マイクロ流体ネットワークを用いた脳スライスの刺激と標準灌流チャンバー

今日お見せするプロジェクトの主な目的は、脳のスラッシュ刺激を空間的および一時的に制御できるようにすることです。そしてもう1つの大きなポイントは、すでに複雑な電気生理学的セットアップに簡単な変更を加えることで、このマイクロ流体デバイスを実際にこの脳生命刺激を使用するさまざまな研究室に広めることができるということです。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校バイオエンジニアリング学部のエディントン研究室に所属するJava Chek Mohammadです。

今日は、脳スライス刺激のための単純なマイクロ加工されたマイクロ流体デバイスをどのように適用するかをお見せします。今日デモンストレーションする脳スライスデバイスは、いくつかの理由で非常に有用であり、主な理由は、それが非常にモジュール化されているため、新しい追加の変更を加えることなく既存の電気生理学的セットアップに適合できることです。また、マイクロ流体デバイスを複雑にするチューブやポンピングの使用も不要です。

また、パッシブポンプ方式を使用しているため、チューブやポンプは必要ありません。そして3つ目は、カバースリップと標準的なプロフュージョンチャンバーの間に挟まれたPDMSメンブレンの薄いシートに過ぎないということです。これは、標準的な電気生理学のセットアップで使用されます。今日お話しする手順は、標準的なSV eightリソグラフィープロセスを使用して製造されたa C eightマスターから始まります。

そして、今日ここにあるマスターは2レベルのマスターで、1つのレベルにはチャンネルの設計、マイクロチャンネル、そしてこれらのチャンネルの上に広がるVR開口部の設計があり、チャンネルを流れるソリューションがビア開口部から出てくることができます。そこで、このマスターをシリコンウェーハ上に作成し、シリコンまたはPDMSを使用してこのデバイスの上部に注ぎ、このウェーハの上にある構造をPDMSに成形します。そこで、このデバイスの上にPDMSを注ぎます。

次に、硬化後に形成され、カバースリップに接着されたPDMSメンブレンを取ります。そして、マイクロ流体デバイスです。次に、灌流チャンバーの底部にPDMSの薄い層を引用して、標準の増殖チャンバーを変更します。

そして、この改造された灌流チャンバーができたら、以前に製造したマイクロ流体デバイスを灌流チャンバーに接着します。マイクロ流体デバイスの作製には、2つの重要なポイントがあります。1つは、PDMSを配置する前に、ホットプレートをオフにして、ウェーハにPDMSを注ぐときにPDMSがすぐにキューに入れないようにすることです。

また、シリコンウェーハの四隅に使用するスペーサーは、シリコンウェーハ上の最も高い構造よりも高さが小さくなければならないことも重要なポイントです。これは、PDMSの硬化プロセスを行うときにVRの開口部が得られることを確認するためです。ここに私たちはこの柔らかい壁のモジュラークリーンルームにいて、これは私たちが標準的なC 8リソグラフィープロセスを使用して製造したマスターです。

そして、それは2レベルのマスターであり、最初のレベルは4つの入口と1つの出口を持つチャネルの設計を持っています。また、4つのチャンネルすべての中央領域には、チャンネルの上に立っているビアまたはポスがあります。そして、これらは製造プロセス中に作成されたアライメントマークです。

そして今、私はそれを取り除き、PDMS硬化を行う方法をお見せします。エッジビーズ効果により、ウェーハの外周の厚さは、紙の中央にある実際のデバイスよりも厚くなります。そこで、リリザーブブレードを使用してこのアライメントマークを取り除き、ウェイトに対応するために、高さ140ミクロンのスペーサーを使用し、ウェーハの四隅に配置します。

そのため、カミソリの刃が実際のデバイスの近くに届かないようにする必要があります。次に、エアダスターを使用してこのSVA粒子を除去し、ウェーハをPDMS金型準備の準備が整いました。しかし、その前に、高さ140ミクロンのこのスペーサーを配置する必要があります。

