細菌細胞の電子Cryotomography

このビデオでは、電子クライオトモグラフィーによって、分子分解能でほぼ天然の状態にある細菌細胞の3D画像が生成されます。これは、最初に無傷の細胞をプランジ凍結するか、あるいは細胞ペレットを高圧凍結して凍結切片化することによって達成されます。一連のM投影画像が取得され、3D再構成、またはトム・グラハムを生成するために使用されます。これはセグメント化され、さらに計算によって分析されます。

こんにちは、カリフォルニア工科大学生物学部のグラント・ジェンセンと申します、こちらはプレゼンテーションを企画したソーニャ・チェンです。今日は、細菌細胞の電子クライオトモグラフィーの方法をご紹介します。通常、1人の個人がすべての手順を行いますが、私たちのプロトコルは共有された経験を通じて開発されているため、現在ラボで働いているすべての人が含まれます。

ビデオにはソーニャと私に加えて、ミーガン・ドブロ、アリアナ、ブリ、ミゲル、アリステア・マクダウェル、マーク・ロディンスキー、ジェンが出演しています。彼女の他の研究室メンバーは、コンピューターの画面キャプチャを作成し、Morgan Bebe、Martin Piller、Jane Ding、Joe Lee、Lou GaN、Aliza Tova、Dylan Morrisなどの付随する書面によるプロトコルの準備を支援しました。アリアナは、凍結細菌細胞を急降下させる方法を示すことから始めます。

薄い細菌細胞の場合、無傷の細胞の懸濁液はEMグリッドを横切って凍結されます。ここでは、市販の自動プランジ冷凍庫を使用して、まず細菌培養物を調べて汚染物質がないことを確認し、適切な合流点または濃度でカーボンコーティングされたEMグリッドを2〜4分間グロー放電するプロセスを実証します。次に、100マイクロリットルの金コロイド溶液と25マイクロリットルの5%BSA溶液を混合します。

混合物を18, 000 Gで15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を取り除き、金ペレットを再懸濁します。20マイクロリットルのセル溶液に、EMグリッドをVitraボットに湿度100%で配置します。

次に、4マイクロリットルのセル混合物をグロー放電EMグリッドに適用します。グリッドの両面を濾紙で自動的に濾過し、余分な液体を取り除いた後、エタンとプロパンの液体混合物に急速に浸漬し、液体窒素で冷却します。エタンプロパン混合物からグリッドを慎重に取り出し、液体窒素の下に保管されたグリッドストレージボックスにすばやく移します 厚いセルの場合、高圧凍結により氷の結晶化が防止されます。

その後のクライオセクショニングにより、サンプルはemに十分な薄さになります。イメージングは、15 mLの細胞を1000 RPMで3分間遠心分離することから始まります。遠心分離後、上清を0.5ミリリットルの残りの培養ペレットと0.5ミリリットルの20%デキストリン凍結保護剤と混合して取り出します。

その後、13, 000 RPMで再び遠心分離機を15秒間遠心分離します。細胞がペレット化された後、スーパーペレットペーストの上清ピペット0.1ミリリットルを、すでに0.2ミリリットルの20%デキストリン凍結保護剤遠心分離機が含まれているヒートシールマイクロピペットチップに移します。マイクロピペットチップ内の混合物を13, 000 RBMで30秒間。

スピン後、上清を取り除きます。密封された先端に5〜10マイクロリットルのタイトペレットが見られます。ペーストを、高圧冷凍庫ホルダーアームにすでに取り付けられているテフロンコーティングされた真鍮ドーム型プランシェの半分のドームに移し、次にフラットパートナーの真鍮帽子で密封します。

次に、アームアセンブリをプライミングされた高圧冷凍庫にすぐに挿入します。2100バールの圧力で、セルを含む真鍮製のプランシュユニットは、高圧液体窒素のジェットによって急速に冷却されます。細胞が冷却された後、アームアセンブリを迅速に取り外し、プランシェットが温まるのを防ぐために液体窒素の浴にすばやく突っ

次に、プランシェットをクライオミクロトームチャンバーにしっかりと取り付けられた予冷クライオミクロトームバイス様チャックに移し、切片化のために細胞のよく凍結したドームを露出させます。2つの真鍮のプランチは、液体窒素の下で慎重に分離されています。完全に凍結した細胞のドームは、外観がガラス状で、亀裂や氷の核形成亀裂がありません。

クライオミクロトームを使用して、ローアングルナイフと銅サポートグリッドに向けられた帯電防止スプレーで、迅速なセクショニング速度保持と約200マイクロメートルの深さを持つダイヤモンドトリミングツールを使用して、外側のドーム領域を0.2平方ミリメートル未満に成形します。近接して、ダイヤモンドナイフを毎秒約0.4ミリメートルの切断速度と狭い切断窓を使用して、研磨されたブロック面まで慎重に進めます。厚さ50〜350ナノメートルのスライスの切片化を開始します。

細いまつげアプリケーターを操作して、初期のセクションを引っ掛け、ローアングルダイヤモンドナイフエッジから滑り落ち、銅グリッドサポート全体でセクションのリボンを支えてガイドします。グリッドがロードされたら、冷却された研磨されたシルバープローブを使用してリボンをしっかりと押します。グリッドボックス内のグリッドは、顕微鏡の準備ができるまで液体窒素冷却乾燥シッパーに保管します。

グリッド上の細菌細胞は、クライオ光学顕微鏡を使用してイメージングできます。ここでは、カスタムのニコン倒立顕微鏡、TIBとFEIクライオステージの改造を使用します。グリッドをクライオステーションのカートリッジにロードし、銅製のクリップリングを使用してクリップで留めてから、カートリッジを液体窒素のチューブに入れて転送します。

