Name: 細菌細胞の電子Cryotomography (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶ電子クライオトモグラフィーによる細菌細胞の3次元構造解析。急速凍結と高圧凍結を用いたサンプル調製法と、投影画像からの3D再構成手法を解説します。分子レベルの分解能で細菌の超微細構造を可視化する強力なイメージング技術です。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細菌細胞のECTを行う方法我々は、このビデオの記事で示しています。空間と時間によって制限さ、我々は一般的なプロトコルを示しています。詳細は論文、機器やソフトウェア開発者の製造、及びECTの研究グループからで提供されるオンラインまたはその他の情報で見つけることができます。勉強異なる細菌種に応じて、使用する機器および細胞内の構造的な関心は、プロトコルや実験パラメータは、テストおよび最適化する必要があります。

<table><tbody><tr><td>ポリ-L-リシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>0.1%溶液</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金コロイド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Nr 1 ろ紙</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, MW 39000</td></tr><tr><td>真鍮製ドームプランシェ</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal-Tec HPm 010 高圧凍結機</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultra マイクロトーム UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond cryo trim 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Static line II イオナイザー</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX100 ドライシッパー</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSH ローディングステーション</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E/B 倒立顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>カスタム仕様</td></tr><tr><td>Cryo LM ステージ</td><td>FEI</td><td></td><td>カスタム仕様</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Gatan製UltraCam搭載</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細菌細胞の電子cryotomography

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

多くはすでに細菌細胞の基本的な代謝について知られている一方で、多くの基本的な疑問は、彼らが生成して管理、特定のセルの形状を、極性の確立、それらのゲノムを分離し、分割の仕方例えば含め、依然として驚くほど未解決のです。これらの現象を理解するために、イメージング技術は、蛍光光学顕微鏡やX線結晶解析とNMR分光法などの高解像度のメソッド間のブリッジ解像度のギャップいることが必要である。 電子cryotomography（ECT）は、細胞の超微細構造は&quot;高分子&quot;の解像度（〜4nm）で、三次元（3D）で、ネイティブに近い状態で視覚化できるように、ちょうどこの行う新しい技術です。1、2でECT、細胞を低温でクライオ透過型電子顕微鏡（cryoTEM）で&quot;凍結水和した&quot;状態、硝子体に結像されている（&lt;-180 ° C）。細長い細胞（最大厚さ3〜500nmである）の場合は、無傷の細胞は、プランジ凍結などエタンまたはエタン/プロパン混合物として寒剤でEMグリッド全体でメディア内にある。厚い細胞とバイオフィルムはまた、最初の&quot;高圧凍結&quot;により、硝子体の状態で撮像することとし、それらを&quot;クライオは、セクショニング&quot;することができます。それは段階的に1つまたは2つの軸に沿って傾いているとして、二次元投影画像のシリーズは、サンプルによって収集されています。三次元再構成、または&quot;断層像は、&quot;その後の画像から計算することができます。 ECTは、高価な計測機器が必要になりますが、近年では、それは様々な外部付属、異なるセルの封筒、細胞骨格フィラメントの位置と構造、および場所の構造や大規模な高分子のアーキテクチャの構造を明らかにするためにいくつかのラボで使用されていますこのような鞭毛モーター、内部コンパートメントと化学受容器の配列としてアセンブリ。1、2 このビデオの記事では、セグメンテーションを介して、光学顕微鏡でいくつかのケースの相関における試料調製のプロセス、データの収集、断層像の再構築、および結果の解釈を含め、ECTによる画像セル、する方法を示します。

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、&quot;高分子&quot;（〜4 nm）の解像度に、ここに示しています。

