エラストマーのマイクロバルブの配列で制御マイクロ流体チップ

マイクロフルイディクス（微小流体デバイス）は、精密な液体制御が必要とされるハイスループット実験を行うための技術を細胞生物学者に提供します。こんにちは。ワシントン大学バイオエンジニアリング学科、Folk LabのNin Chen Leeです。本日は、PDMSマイクロバルブアレイによって制御されるマイクロフルイディックチップの作製方法をご紹介します。

このデバイスは3つの層で構成されています。第1層は流体層であり、異なるサイズのマイクロチャンバーが含まれています。第2層は制御層であり、2つの層の間にチャネルが含まれています。PMSの疎水性とコンプライアンスにより、薄いPMSメンブレンが存在します。

メンブレンがシード部分で密閉されるため、流体チャンバー同士が互いに隔離されます。制御チャネルを通じて真空を印加すると、PDMSメンブレンがたわみ、それまで隔離されていた流体チャンバーが連結されます。本日は、異なる混合比でサブナノリットル体積の水溶液を混合できるパラレルミキサーについてご紹介します。

そして、当研究室からのこのステップでは、細胞培養に複数の溶液を灌流させることができる統合マイクロ流体システムについて解説します。それでは始めましょう。ここでは、シリコンウェハー上のSU-8で構成された、微細構造を持つマスターをお見せします。

マスターは、これらの原版から標準的なSUH写真工程を用いて作製されました。これにより、PDMSレプリカを繰り返し作製することが可能です。マスターからPDMSを容易に剥離させるために、まずマスターを処理する必要があります。

通常、Florence Islandを用いてマスターを作成します。まず、ウェハーをエバポレーターに入れ、フォレストの液滴を滴下した後、デスクスケートチャンバーを閉じ、真空ポンプを作動させます。1、2、3分間真空状態を維持した後、真空ポンプを停止します。30分間蒸発させた後、ウェハーを取り出します。PDMSでレプリカを作成する前に、まずPDMS前駆体と硬化剤を10:1の比率で混合する必要があります。

まず、プレポリマーを31 g量り取り、次に硬化剤を3.1 g量り取り、5分間十分に混合します。完成した製品はこのようになります。その後、気泡を取り除くため、透明になるまで5～10分間、真空脱泡器に入れます。

PMSの脱気（デバブル）を待つ間に、コントロール層の領域にシリコンチューブを接着します。シリコンチューブを選択したのは、PMSと同じ成分であるため、後でデバイスに埋め込むことで気密性と液密性の高いシールを作成できるからです。ここで、小さなシリコンチューブの先端に少量のDセメント接着剤を塗り、マスターの入口領域に押し付けます。

チューブがアンプの上に倒れないようにするためには、シリコンチューブを切断する際に切り口を非常に平らにし、上部に接着剤を塗りすぎないようにする必要があります。接着剤をどのように押し付けるかについて説明します。それでは、ベントの両側に領域を作成し、蓋を取り外します。

PSが作製されました。このPSをマスターの上に流し込みます。チューブ周辺のPGAを引っ張らないよう注意してください。

次に、流体層の構造を持つもう一方のマスターに流し込みます。PSをマスターに流し込んだ後、ダストキッカーで5～10分間、再度脱泡を行う必要があります。脱泡後、PMSをオーブンで65～70 °Cで1時間から24時間かけて硬化させます。

承知いたしました。2時間後、PMSの硬化が完了しました。次に、PMSデバイスをSUマスターから切り離し、コントロール層の処理を行います。

チューブを装着し、デバイスの入口領域から接着剤を除去します。デバイスの入口領域は3つの層とコントロール層の両方に作成されていますが、シリコンチューブを装着するのは1つの層のみです。

例えば、ここではコントロール層のみに注目します。流体層へのアクセス経路を作るために、シリコンチューブの下にあるメンブレンに穴を開けます。これにより、デバイスのすべてに上部からアクセスできるため、ステレオスコープや従来の倒立顕微鏡を用いた顕微鏡観察が容易になります。

これからC室に入ります。CTM S膜を準備するために、ヘッドウェイ・スピナーを用いてPDF膜のスピンコートを行う方法を説明します。ウェハーをチャックの上に置く前に、ボールをプラスチックグラフで覆い、後で汚れを簡単に掃除できるように、下にペーパータオルを敷きました。

したがって、マスターの際と同様に準備が整っていれば、真空中で洗浄した後、シリコンウェハの上にPDMSを約2 mL分 dispense します。ここでは11〜12 µmの膜厚を得たいため、ウェハを7,000 rpmで20秒間スピンコートします。ここで、ウェハが回転している様子が確認できます。規定の時間まで回転させます。スピンコート後、ウェハを85 °Cのホットプレートで4分間加熱します。これでPDMS膜が硬化しました。