そこで、ウェーハの四隅に4本のテープを配置します。次に、テープがウェーハに適切に付着していることを確認します。テープの高さが140ミクロンだったのは、チャンネルとVSを備えた2レベルのマスターの高さが150ミクロン

また、PDMSの硬化中に重りをPDMSの上に置くときは、PDMSシートが平らになることを確認したいと考えています。そのため、角に同じ高さの4つのスペーサーを使用しています。次に、PDMSをコーディングし、それを硬化させてデバイスを作成する方法を示します。

しかし、その前に、PDMSソリューションをどのように準備したかをお見せしましょう。そこで、ベースを10部と硬化剤を1部ずつ取り、混合プロセスにより完全に混合します。この気泡を除去するためにPDMS溶液に多くの気泡を生成することがわかりますが、PDMSを入れた後、PDMSを乾燥物に入れた後、気泡はありません。

そして今、PDMSを硬化に使用する準備が整いました。次に、PDMSをウェーハに置き、硬化させてPDMSメンブレンを得る方法を紹介します。そこで、PDMSをウェーハに載せ、この透明度を使用してPDMSを覆います。

これにより、デバイスのsupを取り外し、デバイスを透明度から分離し、透明度の上にウェイトを配置します。そして、ウェイトを使用している理由は、PDMSの厚さを均一にするためです。そして、もう一つの重要な問題は、ビア開口部を取得することです。

ですから、どこにいても、PDMSは望ましくなく、ウェイトはそれを行うのに役立ちます。ここでわかるように、ホットプレートがオフになっていますが、その理由はPDMSがすぐに硬化するのを望まないため、オフにしています。次に、PDMSを移植する前に、ウェーハが平らであることを確認する必要があります。

そして今、以前に準備したPDMSを移植することができます。気泡が発生しないように、PDMSをウェーハに十分近づけてディスペンスしてください。そして、ここで最も重要な点は、PDMSの上に透明性をどのように配置するかです。

シートの配置によって気泡が発生しないようにする必要があります。そして今、私はこのガラスラボの1つを配置し、PDMSの余分なPDMSを邪魔にならないようにします。さらに3つのガラスラボを配置し、この特定のマスターのためにガラスラボが動かないようにしています。

そして、これらの特定の機能について、この 4 つのガラス ラボを配置すると VS.そして、PDMSの余分なPDMSが透明性とウェーハの間に邪魔にならないようにします。私たちは1〜2分待ってから、さまざまなマスターやさまざまなデザインのホットプレートを開始できます。ビア開口部を得るためには、ガラスラボの数を増やすか、ガラスラボを減らす必要があるかもしれません。これでホットプレートをオンにする準備ができたので、温度を75度に設定します。

そして、75度の温度に達したら、タイマーを1時間に設定して、PDMSを硬化させることができます。PDMSを1時間硬化させたので、ホットプレートをオフにして、摂氏50度まで冷ますことができます。これを行う理由は、SEAが割れないようにするためです。

75度から室温まですぐに取り外すと、今度は電源を切って50°Cまで下がるのを待つことができます。ホットプレートの温度が摂氏50度に下がったので、透明度からウェイトを取り除くことができます。これで、ホットプレーヤーからウェーハを取り外すことができ、カットする準備が整いました。

これで、PDMSシートをA C eightマスターから取り外す準備ができたので、アルミホイルを取り外す必要があります。次に、透明シートを削除する必要があります。ここには標準的な灌流チャンバーがあります。

位置合わせができるように修正しました。マイクロ流体デバイスの穴、入口および出口ポート。つまり、これらはPDMSメンブレンの4つの入口ポートと1つの出口ポートです。

そして、これらは灌流チャンバーの4つの入口と1つの出口と一致する必要があります。次に、灌流チャンバーをスライドさせてから、PDMSメンブレンの穴に合わせます。それらが揃ったので、カットする準備が整いました。