細菌細胞の電子Cryotomography

細菌細胞の基礎的な代謝についてはすでに多くのことが分かっていますが、依然として驚くほど多くの根本的な疑問が未解決のままであり、それには...などが含まれます。

このビデオでは、電子クライオトモグラフィーを用いて、分子解像度でほぼ天然状態にある細菌細胞の3D画像を生成します。これは、まず無傷の細胞をプランジ凍結させるか、あるいは細胞ペレットを高圧凍結させてクライオセクショニングを行うことで達成されます。一連のM枚の投影画像を取得して3D再構成（トモグラム）を生成し、それをセグメンテーションしてさらに計算解析にかけます。こんにちは。カリフォルニア工科大学生物学部のグラント・ジェンセンです。そして、こちらのプレゼンテーションをまとめてくれたソニア・チェンです。本日は、細菌細胞のクライオ電子トモグラフィーの手法について解説します。通常、一連の手順は一人の研究者が行いますが、私たちのプロトコルは共同での経験を通じて開発されたものであるため、現在ラボで研究に従事している全員に参加してもらいます。ビデオに登場するソニャと私に加えて、Megan Dobro、Ariana、Bri、Miguel、Alistair McDowell、mark Rodinsky、そしてJenが登場します。彼女らを含む他の研究室メンバーのMorgan Bebe、Martin Piller、Jane Ding、Joe Lee、Lou GaN、Aliza Tova、Dylan Morrisが、コンピュータ画面のキャプチャ作成および付随する書面プロトコルの準備を支援しました。まずはArianaが、細菌細胞をプランジ凍結させる方法について説明します。薄い細菌細胞の場合、未破壊細胞の懸濁液をEMグリッド上でプランジ凍結します。ここでは、市販の自動プランジ凍結機を用いたプロセスを実演します。まず、細菌培養物を検査し、汚染がないこと、および適切なコンフルエンスまたは濃度であることを確認します。カーボンコートEMグリッドを2〜4分間グロー放電処理します。次に、100 µLのコロイド金溶液と25 µLの5% BSA溶液を混合します。混合物を18,000 Gで15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、金のペレットを再懸濁させます。20 µLの細胞溶液を用い、湿度100%に設定したVitra botにEMグリッドを設置します。次に、細胞混合液4 µLをグロー放電処理したEMグリッドに滴下します。フィルターペーパーを用いてグリッドの両面から余分な液体を自動的にブロッティングした後、液体窒素で冷却したエタンとプロパンの混合液中に急速にプランジさせます。グリッドをエタン・プロパン混合液から慎重に取り出し、液体窒素下で保管されているグリッド保管ボックスに速やかに移します。細胞が厚い場合は、高圧凍結を行うことで氷結晶の形成を防ぎます。その後、凍結切片を作成して試料をEMに適した薄さにします。イメージングは、15 mLの細胞を1000 RPMで3分間遠心分離することから始めます。遠心分離後、上澄みを除去し、残った培養ペレット0.5 mLに20%デキストリン凍結保護剤0.5 mLを加えて混合します。その後、再度13,000 RPMで15秒間遠心分離します。細胞をペレット化した後、上清を除去し、ペレットペースト0.1 milliliterを、あらかじめ0.2 millilitersの20%dextrin凍結保護剤を入れた熱封印済みのマイクロピペットチップにピペッティングします。マイクロピペットチップ内の混合物を13,000 RBMで30秒間遠心分離します。遠心分離後、上澄み液を除去します。密封されたチップの先端に、5〜10 µLの密なペレットが確認できます。このペーストを、高圧凍結固定装置のホルダーアームにすでに装着されているテフロンコーティングされた真鍮製ドームプランシェットの半分に転写し、対となる平らな真鍮製ハットで密封します。その後、速やかにアームアセンブリを準備済みの高圧凍結機に挿入します。2100 barの圧力下で、細胞を含む真鍮製プランシェユニットが、高圧液体窒素ジェットによって急速に冷却されます。細胞の冷却後、速やかにアームアセンブリを取り出し、プランシェの温度上昇を防ぐため、すぐに液体窒素バスに浸してください。次に、凍結した細胞ドームを切り出しやすくするため、プランシェットをクライオミクロトームチャンバー内にしっかりと固定された、あらかじめ冷却したクライオミクロトーム用バイス型チャックに移します。2枚の真鍮製プランシェを液体窒素中で慎重に分離させます。完全に凍結した細胞ドームは、外観がガラス状で、ひび割れや氷結晶による裂け目がない状態になります。クライオミクロトームを用い、ダイヤモンドトリミングツールと高速セクショニング速度を使用して、外側のドーム領域を0.2 square millimeters未満に成形します。この際、低角ナイフと銅製サポートグリッドに帯電防止スプレーを吹き付けながら、約200 micrometerの深さを維持します。ダイヤモンドナイフを研磨済みのブロック面まで、約0.4 millimeters per secondの切削速度と狭い切削ウィンドウを用いて慎重に接近させます。その後、50 to 350 nanometerの厚さでセクショニングを開始します。細いアイラッシュアプリケーターを操作して、切片の初期部分を慎重にすくい上げ、低角ダイヤモンドナイフのエッジから滑らせながら、銅製グリッドサポート上で切片のリボンを支持し、誘導します。グリッドへの載置が完了したら、冷却した研磨済みシルバープローブを使用して、リボンをしっかりと押し付けます。顕微鏡の準備が整うまで、グリッドをグリッドボックスに入れ、液体窒素冷却ドライシッパーで保存します。グリッド上の細菌細胞は、クライオ光学顕微鏡を用いて観察することができます。ここでは、改造されたFEIクライオステージを備えたカスタム仕様のNikon倒立顕微鏡（TIB）を使用します。クライオステーションでグリッドをカートリッジにロードし、銅製クリップリングで固定した後、転送用にカートリッジを液体窒素中のチューブに入れます。