Name: マイクロ流体ネットワークを用いた脳スライスの刺激と標準灌流チャンバー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 58 s
Description: 学ぼう、マイクロ流体デバイスを用いた脳スライス刺激法。電気生理学装置と統合し、神経伝達物質の空間的・時間的制御を可能にするモジュール型デバイスの作製と応用を解説します。

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資金は、NIH MH - 64611とNARSAD若手研究者賞によって提供されていました。また、作者は彼らの技術支援のためにアダムビーグリー、マークDikopf、とベンスミスに感謝します。

SU - 8金型製作マスターの準備<ol><li>シリコンウエハ基板上にSU - 8のマスターは、2段階の標準的なネガ型レジストリソグラフィプロセスを用いて調製される。 </li><li>シリコンウエハ上のアライメントマークは、（ウェーハの外周に沿って位置する）これらの構造体の高さとカミソリの刃を使って削除している実際のデバイス構造以上のものです。 </li><li>シリコンウエハは、イソプロピルアルコールで洗浄し、N 2の流れで乾燥させる。最も高いデバイスの構造よりも小さい厚さでテープで作られた支柱は、ウェハの四辺上のアライメントマークを交換してください。 注：支柱の高さが最も高いデバイス構造を超えている場合は、スルーホールPDMSモールドに形成されていません。 </li><li>マスターのシリコンウエハは、室温でホットプレート上に置かれる。 </li></ol> PDMSの溶液の調製<ol><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）ソリューションの4グラムは十分に硬化剤1部とシリコーンエラストマーの10部を混合することによって調製される。 注意 ：2つの溶液をPDMSモールド全体に類似した物性を得るために均一に混合されていることを確認します。 </li><li>混合プロセス中にPDMSの溶液中で生成された気泡は、真空デシケーターを使用して削除されます。 </li></ol> PDMSコーティングおよび硬化<ol><li>泡のないPDMSの溶液を徐々に気泡がディスペンシング工程中に生成されていないことを確認してSU - 8マスター上に分配される。 </li><li>書き込みの透明フィルムの一端は、ホットプレートの上に置き、ゆっくりと均等にSU - 8マスターにPDMSを広めるためにPDMSのソリューションに配置されます。このプロセス中に生成される気泡は、プローブを使用して削除する必要があります。 [注：複数の気泡の発生を防ぐために透明性を持ち上げないでください。] </li><li> borofloatのスラブは、均一な圧力を適用する透明シートの上に配置されます。穏やかな圧力は、透明性と円形のSU - 8表面の間に挟まれた、最小限、あるいはまったくPDMSがあるような背の高い円形の構造物の上面（チャネル長の中間に位置し、チャネルの幅に沿って中央）に適用されます。構造。 </li><li>さらに3つのborofloatのスラブは、前に円形の開口部の構造物の上面にし、硬化プロセスの間に一定の圧力を適用するには、シリコンウエハーborofloatスラブサンドイッチの上に配置されます。 </li><li>ホットプレートの温度は、75に増加して℃、PDMSは、1時間この温度で​​硬化させる。ホットプレートを50℃の温度にしています</li><li>スラブが削除され、透明性を穏やかにマスターし、その上にコーティングされた薄いPDMSシートを残して削除されます。 </li></ol>マイクロ流体デバイスの構築マスターからのPDMSシートの除去<ol><li>灌流チャンバーの外側の境界は、SU - 8マスター上のポートと灌流チャンバーにポートを合わせて後にカミソリの刃を使用して、PDMSシートに出刻まれています。 </li><li> PDMSシートは、ゆっくりとPDMSの引き裂き防止するためのチャネルの長さに沿って引っ張って、マスターから削除されます。 PDMSシートは上向きに微小流体ネットワークの面を持つ透明シート上に配置されます。 </li><li>入口および出口ポートは、コルクボーラーを用いて作られています。 </li></ol>ガラスカバースリップにPDMSシートの接着<ol><li> PDMSシート（表面はマイクロ流体ネットワークを含む）、ガラスのカバースリップの接合面は、その後、静かに透明のシートに配置、3Mのスコッチテープを使用して洗浄し、最後にO 2プラズマチャンバ内に配置されます。 </li><li>接合面は10秒165ワットのプラズマで処理されていますガラスのカバースリップのプラズマ処理表面はすぐにPDMSシートのプラズマ処理表面に接着されている。 注意：接着面の間に閉じ込められた気泡を除去するためにガラスの表面に穏やかな圧力を与える。 </li><li> 5分PDMSとガラスの間に良好な接合を得ることができます。 5分後に軽くPDMSシートを接合プロセスのために置かれた透明性を取り除く。 </li><li>マイクロ流体デバイスは、チャネルは親水性にするための酸素プラズマシステムに配置されます。プラズマ処理は、1分間165ワットで行われます。 </li></ol>マイクロ流体デバイスと灌流チャンバーの統合灌流チャンバーの準備<ol><li>既製の灌流チャンバーを命じられた、と入口と出口ポートが結合しているときにマイクロ流体デバイスとチャンバー、チャンバーと、デバイス上のポートが整列されるように掘削された。灌流チャンバーの底面は、Pが塗布されているDMS室とマイクロ流体デバイス間の密封度を得るために。 </li><li>書き込み上の透明シートは、室温でホットプレート上に置かれる。 </li><li>一グラムPDMSのソリューションは、前述と同様のプロセスで調製される。泡のないPDMSの溶液は、次いで徐々に気泡の発生を回避透明シート上に分配される。 </li><li>灌流チャンバーは、PDMSのソリューションに配置されます。 </li><li> borofloatのスラブは、均一な圧力を適用すると、チャンバーの底面にPDMSの薄いコーティングを得るためにチャンバーの上部に配置されます。 </li><li>ホットプレートの温度は、75に増加して℃、PDMSは、1時間この温度で​​硬化させる。 </li></ol>マイクロ流体デバイスと灌流チャンバーの接合<ol><li>スラブが削除され、透明性を穏やかに灌流チャンバーと、その底部の表面にコーティングされた薄いPDMSシートを残して削除されます。不要なPDMSは、アクセスポートからPDMSの除去のためのカミソリの刃と鋭い先端のプローブを用いて除去される。 </li><li>マイクロ流体デバイスのPDMS表面とチャンバーのPDMSの底面は、静かに、3Mテープを使用してきれいに透明のシートに配置し、最後に酸素プラズマチャンバ内に配置されます。 </li><li>表面は10秒165ワットのプラズマで処理されていますチャンバーのPDMSコーティングされた表面は、すぐにマイクロ流体デバイスのPDMSの表面に接着されている。 注意：接着面の間に閉じ込められた気泡を除去するためにガラスの表面に穏やかな圧力を与える。 </li><li>使用直前に、デバイスは、チャネルが親水性にするための酸素プラズマシステムに配置されます。プラズマ処理は、1分間165ワットで行われます。 </li></ol>マイクロ流体デバイスを用いた神経化学的微小環境に脳スライスを公開<ol><li> （マイクロ流体デバイス）の親水性マイクロチャネル - （灌流チャンバー）の組み合わせが標準ACSF（人工脳脊髄液）溶液を充填されます。 </li><li>入口ポートでACSF液の小滴を分注し、ソリューションは、最大のチャネルに邪悪になることができます。出口ポートからシリンジを使用して残った気泡を取り除きます。口からマイクロ流体デバイスの出口ポートへの流体の受動的なポンピングを可能に出口ポートでACSF液の大粒を分注する。 注意：注意はパッシブポンピング法を用いた流体の流れを可能にするためにチャネルからすべての気泡を除去するために取られるべきである。 </li><li>プレーンプラットフォームの（灌流チャンバー）コンボと顕微鏡アダプタにプレーンプラットフォームを修正 - （マイクロ流体デバイス）を修正しました。 </li><li>標準の入口と出口（吸引）標準ACSF液と脳スライスの連続的な灌流のための灌流チャンバーへの配管を接続します。 ACSF液を連続して95％O2 - 5％CO 2で吸引される。 注：灌流チャンバーの槽内のACSFの一定レベルを維持するために、吸引チューブの位置を調整します。 </li><li>灌流チャンバーはACSF液で満たされると、スポイトを使用して灌流チャンバ内の脳のスライスを配置します。プローブを使用して、マイクロ流体デバイスの円形の開口部の上に脳スライスを配置します。脳のスライスが円形の開口部の所望の位置になると、脳のスライスを固定化するスライスのアンカーを使用してください。 </li><li>マイクロ流体デバイスは、現在、流体のポンピングパッシブを使用して様々な神経伝達物質に脳スライスを（灌流チャンバー内およびマイクロ流体ネットワークの上に置かれた）公開するために使用することができます。 </li></ol>