これで、チャンバーを取り外してプローブを使用できます。PDMSメンブレンのすべての端が自由に取り外せることを確認してください。その後、冷凍庫を使用してPDMSメンブレンを取り外し、デバイスの上部からPDMSを取り外すときに、PDMSメンブレンを引き裂かないようにPDMSを非常にゆっくりと動かすことができます。

次に、SC 8 マスターで形成された空洞を持つ PDMS メンブレンを配置し、平らであることを確認します。そして、私たちがこれをしている理由は、穴、入口と出口のポートを作るとき、PDMSが側面で粗くないからです。それはカバースリップと接着されます。

したがって、空洞が上側にあることを確認する必要があります。これで、穴がはっきりと見えるように、入口ポートと出口ポートを作成できます。黒の背景を入れます。

次に、入口ポートと出口ポートにPDMSが残っていないことを確認する必要があります。それもそうです、PDMSをすべて削除します。次に、PDMSメンブレムを別の透明シートに移します。

そのため、シートとカバースリップをプラズマで処理し、それを敷き詰めて、再び空洞が上部にあるようにします。したがって、この表面をプラズマで処理し、カバースリップをプラズマで処理すると、これら2つの表面を一緒にしてマイクロ流体ネットワークを形成し、PDMSシート間の気泡を除去できます。また、透明感はスコッチテープが使えます。

したがって、これにより、PDMSシートが平らになり、接着がはるかに良くなります。次に、上面のスコッチテープを使用して、PDMSメンブレンからほこりを取り除きます。これで、PDMSメンブレンに接着するカバースリップを貼ることができます。

そして今、これら2つのPDMSとガラスをプラズマ処理する準備が整いました。私たちは、このマイクロ波修飾プラズマシステムを使用してPDMSとカバースリップをプラズマ処理します。このガラスチャンバーは、このマイクロ波の内部にプラズマを生成することができます。そして、チャンバー内に真空を作り出すために、サンプルを中に入れさせてください。

今、私は酸素を流すことができます。これでプラズマシステムの準備が整いましたので、この特定のシステムに10%の電力と10秒を使用して、プラズマを視覚化します。プラズマ処理が行われている間、私たちはクランクを上げ、電力を100%に上げ、照明を消します。

そして今、プラズマ治療の直後の血漿を見ることができます。カウスリップとPDMSの両方の表面を接着しないと、プラズマ処理によりPDMS表面の親水性が失われます。カウスリップを装着したら、全面が気泡なく接着されていることを確認してください。

気泡がある場合は、取り除くことができます。次に、それを5分間脇に置いて、接着させます。ここでは、PDMSを使用してチャンバーのベースを変更した修正灌流チャンバーがあります。

そして、これは以前に行われました。そこで、電源を切ったホットプレートの上のホットプレートに透明感を置きました。そして、先ほど示したのと同様の方法で準備されたP-D-M-S-P-D-M-Sを注ぎました。

次に、灌流チャンバーをPDMSの上に置き、ここに示すように単一の重りを置き、30分間または摂氏75度で硬化させます。そして今、PDMSとカバースリップボンディングが発生するのを待っている間に、先に進んでチャンバーを準備できることを示します。そのため、チャンバーとマイクロ流体デバイスを接着することができます。

そのため、不要な場所から余分なPDMSを削除する必要があります。透明度を削除してからPDMSを削除し、次に入口ポートと出口ポートからPDMSを削除する必要があります。これで、チャンバーを前に準備したマイクロ流体デバイスと接着する準備が整いました。

5分待ったので、マイクロ流体デバイスを透明度から分離する準備が整いましたが、透明度をゆっくりと取り外す必要があります。そのため、PDMSとカバースリップは分離しません。灌流チャンバーの準備ができたので、PDMSを引用したばかりのチャンバーの底面と、PDMSを搭載したマイクロ流体デバイスの上面をプラズマ処理する必要があります。

部品をプラズマチャンバーに入れ、10%の電力で10秒間プラズマ処理を行います。これで、両方の表面がプラズマで処理され、接着する準備が整いました。接着する前に、チャンバーの入口ポートと出口ポートがマイクロ流体デバイスと一致していることを確認する必要があります。