最大2つのカートリッジを予冷クライオステージにロードし、グリッドを表示ウィンドウに移動します。次に、コンデンサーレンズを下げ、対物レンズをグリッドに焦点を合わせます。セルを見つけて画像を撮ります。

LMとEMの相関研究用。グリッドは、後でemでセルを見つけるために、セルの領域の周りをスキャンします。グリッドをイメージングした後、カートリッジをチューブに戻し、EMでイメージングする準備ができるまでチューブを液体窒素に入れたままにして、細菌細胞の3D TOMを取得します。

ここでは、クライオTEMでサンプルを1つまたは2つのEに沿って徐々に傾けながら、一連の投影画像を撮影し、その手順は、クライオステーションのマルチセレクションホルダーに最大6つのカートリッジをロードするクライオT-E-M-F-E-I-T-F 30極性負荷を備えたレゴンを使用して示されています。次に、TF 30 Polar Select one カートリッジに接続し、EM カラムに挿入します。EMコンピューター上のクライアントソフトウェアで凡例を起動します。

セッション上の凡例のイメージ条件を入力します。画像上のターゲットを最も低い倍率から選択し、より高い倍率で次のステップに送ります。次に、チルトシリーズ収集のすべてのターゲットをキューに入れ、それらすべてを最終断層撮影ステップに送信します。

一連の画像を取得します。サンプルは、クライオTEMの1つまたは2つの軸に沿って徐々に傾けられます。実験が完了したら、完成した傾斜シリーズをローカルワークステーションにダウンロードして再構築します。

細菌細胞のTomo Grahamsは、専用のソフトウェアを使用して計算されます。プログラムRaptorはTomsを自動的に再構築するために使用され、e tomoはそれを半自動的に行うために使用することができます。Im MODの3D modビューアを使用してチルトシリーズを検査し、トラッキングやその他のエラーが原因で発生する可能性が低いものは破棄します。

優れた tommo raptor は、基本設定を使用してラボ内の Linux マシンに分散して実行されます。断層撮影を生成するには、ファイルのサイズに応じて20分から2時間かかります。Raptorが故障した場合、または調査員が再構築が最適であることを確認したい場合は、EMOを使用して、手作業で画像を慎重に位置合わせできます。

e tomo GUIの各タブの手順に従って、TiltシリーズのTom Grahamを再構築します。Webベースの社内データベースを使用して、店舗検索を整理し、断層撮影データを配布します。メインのブラウジングページには、サムネイル画像と注目のYouTubeのような映画が表示されます。

各トモグラハムのために。Tommo、Grahams を取得した後、個々のフィーチャをセグメント化して、その形状を視覚化できます。3Dセグメンテーションでは、3D画像の各vleを特定の領域または材料に割り当てるプロセスです。

ここでは、ミラーソフトウェアを使用して、各領域が異なる色で表示され、tomoの3Dムービーやアニメーションで表示されるサーフェスモデルが生成されます。グラハムは、プロジェクトを要約し、調査結果を 3D グラフィックスで説明するために作成できます。表現。AmiraやKymeraなどのソフトウェアを使用して、映画やコマーシャルの個々の静止フレームをレンダリングできます。

Adobe Premierなどの動画編集ソフトを使って、動画の商用ソフトを編集することができます。Maya はアニメーションの生成に使用されます。Amiraからサーフェスを取得し、キーフレームを作成してムービーにレンダリングできます。

ここでは、Spiro Treponema Promesaの全細胞データの代表的な傾斜シリーズが示され、続いて再構築されたTom Agramのスライスごとのビューが示されています。T Promesa細胞のセグメンテーションは、その外膜、内膜、および表面ボウルや表面フックアーケードを含む表面構造を区別します。細菌はべん毛と尿神経運動、プラズマ円錐体周囲、およびピライです。

この機械モデルは、スピロヘータトレポネーマPromesaがどのように泳ぎ、内側のシリンダーまたはコアが外側のシースで囲まれているかを示しています。べん毛は、内側のシリンダーと外側のシースの間をペイントローラーのように動きます。べん毛が回転すると、内側のシリンダーカウンターが外側のシース内で回転します。

非粘性環境では、細胞は無駄に回転しますが、自然界にTプロメサが見られるような粘性のある環境では、外部繊維やその他の物体が外側の鞘の回転に抵抗し、内側の円柱の回転を加速し、細胞が前方にドリルで穴を開けるときに押すことができる材料を提供します。ここに示されているのは、光学顕微鏡で観察した実際のTプロメウス細胞です。細菌細胞の電子クライオトモグラフィーの方法をお見せしました。

もちろん、この種の仕事には大きな投資が必要であることは承知しています。クライオ電子顕微鏡や蛍光顕微鏡は洗練され、高価であり、それらも適切に引用する必要があります。たとえば、この部屋の基礎は、機械的に隔離されたコンクリートのスラブで、厚さは数フィートで、特別に圧縮された地面に置かれています。

また、空調システムも大きなダクトと緩やかなカーブでカスタム設計されており、ドラフトや乱流がなく、一定の温度を維持しています。見えるカーテンは、音響ノイズを減らすために配置されています。そして最後に、この部屋に干渉する電磁場がないことを確認します。

顕微鏡で紹介した操作は、現在では大部分が自動化されていますが、依然として頻繁に問題が発生し、専門家による診断が必要です。それでも、この映画を見て、この種の作業に関連する手順と機器を理解するのに役立つことを願っています。ご清聴ありがとうございました。