<ol><li>Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+PDMS+microfluidic+chamber+for+controlling+brain+slice+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment.</a> Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).</li>
<li>Walker, G. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+pumping+method+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A passive pumping method for microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).</li>
</ol>

著者は生物学の様々な分野への実証マイクロ流体技術に関する共同研究に開放されています。

既存のマクロスケールやマイクロスケールの脳スライスの灌流チャンバーは、それらが神経伝達物質で脳のスライスを公開するために提供する空間分解能の点で制限されています。ここに示したマイクロ流体デバイス技術は、簡単なバイオMEMS技術を使ってこの制限を克服しています。それは、マイクロ流体デバイスの製作と、既存の電気生理学的セットアップと統合の容易さのシンプルさが実証デバイス技術の広範な応用を可能にすることが予想されます。以前は不可能だった興味深い実験は、現在のマイクロ流体デバイスで実行することができます。脳スライスの異なる微小環境は、異なる時間スケールで異なる神経伝達物質に暴露することができる。現在のプロトタイプのデバイスは、互いに隣に位置する4つだけ並列チャネルと円形の開口部で構成されています。しかし、このデバイスのレイアウトを簡単にさまざまな形状や大きさの開口部を持っているという別のデザインを実装することによって変更することができます、またはマイクロチャネルは、脳スライスの異なる微小環境における開口部の配置につながる形で蛇行することができます。

<table><tbody><tr><td>RC-26GPL</td><td>器具</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0236</td><td>低プロファイル大型バス RC-26GLP 記録チャンバー</td></tr><tr><td>SHD-26GH/10</td><td>器具</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0253</td><td>RC-26G用ステンレス製スライス固定具、ネジ間隔 1.0 mm</td></tr><tr><td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td><td>試薬</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>シリコーンエラストマーキット</td></tr><tr><td>Plasma Preen-II 862</td><td>器具</td><td>Plasmatic Systems, Inc.</td><td></td><td>マイクロ波プラズマシステム</td></tr><tr><td>Model P-1</td><td>器具</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0277</td><td>シリーズ 20 プレーンプラットフォーム、Model P-1</td></tr><tr><td>SA-NIK</td><td>器具</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0291</td><td>Nikon Diaphot/TE200/TE2000用アダプター、SA-NIK</td></tr><tr><td>Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid)</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>正確な組成は用途により異なる</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体ネットワークを用いた脳スライスの刺激と標準灌流チャンバー

Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

我々は、簡単に既存の電気生理学のセットアップに統合することができる2つのレベルのマイクロ流体デバイスの作製を実証している。 2レベルのマイクロ流体デバイスは、2段階の標準的なリソグラフィプロセス1をネガ型レジストを用いて製造されています。最初のレベルは、それぞれの終了時に入口と出口ポートを持つマイクロチャネルが含まれています。番目のレベルは、チャネル長の中間に位置し、チャネルの幅と一緒に中央にマイクロスケールの円形の穴が含まれています。受動的な揚水方法は、入口ポートから出口ポート2に流体をポンプするために使用されます。マイクロ流体デバイスは、既製の灌流チャンバーと統合され、電気生理学のセットアップとのシームレスな統合を可能にしています。流体は出口ポートに向かってマイクロチャネルを介して吸気ポートの流量で導入されており、また血流の浴中にマイクロチャネルの上部にある円形の開口部を通って脱出。このように灌流チャンバーのバスで、マイクロ流体デバイス上に置かれた脳のスライスの底面は、別の神経伝達物質で公開することができます。マイクロ流体デバイスのマイクロスケール厚さと材料の透過的な性質[ガラスカバースリップとPDMS（ポリジメチルシロキサン）]マイクロ流体デバイスは、脳スライスの顕微鏡を可能にするために使用。マイクロ流体デバイスは、脳スライスの微小環境に導入された化学的刺激の変調を（空間的および時間的の両方）が可能です。