また、私たちが整列させている機能は十分に大きいため、特別な機器は必要なく、肉眼でそれを行うことができます。チャンバーの上に位置合わせして配置したら、すべての表面が接触していることを確認してから、5分間放置できます。したがって、結合は5分間待った後の実験に十分です。

マイクロ流体デバイスがチャンバーに結合したので、チャネル表面のチャネルを親水性にします。ですから、実際にCFS溶液やその他の神経伝達物質を流すと、溶液はより簡単に流れることができます。そこで、私がやろうとしていることは、この装置全体をプラズマとプラズマの中に入れ、10%で1分間処理することで、内部チャネル全体の表面が親水性になります。

そして、それを水で満たし、電気生理学のセットアップに持って行き、実際の実験を行うことができます。さて、これで電気生理学のセットアップに進み、実際にこのデバイスを脳スライスで使用する準備が整いました。こんにちは、私の名前はuoです。

私は、イリノイ大学の生物工学科のArrington博士とFall博士と一緒に働いています。そして今、私はこのプラットフォームの上に持ち込んで食べたマイクロフリーデバイスを使って作業します。片側には、豊富なチューブが見えます。

反対側には、吸引チューブが見えます。したがって、デバイスは、95%の酸素と5%のCO2で泡立ったCSF溶液で灌流されます。マイクロVデバイスの準備ができたので、ブレインライセンスを取得し、マイクロデバイスにそれらを置きます。

次に、円形の開口部の上部に脳スライスを置き、次にアンカーを使用して脳スライスを固定します。脳スライスが固定されているので、それを刺激するために神経伝達物質を使用します。ここには4つの入口があるので、この4つの入口からこの出口までのパッシブポンピングを使用して、各入口に神経伝達物質を配置します。

そして今、Dr.Fallはこのデバイスについて話すつもりです。私たちにとって何がそんなに重要なのでしょうか?こんにちは、私はクリス・フォールで、脳生理学を専門としています。

そして、脳の切片を使う必要があるのは、微小電極やイメージング技術によるアクセスのためです。そしてこれまで、これらの脳スライスの神経伝達物質環境を変える唯一の方法は、スライス全体の流れを変えるか、非常に小さなマイクロピペットを使用して神経伝達物質を直接パフすることでした。ですから、Eddington's Groupと協力できることをとても嬉しく

この新しい技術により、私たちは脳の広い領域に対処し、局所的な神経伝達物質環境を変えることができます。そして同時に、電極とイメージング技術、そして最終的には多電極記録デバイスを同じユニットに組み込むことができます。さて、ここには、マイクロ流体デバイスのマウスの捻挫のスライスが表示されます。

そして、脳は多くの異なる領域から構成されていることに、目で見ても気づくことができます。これらの地域は異なることを行います。そして、生きている動物では、脳のこれらの異なる領域は、異なる神経調節音と神経伝達物質のトーンを持っています。

そして、これをスライスチャンバーで再現しながら、電気生理学的およびイメージング記録を作成できるようにしたいと考えています。ですから、これらの異なる領域に、異なる神経伝達物質を用いて、異なる濃度で、異なる時間経過で対処できることは、本当に素晴らしいことです。また、神経伝達物質を実際に視覚化することはできませんが、ここでは、さまざまな領域の脳スライスに送り込まれる蛍光色素の例を示すことができます。

ここでは、デバイスのチャネルに蛍光色素を流し、作られた細孔から蛍光色素が出てくる様子を視覚化している動画をご覧ください。そして、この初期のプロトタイプでも、流れによる空間分解能がいかに正確であるかがわかります。この動画を見ていると、染料がチャネルに流れ込み、次に穴から出ていく様子がわかり、その染料を洗い流すことで、流れの時間分解能がどの程度なのか

本日はご参加いただき、誠にありがとうございます。私たちは、マイクロ流体工学、そしてマイクロマシンが、脳の働きを理解するために、従来の生理学的技術とどのように結びつくことができるかを示すことができたと思います。感謝。