最大2本のカートリッジを予冷したクライオステージにロードし、グリッドを観察窓まで移動させます。次に、集束レンズを下げ、対物レンズをグリッドにfocusable（フォーカス）させます。細胞を探し、画像を撮影します。相関LMおよびEM研究のためです。後にEMで細胞を特定できるよう、細胞の周囲領域でグリッドをスキャンします。グリッドのイメージング後、カートリッジをチューブに戻し、細菌細胞の3D TOMをEMで取得するまで、チューブを液体窒素中に保存してください。ここでは、クライオTEMを用いて試料を1方向または2方向の軸に沿って段階的に傾斜させながら、一連の投影画像を撮影します。この手順は、cryo T-E-M-F-E-I-T-F 30 polarを用いて実演します。まず、クライオステーション上のマルチセレクションホルダーに最大6つのカートリッジをロードします。次に、それをTF 30 Polarに接続し、カートリッジを1つ選択してEMカラムに挿入します。EMコンピューター上のクライアントソフトウェアでlegendを起動します。セッションのレジェンドに入力用画像条件を入力します。低倍率の画像からターゲットを選択し、より高倍率の次のステップへ送ります。その後、ティルトシリーズ収集のためにすべてのターゲットをキューに入れ、最終的なトモグラフィー・ステップにすべて送信します。一連の画像を収集します。クライオTEM内で、試料を1軸または2軸に沿って段階的に傾斜させます。実験終了後、完了したチルトシリーズをローカルワークステーションにダウンロードし、再構成を行います。細菌細胞のトモグラムは、専用のソフトウェアを用いて算出されます。トモグラムの自動再構成にはRaptorというプログラムが使用され、半自動的に行う場合にはe tomoが利用可能です。IMODの3D mod viewerを用いてティルトシリーズを確認し、トラッキングなどのエラーにより再構成が困難と思われるものは除外してください。標準的な設定を用いて、ラボ内のLinuxマシンに分散してtommo raptorを実行します。トモグラムの生成には、ファイルのサイズに応じて20分から2時間かかります。Raptorで失敗した場合や、研究者が再構成を最適にしたい場合には、EMOを使用して手動で慎重に画像をアラインメントすることができます。e tomo GUIの各タブの手順に従い、傾斜シリーズからトモグラムを再構成します。トモグラフィデータの整理、保存、検索、および配布には、ウェブベースの社内データベースを使用します。メインの閲覧ページには、サムネイル画像と、YouTubeのような形式の特集動画が表示されます。それぞれのトモグラムについて。トモグラムが得られた後、個々の構造をセグメンテーションすることで、その形状の可視化に役立てることができます。3Dセグメンテーションとは、3D画像の各ボクセルを特定の領域または物質に割り当てるプロセスです。ここでは、各領域を異なる色で表示した表面モデルを生成するためにミラーソフトウェアが使用され、トモグラムの3D動画やアニメーションで表示されます。プロジェクトを要約したり、知見を3Dグラフィックスで図示したりするためのグラハムを作成できます。動画やコマーシャルの個々の静止フレームをレンダリングするには、AmiraやKymeraなどのソフトウェアが使用できます。Adobe Premierなどの動画編集ソフトウェアを使用して、プロモーション用動画を編集することができます。アニメーションの生成にはMayaを使用します。Amiraからサーフェスデータを取り込み、キーフレームを設定して動画としてレンダリングすることが可能です。ここでは、Spiro Treponema Promesaの全細胞データの代表的なティルトシリーズを示し、続いて再構成されたトモグラムのスライスごとのビューを示します。T Promesa細胞のセグメンテーションにより、外膜、内膜、および表面ボウルや表面フックアーケードを含む表面構造が区別されます。この細菌は、鞭毛と極モーター、ペリプラズムコーン、およびピリを備えています。この機械モデルは、スピロヘータの一種であるtreponema Promesaがどのように泳ぐかを示しており、内側のシリンダー（コア）が外鞘に包まれています。鞭毛は内側シリンダーと外鞘の間でペイントローラーのように動きます。鞭毛が回転すると、内側シリンダーが外鞘の中で逆方向に回転します。粘性のない環境では、細胞は空回りしますが、T. Promesaが自然界で生息するような粘性環境では、外部の繊維やその他の物体が外鞘の回転に抵抗します。これにより内筒の回転が加速され、細胞が前方へ掘り進む際に押し付けることができる材料が提供されます。ここに示されているのは、光学顕微鏡で観察された実際のT. promeus細胞です。ここまでで、細菌細胞の電子クライオトモグラフィーの手法について説明しました。もちろん、この種の研究には多額の投資が必要であることは承知しています。クライオ電子顕微鏡や蛍光顕微鏡は高度で高価な設備であり、適切な設置環境も不可欠です。例えば、この室の基礎は、特別に締め固められた地盤の上に、厚さ数フィートの機械的に隔離されたコンクリートスラブが敷かれています。空調システムも、ドラフトや乱流のない一定の温度を維持できるよう、大きなダクトと緩やかな曲線を用いてカスタム設計されています。設置されているカーテンは、音響ノイズを低減するためのものです。そして最後に、この部屋に干渉する電磁場がないことを確認します。顕微鏡で行うこれらの操作は現在、その大部分が自動化されていますが、依然として問題が頻繁に発生し、専門家による診断が必要となります。それでも、この動画をご覧いただくことで、この種の研究における手順や使用機器への理解を深めていただけたことを願っております。ご視聴ありがとうございました。

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細菌細胞の電子Cryotomography

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