マイクロ流体Perifusionデバイス内のマルチパラメトリック膵島Perifusionシステム

本発表では、インスリン分泌犬に応答した膵臓アイレットの動的インスリン分泌、カルシウム流入、ミトコンドリア電位変化を同時に測定するためのマイクロ流体を用いた眼瞼灌流システムについて紹介する。灌流システムは、3層のマイクロ流体デバイス、シリンジポンプ、フラクションコレクターインスリンで構成されています。分泌物誘発性カルシウム流入およびミトコンドリア電位は、蛍光顕微鏡セットアップを使用して画像化されます。

こんにちは、私の名前はオラ、シカゴのイリノイ大学の移植外科のヴァルホルター博士の研究室のウォーラーです。こんにちは、同じく10月の研究室のドン・リーです。こんにちは、同じくホルスターの研究室のトリシア・ハート Dr.Al います。

今日は、線形グルコースグラジエントを使用した眼瞼同時イメージングの手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いてアイレットの視覚と機能を研究しました。それでは始めましょう。

この手順で使用されるマイクロ流体デバイスは、標準的なフォトリソグラフィーによって生成された硬化PDMSの3つの層から組み立てられます。シリコンマスターから生成された最初の層には、アイレットを所定の位置に優しく保持するマイクロ流体デバイスのウェルがあり、深さ150マイクロメートル、直径500マイクロメートルです。2番目の層には、高さ500マイクロメートル、幅2ミリメートルのチャネルがあります。

チャネルの中央は、溶液のより良い交換のために流れを広げるために拡張されます デバイス内では、層の中央に高さ3ミリメートル、幅7ミリメートルの穴を開けることによって交換井戸が作られます。3 番目の層は、PDMS の厚いスラブです。このレイヤーを準備するには、チャネルの入口と出口に合わせて両側に小さな穴を開けます。

2 番目の層では、3 つの層がすべて生成されると、1 番目の層がウェルを上に向けてスライドガラスに接着されます。次に、2 番目の層は、チャネル間隔を上にして 1 番目の層に結合されます。最後に、3 番目の層が 2 番目の層に結合されます。

層が結合されると、デバイスは実験に使用できるようになります。70%エタノールを充填し、Tai on Tubeingでデバイスの入口ポートに接続された10ミリリットルのシリンジを使用して、エタノールをデバイスチャネルに流すことにより、マイクロ流体デバイスを滅菌します。次に、同じセットアップフローを使用して、脱イオン水でエタノールを洗い流します。

デバイスを滅菌したら、タイゴンチューブを使用して加熱された顕微鏡ステージに置き、高グルコース溶液と低グルコース溶液を含むシリンジポンプをYコネクタに接続します。次に、マイクロ流体デバイスの入口に接続します。マイクロ流体デバイスの出口をフラクションコレクターに接続します。

チューブが摂氏37度のホットプレートに置かれていることを確認します。実験全体を通して溶液を生理学的温度に保つことは非常に重要です。次に、ラボビュープログラムを使用して、実験中にマイクロ流体ネットワークを介して灌流されるグルコースグラジエントを開始します。

このソフトウェアは、2つのグルコース溶液の流量を変化させます。シリンジポンプを制御することにより、ここには、線形、ベル型、正方形のグルコースグラジエントプロファイルなど、さまざまなグルコースグラジエントプロファイルを作成できます。この実験で示されている計算された期待値と比較して、2 ミリモルから 25 ミリモルのグルコースの線形勾配は、2 つのグルコース溶液の 0.01 ミリリットル/分の変動流量と、溶液が混合された後にデバイスに入る 0.25 ミリリットル/分の一定の流量で使用されます。

適切なグラディエントプロファイルを選択したら、グラディエントの安定性をテストします。まず、グラデーションシステムを開始します。次に、フラクションコレクターを開始し、1ミリリットルのエンドオーフチューブに8つの灌流

次に、血糖値計を使用して、Excelを使用して各チューブ内のグルコース濃度をテストします。血糖値計から得られた結果を分析します。次に、高グルコースシリンジを、デバイスを介して1分あたり1ミリリットルの速度で、クレブスリンガーバッファーPERFUSE50ミリリットルに0.5%BSA溶液を含むシリンジと交換します。

これにより、マイクロチャネル壁へのインスリンの非特異的吸収が防止され、BSAによる灌流後に分泌されたインスリンレベルを後で測定する際の精度が確保されます。高グルコース溶液reusと交換してください。カルシウム指示薬染料fira 2:00 AMおよびミトコンドリア電位指示薬色素ルーミン1 2 3を含む2ミリモルグルコースKrebsリンガー緩衝液に25〜30個の厳選マウスアイレットを懸濁し、摂氏37度で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、デバイスを灌流システムから切り離し、ピペットの先端を挿入してアイレットをマイクロ流体デバイスに慎重にロードし、膵島を入口ポートに封じ込め、ロード後に膵島をゆっくりと分注し、デバイスを灌流システムに再接続します。気泡が入らないように注意してください。次に、シリンジポンプを始動して、2ミリモルグルコースを含むKRBでアイレットの灌流を開始します。

このステップでは、培地から余分な色素を洗い流し、実験中に使用する励起フィルターセットと蛍光フィルターセット、および露光時間を指定します。次に、フラクションコレクターを1分間隔で収集するように設定し、アイレットを使用して低グルコース溶液を使用します。シンプルなPCIイメージングソフトウェアの関心領域またはROIツールを使用して、イメージングする領域またはアイレットを定義します。

また、細胞を10分間洗浄した後に減算される背景領域を丸で囲み、グルコース勾配画分コレクターを開始し、タイムラプスイメージングを開始します。30分後、ソフトウェアと高グルコースシリンジポンプの電源を切ります。低グルコースで灌流を続けて、高グルコースの影響を洗い流します。

10分後、シリンジポンプを切って低血糖の流れを止めます。灌流後、分析のためにデータをExcelにエクスポートします。Perfu Eightに分泌されるインスリンの量は、ELAマウスアイレットによって決定できます。

ここに示すように、2〜25ミリモルグルコースの線形勾配で灌流しました。カルシウムの流入とインスリン分泌は、6ミリモルに対応する約13分間の灌流後に引き起こされます。グルコース。ミトコンドリア電位の変化は、予想通り約11分で早く見られます。

このデータは、このマイクロ流体ネットワークを使用してアイレットの生理機能を特徴付ける利点を示しています。アイレット生理学の研究に当社のマイクロ流体パラフュージョンデバイスを使用する方法を紹介しました。この手順を実行するときは、実験中にアイレットが動く可能性があるため、デバイス内に気泡がないことを確認することを忘れないでください。

また、フルーリーはアイレットを邪魔することなく、1分間に1mlまで調整することができます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。