Name: 部分的ライゲーションによるマウス頸動脈における乱流誘発アテローム性動脈硬化症と頸動脈内皮からのRNA単離の方法における簡便な方法のモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶマウス頸動脈部分結紮術による乱流誘発アテローム性動脈硬化症モデルと高純度内皮RNA単離法。超音波検証と迅速な動脈硬化進行観察が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、科学、技術と韓国の教育省からのNIH助成HL87012（HJ）、HL75209（HJ）、UO1HL80711（DH、DG、HJ）とワールドクラスの大学プロジェクト（HJ）からの資金によって支えられている。

1。左頸動脈の部分結紮<ol><li>マウスは、生​​後〜8週で使用されています。マウスの体重は少なくとも18グラムであることが推奨されます。 </li><li>ビーズ機器滅菌器で30秒のための器具を滅菌し、冷却することができます</li><li>ケタミン（80mg/kg）とキシラジン（10mg/kgより少ない）IACUCによって承認された腹腔内（ip）注射または別の麻酔と麻酔を誘発する。腹腔内注射の場合は、腹部の左側の低い象限にマウスを注入する。 </li><li>完全に麻酔までの温暖化チャンバ内の場所のマウス。つま先のピンチに反応して麻酔の深さを確認してください。 </li><li>仰臥位（腹側の上向き）の位置に外科的ステージの上に置いてマウス、。上下のステージへの唯一の後肢足テープフォア足の手のひらを。 </li><li>下顎と胸骨の間に首に脱毛剤のリベラルな量（例えばNairさんを）適用する。優しくマッサージすべての毛が除去されるまで。 </li><li>脱毛剤を拭き取ってdepilatedエリアにBetadineの適当な量を塗布します。 </li><li>ライゲーションのための6から0絹縫合糸の1インチの長さの切片を作製します。各マウスは、縫合糸の2つが必要になります。 </li><li>鋭い小さなはさみを使って、首の中央に4〜6ミリメートル縦切開を行います。皮膚および基礎となる筋膜の両方をカットする必要があります。 </li><li>正中線から左へ、左耳下腺を移動し、露骨にちょうど気管の解剖を開始。あなたは簡単に脈動左総頸動脈を識別することができるはずです。 </li><li>もし分岐が見つかるまで尾側に総頸動脈に従ってください。 </li><li>外頸動脈、内頸動脈、後頭動脈と上甲状腺動脈：単刀直入に左総頸動脈から次の4つの遠位枝を露出させる分岐を細かく分析。これらの血管、特に優れた甲状腺は、壊れやすいことができます。あなたの郭清を伴う非常に注意してください。 </li><li> 6から0絹縫合糸を使用して優れた甲状腺上記外頸動脈を結紮する。これを行うには、動脈の下one鉗子を渡すと、他の鉗子の助けを借りて、プレカット縫合糸の一部をつかむ。ゆっくりと動脈の下渡す縫合糸を引く。結び目に巻き込まれて周囲の組織を避けてしっかりと結びます。あなたが効果的に、実質的に異なるモデルである完全なライゲーションを行うことになりますプロシージャの最後で、上甲状腺動脈を脱いで下にはネクタイ場合。 </li><li>同じテクニックを使用して1つの結び目で内頚動脈と後頭動脈を結紮する。 </li><li>縫合糸と上甲状腺動脈の開存の位置を確認してください。 </li><li>ティッシュメンドの少量を使用しておおよその皮膚と密接な肌。 </li><li>回復するまで、温暖化のチャンバー内にマウスを置きます。回復は通常30〜60分かかります。 </li><li>動物は、最初の24時間以内に苦痛になっている場合に使用される麻酔は、長引く痛みの軽減（すなわち、吸入イソフルラン）を提供しない場合やブプレノ​​ルフィン（0.1mg/kg）の単回投与は、ポスト手術直後に投与する必要があります。我々の経験では、麻酔のために投与ケタミン投与量は手術が経験豊富な外科医によって実行され、それ以上の鎮痛が必要とされていない十分な鎮痛を提供します。 </li></ol> 2。頸動脈超音波検査<ol><li>部分的なライゲーションが乱流を誘発したかどうかを検証するには、頸動脈の流れは、1日後にライゲーションを検討すべきである</li><li>イソフルランで麻酔を誘導する - 必要に応じて麻酔インダクションボックスを使用することができる</li><li>上の画像の段階、腹側で麻酔したマウスを置きます</li><li>イメージング段階で心電図センサーにテープの腕や脚</li><li> Nairさんのリベラルなアプリケーションで首を落葉させる（すでにライゲーションの手続きのために行われていない場合は、この手順にのみ必要です） </li><li>温度を記録するために直腸の温度計を挿入する</li><li>首にゲルエコー適用されます。 </li><li> B -モードで起動します。 </li><li>結像面は90度（プローブ上のノブは、マウスの鼻に向かって指していなければなりません）でなければなりません</li><li>画像が得られるまで、マウスの首へのプローブを下げます。 </li><li>ステージは左と右気管まで（ミッドライン構造）識別された操作</li><li>左総頸動脈を識別する</li><li>チルトイメージング段階ので角度が撮像面と頸動脈の間に作成されていること。この角度より大きい、強いドップラー信号になります。 </li><li>左総頸動脈の中央にあるパルス波ドップラーを置きます。 </li><li>必要に応じて角度補正を使用してください。 </li><li>右総頸動脈の測定を繰り返します。 </li><li>成功した部分的な頸動脈結紮では拡張期大動脈入口に向かって流れの逆転と、右側に比べて左総頸動脈の流れの全体的な減少（〜80〜90％）になります。 </li><li>いったん良好な画像が得られている、テープの解像度からマウスやフリーマウスオフジェルをエコーワイプ、麻酔をオフにするtraints。温めた回復室でマウスを置きます。 </li></ol> 3。頸動脈から内膜のRNA分離<ol><li>制度的IACUCプロトコルに従ってCO 2吸入によりマウスを犠牲にする</li><li>ペーパータオルにテープ足を。 </li><li>腹部から胸部の上部にマウスの皮膚を切り取ります。 </li><li>ハサミで胸郭下腹壁を開きます。 </li><li>鉗子で胸骨を持ち上げ、横隔膜をカットして、心臓を露出させる胸郭を切り取る。 </li><li>はさみで大静脈をカット。 </li><li>肺と肝臓が蒼白になるまで、左心室を通して10単位/ mLのヘパリンを含む生理食塩水で2〜3分間圧力を浸み込ませる（120 mmHgの）。 </li><li>首の皮膚をカットし、頸動脈が露出されるまで、すべての脂肪、筋肉、および結合組織を取り除く。 </li><li>解剖顕微鏡下でマウスを置きます。 </li><li>穿刺右第二灌流のための左頚動脈の結紮部位以下の穴。 </li><li>圧力は、左頸動脈がよくperusedていることを確認し、左心室を通して10単位/ mLのヘパリンを含む生理食塩水で〜1分間再灌流。 </li><li>微細な先端の鉗子と小さな春のはさみを使用して、慎重にcarotidsを取り巻く周囲の外膜の組織を削除します。この洗浄ステップ中にcarotidsを圧迫やストレッチをしないように注意してください。 </li><li>大動脈弓と頸動脈分岐部上記のライゲーションの点の間の左頸動脈を切断。 </li><li>右鎖骨下動脈の分岐点と頸動脈分岐部の間に右頸動脈を切断。 </li><li>氷冷HBSSを含む、35mmの培養皿にcarotidsを転送する。必要に応じて、慎重に残りの周囲の外膜組織を除去する。 </li><li>各頸動脈あたり150μlのQIAsolの溶解バッファー（Qiagen社）を充填して29グラム針とインスリンの注射器（3 / 10 mlの注射器）を準備する。 </li><li>慎重に頸動脈の一端に針の先端を挿入する。 </li><li>すぐに、頸動脈やピンセットで針の先端を保持している間（〜1秒）1.5mlチューブ（内膜の溶出液）にQIAsol溶解バッファー（150μl）をフラッシュする。 </li><li>頸動脈残り（メディア+外膜）一度HBSSで、1.5 mlチューブに入れ、そして液体窒素中でスナップ凍結をすすぐ。 </li><li>内膜の溶出液と凍結残ったが、製造元の指示に従ってmiRNeasyミニキット（QIAGEN）を用いて内膜またはメディア+外膜RNAの分離に使用されます。 </li></ol> 4。代表的な結果： 我々は部分的に結紮マウス左頸動脈超音波検査は、手順に従って一日行った。図1に示すように、成功した部分的なライゲーションは、血流速度を低減し、心拡張期に左総頸動脈の流れ（乱流）を逆にします。高脂肪食を伴うアポEノックアウト（KO）マウスの部分的なライゲーションは、2週間（図2）で、左総頸動脈の動脈（LCA）ではなく、反対側の右の頸動脈で堅牢なアテローム性動脈硬化症を誘発する。 - SMA（図3）などの中膜平滑筋細胞マーカー遺伝子のフリーながら頸動脈内膜から採取したRNAは、そのようなPECAM - 1などの内皮マーカー遺伝子が含まれています。 <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：頸動脈解剖学とライゲーションの回路図： 上甲状腺動脈（STA）が開いたままで左総頸動脈の三枝（LCA）[外頸動脈（ECA）、内頸動脈（ICA）、および後頭動脈（OA）]は、連結した。 <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：超音波画像は、流れの速度プロファイルを示し、拡張期の間にLCAに（矢印で示される）部分的なライゲーションが流れの反転を引き起こすことが明らかになった。 RCAの流れは、ライゲーションした後も変更されずに残る。 <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：部分的ライゲーションと高脂肪食は急速にアポKOマウスのLCAでアテローム性動脈硬化症を誘発アポKOマウスでは、部分的に連結し、1〜3週間の高脂肪食を与えられた。 LCAから凍結切片をオイルレッドOで染色した。 <img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4内膜RNA調製の方法。内膜RNAと内側+外膜（mは+ A）RNAをC57BL / 6マウスに偽手術RCAとLCAから得られた。 RNAはPECAM - 1とα- SMAは、内部コントロールとして18秒を使用するための半定量的RT - PCR（A）と定量PCR（B、C）により分析した。バーグラフは± SEM、n = 3の平均値です。