我々は、さまざまな神経伝達物質によく制御された方法で脳のスライスのマイクロスケールの表面を露出させる標準的な電気生理学的セットアップと統合可能なシンプルなマイクロ流体デバイスの作製を実証する。

既存の電気生理学セットアップに容易に統合可能な、2層構造のマイクロ流体デバイスの作製について実証しました。この...

本日ご紹介するプロジェクトの主な目的は、脳 slice 刺激を空間的および時間的に制御できるようにすることです。もう一つの重要な点は、すでに複雑となっている電気生理学的なセットアップに簡単な変更を加えることで、実際にこの脳 slice 刺激を利用している様々な研究室に、このマイクロ流体デバイスを普及させることができるということです。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校バイオエンジニアリング学科のエディントン研究室の Java Chek Mohammad です。本日は、脳切片刺激用の単純な微細加工マイクロ流体デバイスの適用方法について解説します。本日ご紹介する脳切片デバイスは、いくつかの理由から非常に有用であり、その主な理由は、極めてモジュール性が高く、新たな改造を加えることなく既存の電気生理学的セットアップに組み込める点にあります。また、多くのマイクロ流体デバイスを複雑にする要因となるチューブやポンプの使用を回避できる点も特徴です。また、パッシブポンプ法を用いているため、チューブやポンプは一切不要です。3点目は、標準的な電気生理学のセットアップで使用される、カバーガラスと標準的な灌流チャンバーの間に挟み込む薄いPDMSメンブレンシートであるということです。本日実演する手順は、標準的なSU-8リソグラフィプロセスを用いて作製されたSU-8マスターから始まります。本日使用するマスターは2レベル構造となっており、1つのレベルにはマイクロチャネルの設計が、もう1つのレベルにはこれらのチャネルの上部に配置されるビア開口部の設計が含まれています。これにより、チャネル内を流れる溶液がビア開口部から外に出ることができます。このマスターはシリコンウェハー上に作成されており、このデバイスの上にシリコンまたはPDMSを流し込み、ウェハー上の構造をPDMSに転写して成形します。それでは、このデバイスの上にPDMSを流し込みます。次に、硬化後に形成され、カバースリップに接合されたPDMSメンブレンを取り出します。これでマイクロ流体デバイスが完成します。続いて、灌流チャンバーの底面に薄いPDMS層をコーティングし、標準的な灌流チャンバーを改造します。この改造した灌流チャンバーが用意できたら、先に作製したマイクロ流体デバイスを灌流チャンバーに接合します。マイクロ流体デバイスの作製において、重要な点が2つあります。1つ目は、PDMSを注ぐ前にホットプレートの電源を切っておくことです。これにより、ウェハー上にPDMSを注いだ際に、即座に硬化することを防げます。もう一つの重要な点は、シリコンウェハの四隅に使用するスペーサーの高さが、シリコンウェハ上の最も高い構造物よりも低くなければならないことです。これは、PDMSの硬化工程において、VR開口部を確実に形成するためです。現在、私たちはソフトウォール

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

電気生理学的にマイクロ流体の適用

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学ぼう、マイクロ流体デバイスを用いた脳スライス刺激法。電気生理学装置と統合し、神経伝達物質の空間的・時間的制御を可能にするモジュール型デバイスの作製と応用を解説します。

マイクロ流体ネットワークを用いた脳スライスの刺激と標準灌流チャンバー

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