次に、プラズマオーブンを用いてPDMSメンブレンとコントロールレイヤーを酸化させます。プラチナパワーを75%に設定し、酸素圧を30 PSI、流量を5に設定します。これらのパラメータは、用途に応じて適宜調整が可能です。

タイマーを起動し、プラズマを30秒間照射します。次に、コントロールレイヤーをメンブレンの上に配置します。これらを接触させると、数分後にはコントロールレイヤーがメンブレンに接合されます。

数分後、メンブレンとともにコントロール層を取り除きます。これで、コントロール層をフルクリア（完全透明層）に合わせて整列させる準備が整いました。現在はクリーンルーム外であるため、スコッチテープを使用してフルクリア上のホコリを除去します。

また、コントロール層の入口領域からメンブレンを除去する必要があります。これは、下層の流体層にアクセスできるようにするためです。したがって、メンブレンが付いたコントロール層を流体層の上に配置してください。

すべてのチャンバー流体チャンバーとバルブを確認してください。これらがすべて左から右へ正しく整列していることを確認します。整列していない場合は、コントロール層を取り除いてやり直してください。

ここでは、流体層と制御層が整列していることがわかります。次に、これらの入口に細いチューブを挿入し、流体源および圧力源に接続します。続いて、バルブを圧力源に、流体入口を流体源に接続します。

ここでは、PDMSマイクロバルブの開閉のために、青色と黄色の2種類の異なる染料を使用しています。真空源と空気圧に接続されたソレノイドバルブを使用し、バルブはLightViewソフトウェアによって制御されます。それでは、バルブセット1番を開きます。

PDMSメンブレンがたわみ、バルブが開いているのがわかります。次に、最初のバルブセットを閉じ、2番目のセットを順に開閉します。これで、すべてのマイクロバルブが正常に動作しています。

2種類の異なるダイ（粒子）を用いて、マイクロ流体チャンバーを充填します。バルブセット1番を開き、真空を用いて2種類のダイをチャンバー内に引き込みます。チャンバーにダイが充填された後、バルブセット1番を閉じて各チャンバーを隔離し、その後バルブセットをオンにします。

2番目に、2つのアレイ内のペアを混合します。バルブを開いてから混合が完了するまで、通常1〜2分かかります。なお、チャンバーのサイズは10種類の異なるサイズで設計しています。

ここでは11種類の異なる混合比を調製しています。混合が完了した後、バルブを閉じることで、各チャンバーに異なる混合比が設定されていることが確認できます。

色は青から緑へ、そしてさらに黄色へと変化しました。作製されたこれらのデバイスは、薬剤スクリーニングなどの生物医学的アッセイや、走化性、あるいは異なる濃度の化学物質、成長因子、薬剤に対する細胞応答などの細胞生物学研究に活用できる可能性があります。私はChris Sipです。ここでは、統合マイクロ流体灌流システムであるデバイスについて実演します。これは、先ほど作製工程で見たデバイスと非常に類似しています。

唯一の、そして最大の相違点は、拡散によって混合されるバルブで区切られた個別のチャンバーを持つ代わりに、バルブによって制御され、合流する複数のインレットを備えたマルチプレクスバルブ方式を採用していることです。ここでは、バルブの選択的な作動によって、異なるインレットのオン・オフを制御する方法を実演します。さらに、統合されたミキシングチャネルの動作と、グラジエントのステアリングについても説明します。

画面上部には16個の入口があり、これらが合流しています。流れは上部からこの垂直チャネルを通り、細胞培養チャンバーであるこの分岐ネットワークへと流入します。ここで、入口から青色の染料に切り替えて流すと、チャンバーを通過する際の層流プロファイルを確認できます。次に、青色と黄色を組み合わせて流し、その後、これを切り替えて逆の組み合わせを作成します。

グラジエントを右側に誘導することができます。また、他の種類のグラジエントを作成することも可能です。ここではバルブの高速切り替えを示しており、異なる溶液をかなり迅速に交互に切り替えることができます。

現在、このホモジナイザーに青色と黄色の液体を供給しており、チャンバー内では溶液が緑色になって出てきます。また、任意の数の異なる入口を切り替えることも可能です。この例では、赤色の入口から供給しており、これによりすべての緑色の溶液が置き換わっています。本日は、マイクロ流体バルブベースのデバイスの作製方法を示し、サブリットル体積での2色の染料の異なる比率での混合を実演しました。

当研究室のChrisが、異なる溶液を灌流するための統合マイクロ流路システムについても実演しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。