<ol><li>Korshunov, V. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+vascular+remodeling+in+the+mouse%3A+a+model+for+carotid+intima-media+thickening%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).</li>
<li>Sullivan, C. J., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+remodeling+in+the+carotid+artery+of+fibroblast+growth+factor-2+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).</li>
<li>Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).</li>
</ol>

この手順では、外頸動脈、内頸動脈、後頭動脈と上甲状腺動脈を含む、総頸動脈のすべての支店の適切な識別が不可欠です。示すように超音波を使用してフローのパターンを検証することも重要です。当社の経験豊富な手で、500以上のマウスの超音波の研究に基づいて部分的な結紮手術の私達の成功率は90％よりも優れています。頸動脈内膜RNA調製には、まず血流のステップの後に頸動脈の出現に​​注意を払うことが重要です。この時点では左総頸動脈の流れの閉塞の証拠がある場合は、我々は、さらなる分析のためにこれらのサンプルを使用しないことをお勧め。

<table><tbody><tr><td>生理食塩水 (0.9% sodium chloride)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>インスリン用注射器 (3/10 ml 29g syringe)</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Cellgro</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit (QIAzolを含む)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 高解像度マイクロイメージングシステム</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>a.Visualsonics 770 system b.イメージングステージ c.Vevo統合レールシステム d.マウス用RMVスキャンヘッド</td><td>または同等のシステム</td></tr><tr><td>6-0 シルク縫合糸、滅菌済み</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>小剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5675</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>解剖用ピンセット</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr></tbody></table>

