を部分的に切断し、モルフォリノを取り込んだすべての組織を切除する。

実演した通り、幼生の鰭のひだは切断後数日でその構造を再生します。ここでは、再生に必要な遺伝子を標的としたモルフォリノを用いて、非注入群およびミスマッチ・モルフォリノ対照群と比較して、発生後の再生反応を阻害しました。この手法は、再生分野の研究者がゼブラフィッシュの鰭の再生に関与する分子メカニズムを探索する道を開きました。