大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

ゼブラフィッシュは、強力なとして浮上している

次の実験の全体的な目標は、胚発生と生理学の重要な側面を特異的に調節する小分子を発見することです。これは、第2のステップとしてプレートをスクリーニングしながら、多数の受精卵を96に入れることによって達成されます。小分子のライブラリーのアリコートは、96ウェルプレートの次の胚に96ウェルプレートに加えられる。

ウェルプレートは、低分子によって誘発される表現型について検査されます。どの小分子がスーパーフィッシュの発達や生理機能に特異的に影響を与えるかを示す結果が得られます。こんにちは、ヴァンダービルト大学医学部のチャールズ・ホンと申します。

当研究室では、ダイフィッシュの胚を用いたハイスループットケミカルスクリーニングを行っています。これは比較的簡単な手法であり、新規の生理活性化合物の発見に広く適応できます。ケミカルスクリーニング日の前日の午後に、ゼブラフィッシュの飼育水槽を10〜20個設置します。

各タンクに仕切りを置き、魚網を使用して、養殖システムから各タンクに水を入れます。魚網は、1匹の成魚と1〜2匹の成魚メスを内部コンテナに移します。各繁殖水槽で、水槽にラベルを貼り、画面の朝に蓋をします。飼育タンクから仕切りを取り外し、ゼブラフィッシュが交尾するのを待ちます。

次の1時間の間に。受精卵が各内部コンテナの下部にあるグリッドを通って落ちるのを待ちます。1時間後、成魚を常設貯蔵タンクに戻します。

内部の容器を取り外し、プラスチック製の茶こし器を介して各繁殖タンクの水を濾して卵を収集します。ストレーナーをペトリ皿の上でひっくり返し、ストレーナーをやさしくすすぎ、卵をペトリ皿に洗い流します。E 3培地を含む洗浄ボトルを使用することにより、不透明に見えるすべての未受精卵を取り除く必要があります。

使い捨てのプラスチックピペットを使用して、各交配クロスは約200個の胚を産出する必要があります。次に、ガラスパスターピペットを使用して、E 3培地中の約5つの胚を96ウェルプレートの各ウェルに移します。胚を96ウェルプレートに配列すると。

12チャンネルピペットを使用して、できるだけ多くのE 3培地をウェルから取り出します。胚に穴を開けないように注意してください。12チャンネルピペットを使用して、250マイクロリットルのEスリーを配送します。

ミリリットルあたり0.5マイクログラムを含む培地は、胚が乾燥しないように、できるだけ早く各ウェルにマイシンすることができます。96ウェルプレートを摂氏28.5度のインキュベーターに、化合物を添加する目的の段階に達するまで入れます。このプロトコルでは、初期の胚のパターン形成を乱す化合物を探し、3時間または1000細胞段階が達成されるまで、胚の90%以上が通常供給される胚のインキュベー

各化合物を10ミリモルストックとしてDMSOに保存した96ウェルソースプレートで、胚が所望の段階に達する約60分前に、低分子のアリコートを含む適切な数の96ウェルプレートを解凍する。プレートの結露を最小限に抑えるために、ソースプレートのシリアル番号またはその他の識別番号に注意してください。乾燥機が入った乾燥室に落ちます。右。

マルチウェルプレートアダプターを装備した卓上型遠心分離機でプレートを短時間スピンダウンします。12チャンネルピペットを使用してソースプレートからアルミニウム天井テープをはがし、ソースプレート内の化合物をDMSOで目的の濃度に希釈します。このプロトコルでは、0.5ミリモルの最終濃度を使用し、4.75マイクロリットルのDMSOを添加して10ミリモルのストックプレートを希釈します。

96ウェルプレートの胚が目的の段階に到達したら、12チャンネルピペットを使用して、ソースプレートから2.5マイクロリットルの化合物を胚を含むレシピエントプレートに移します。胚と化合物が入っているプレートを蓋で覆い、胚プレートにソースプレートの識別番号を記録します。プレートを静かに渦巻かせて混合し、摂氏28.5度のインキュベーターに入れます。

未使用の小分子を含む各ソースプレートをアルミニウム製の天井、テープで覆い、マイナス80°Cの冷凍庫に入れて長期保存します。ビジュアルスクリーンを実行する前に、特定のヒット基準を定式化します。例えば、4つの脳の低分子阻害剤のスクリーニングでは、前脳の喪失を示唆する化合物がヒットする可能性があります。

目がないことは、前脳の喪失を視覚的に容易に示す指標であり、発生中の所望の時期にアッセイするために蛍光を必要としません。インキュベーターから化合物処理された胚を含む96ウェルプレートを取り出し、4つのブレインの低分子阻害剤をスクリーニングする際に実体顕微鏡で各ウェルを検査し、4つのブレインニンの発生阻害のマーカーとして眼の喪失について28時間でプレートを検査します。5つの胚のうち少なくとも3つが所定のhi表現型を示すウェルのプレートとウェル位置の同一性を記録します96ウェルプレートをインキュベーターに戻します。

48時間後に目と前脳の喪失を再確認します。胚には前脳がありませんが、少なくとも4日間は生き残ります。各用量について数用量で化合物の効果を再試験することにより、潜在的なヒットを再確認し、10個の胚を0.5ミリリットルのEスリー培地中で48ウェルプレート形式で試験する。

再試験のためのコンパウンドエディションのタイミングは、元のスクリーニングのタイミングと同じである必要があります。HIIT は、誘発された表現型が化合物の再試験で用量依存的に再現された場合に確認されます。最後に、化学ライブラリーの低分子のデータベースからhi化合物を同定します。

ゼブラフィッシュを用いた視覚的化学スクリーニングを用いて、体軸への影響に基づく低分子ヘッジホッグシグナル阻害剤を発見しました。この画像は、ハリネズミ阻害剤に曝露された胚が尾の顕著な腹側湾曲を示している。24時間後、48時間後に検査された同じ胚は、依然として腹側に湾曲した表現型を示しています。

この画像は、ヘッジホッグ経路変異体胚と比較した化合物処理胚を示しています。この技術を習得すれば、1人で週に約400種類の化合物をわずか数時間でスクリーニングできるようになります。この技術は、化学生物学者が細胞発生、細胞シグナル伝達経路、胚発生などを研究する道も開いた。

特性評価されていない低分子を扱う場合、これらの特性評価されていない分子は潜在的に危険である可能性があるため、適切な安全使用の白衣と手袋を用意することが重要です。