部分的ライゲーションによるマウス頸動脈における乱流誘発アテローム性動脈硬化症と頸動脈内皮からのrna単離の方法における簡便な方法のモデル

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

よく知られている密接な関係にもかかわらず、アテローム発生する乱流を結ぶ直接的な証拠が欠けていた。我々は最近、急性マウス頸動脈に、、乱流の2つの重要な特性を低くし、振動流の条件を誘導することを示すために頸動脈部分的ライゲーション法[1,2]の修正版を使用している。このモデルを使用して、我々は、乱流が実際にアポEノックアウトマウスで迅速かつ堅牢なアテローム性動脈硬化症の開発[3]を導くことを示す直接的な証拠を提供している。我々はまた、マウス頸動脈内膜からの高純度を持つ内皮RNA調製の方法[3]を開発した。このマウスモデルと方法を使用して、我々は、その部分的なライゲーションが4週間でこのようなintraplaque血管新生などの複雑病変形成の機能と共に高脂血症のマウスモデルでの二週間で、堅牢かつ迅速なアテローム形成に続いて、週に内皮機能障害を引き起こすが見つかりました。この急速な<em&gt; in vivoで</em&gt;モデルと内皮RNAの調製法は、血管生物学と疾患の流量依存性の調節の分子メカニズムを決定するために使用することができる。また、それが大幅に削減研究期間における内皮機能障害とアテローム性動脈硬化症をターゲットとする様々な治療的介入をテストするために使用することができる。

これは、マウスの総頚動脈のintraplaque新血管形成（4週間）と（二週間で）乱流の条件とその後のアテローム性動脈硬化症の発展の原因となる部分的な頸動脈結紮術を、説明します。我々はまた、高純度内皮RNAを提供する、頸動脈内膜からのRNA分離の新しい方法を説明します。

部分的ライゲーションによるマウス頸動脈における乱流誘発アテローム性動脈硬化症と頸動脈内皮からのRNA単離の方法における簡便な方法のモデル

密接な関連があることはよく知られているが、乱れた血流がアテローム形成に結びついているという直接的な証拠は不足していた。我々は最近、改変した...を使用した。

このビデオでは、麻酔をかけたマウスにおいて外頸動脈、内頸動脈、および後頭動脈を結紮し、血流の乱れを誘導してその後の急速な動脈硬化発症を促す、部分的頸動脈結紮術について解説します。手術の成功は超音波検査で確認し、その後、安楽死させたマウスから結紮側および対照側の頸動脈を採取して、高純度の内皮細胞RNAを得ます。こんにちは。ジョー研究室、ジョージア工科大学およびエモリー大学の生物医学工学・循環器部門のダグ・ナです。こんにちは、Amir Revanです。JO Labに所属しています。ライゲーションの超音波確認について実演します。そして、私はChiで、同じくJO Labに所属しています。本日は、内部RNAの調製について実演します。部分頸動脈結紮の手順、超音波検査、結紮の確認、および詳細なRNA単離方法について解説します。当研究室では、この手順を用いて、せん断応力が動脈硬化に及ぼす影響を研究しています。それでは始めましょう。この手順を開始する前に、ケタミンおよびキシラジンによって誘導された麻酔の深さを確認します。8週齢のマウスにおいて、足指へのつまみ刺激により確認してください。マウスを外科手術台の上に腹臥位で配置し、4つの肢を手のひらが上を向くようにして台にテープで固定します。次に、後肢を足底が下になるようにテープで固定します。マウスの首に緩衝材としてガーゼを当てます。続いて、下顎と胸骨の間の頸部に除毛剤を十分量塗布します。すべての毛が除去されるまで、その部位を優しくマッサージします。綿棒を使用して、除毛剤を拭き取ります。その後、小さく鋭利なハサミを使用して、Betadineを十分に塗布します。動物の頚部中央に4〜6 mmの垂直切開を加え、皮膚と下層の筋膜の両方を切開します。解剖用ピンセットを使用して、左頸動脈腺を正中線から動物の左側へゆっくりと移動させます。解剖用ピンセットを用いて、組織を鈍的に剥離します。拍動する総頸動脈を露出させます。総頸動脈を慎重に追跡し、分岐点を特定します。分叉部を慎重に剥離し、以下の部位を露出させます。左総頸動脈の4つの遠位枝である、外頸動脈、内頸動脈、後頭動脈、および上甲状腺動脈です。これらの血管、特に上甲状腺動脈は非常に脆弱である場合があります。1組の鉗子を上甲状蓋動脈より上の外頸動脈の下に通し、別の鉗子で保持している6-0シルク縫合糸を1インチの長さで掴みます。縫合糸をゆっくりと引き、動脈の下に通過させます。周囲の組織を巻き込まないように注意しながら、外頸動脈をしっかりと結紮します。同様の手法を用いて、内頸動脈と後頭動脈をシングルノットで結紮します。縫合位置と上甲状腺動脈の開通性を目視で確認した後、耳下腺を戻し、皮膚を接合させ、組織用鉗子を用いて皮膚を閉鎖します。手術後、マウスが回復するまで保温チャンバーに入れて安置します。通常30〜

a-model-disturbed-flow-induced-atherosclerosis-mouse-carotid-artery

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

この記事で紹介した収縮カフは、ネズミの総頸動脈のアテローム性動脈硬化症を誘発するように設計されています。その内腔の円錐形状に起因する移植されたカフは、種々の炎症性表現型のアテローム性動脈硬化病変の開発をトリガする、低、高と振動せん断応力の明確に定義された領域を生成します。...

マウスでのせん断応力誘発アテローム性動脈硬化症をトリガするための頸動脈カフの注入

マウス頸動脈内ステント移植のモデルが記載されている。他の同様の方法に比べて、この手順が異なる薬剤溶出ステントおよび再狭窄の分子機構に対する血管壁の反応便利な方法で勉強する可能性を提供し、非常に、迅速かつ簡単にアクセスできます。...

再狭窄の研究のための頸動脈内ステント留置のマウスモデル

私たちは、マウスの大腿動脈にワイヤー損傷を引き起こして新内膜の過形成を誘発する外科的技術について説明し、再狭窄を阻害するための治療化合物の血管周囲送達のモデル試験システムとして機能します。...

血管周囲ドラッグデリバリーパッチの移植に大腿動脈ワイヤ傷害のマウスモデル

本研究は、マウスにおける加速アテローム性動脈硬化の誘導のための侵襲的処置を説明する。電気またはクライオによる傷害を用いた他の方法と比較して、機械的誘発傷害は、再血管化療法後の修復の人間の状態を模倣し、関係する分子機構の研究に理想的である。...

マウスにおける加速アテローム性動脈硬化症の誘導:ワイヤー傷害モデル

動脈裸出損傷後の再内皮の細胞および分子メカニズムを理解することは、動脈の血栓症および再狭窄を予防する上で極めて重要です。ここでは、下腹部大動脈の再現性動脈裸出損傷のためのプロトコルについて説明します。手順は、マウスモデルを使用して、内皮の再生を制御する機序を研究するために開発されました。...

マウスモデルにおける下腹部大動脈クランプすることにより、再現性動脈侵食に起因けが

我々は、1細胞オミクス実験を行うために、安定したまたは乱れた流動条件にさらされたマウス頸動脈の内腔から内皮細胞および核を単離する方法を提示する。...

シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離

本プロトコールは、圧力過負荷心肥大を誘発するマウスにおける大動脈バンディングの新しい技術を記載する。バンディングには、内径が固定されたゴムリングが使用されます。この新しい手法は、将来の実験のために分散が少なく、再現性の高いデータを約束します。...

圧力過負荷誘発心肥大をモデル化するためのOリング大動脈バンディングと従来の横大動脈狭窄の比較

ここでは、マウス頸動脈の単一細胞懸濁液を調製するための2段階の細胞消化プロトコルについて説明します。...

シングルセルシーケンシングのためのマウス頸動脈からのシングルセル懸濁液の調製

本プロトコルは、マウスモデルにおける頸動脈瘤を1回の外科手術による誘発のための標準化された外科的方法を説明しています。...

頸動脈瘤形成のマウスモデル

本研究はマウスの動脈で止血を達成する効果的な方法の開発を目指しています。...

マウス動脈の止血のための簡単かつ効果的な手順

学ぶマウス頸動脈部分結紮術による乱流誘発アテローム性動脈硬化症モデルと高純度内皮RNA単離法。超音波検証と迅速な動脈硬化進行観察が可能です。

部分的ライゲーションによるマウス頸動脈における乱流誘発アテローム性動脈硬化症と頸動脈内皮からのRNA単離の方法における簡便な方法のモデル

さらに動画を探す