Name: 大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュを用いた大規模in vivo小分子スクリーニング法。96ウェルプレートでDanio rerio胚に化合物を処理し、発生・生理への影響を評価する。創薬研究や発生生物学への応用が期待される。

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1）ゼブラフィッシュの卵コレクション<ol><li>前化学画面の日に午後に、10〜20ゼブラフィッシュの繁殖タンクを設置。水産養殖システムから水を各タンクを埋める。魚のネットを使用して、それぞれの繁殖水槽の内側の容器に大人一人の男性と一から二成人女性を転送する。分圧器を使用して、お互いからオスとメスの魚を区切ります。ケージにラベルを付け、それらの上に蓋をする。 </li><li>画面の朝に、繁殖タンクから仕切りを削除し、チームメイトへのゼブラフィッシュができます。次の1時間のコースで、受精卵がそれぞれ内側の容器の下部にグリッドフォールスルーすることができます。 </li><li> 1時間後、、永久的な貯蔵タンクに大人のゼブラフィッシュを戻す内側のコンテナを削除し、プラスチック製の茶こしを通して各飼育槽内の水に負担をかけることにより卵を集める。 </li><li>ペトリ皿上のストレーナーを反転し、E3培地を含む洗浄瓶を使用してペトリ皿に卵をフラッシュするように優しくストレーナーをすすいでください。 </li><li>不透明な表示されるすべての未受精卵は、、使い捨てのプラスチック製のピペットを使用して削除する必要があります。各交配のクロスは、約200胚が得られるはず。 </li></ol> 2）96ウェルプレートで胚をアレー<ol><li>ガラスパスツールピペットを用いて96ウェルプレートの各ウェルにE3培地で5胚についての転送。 </li><li>穿刺に胚を気にしないながら、ピペット - 一度胚は同じくらいの12チャンネル（300μL30）を用いて井戸の可能な外としてE3培地のを削除し、96ウェルプレートに配列される。 12チャンネルピペットを使用して、そのような胚が干上がることがないようにしても、できるだけ早く各0.5μg/mlカナマイシンを含むE3培地250μLを提供。 </li><li>化合物を添加するときに必要な段階に達するまで、28.5 ° Cのインキュベーターに96 - ウェルプレートを置く。 </li></ol> 3）小分子ライブラリーの移転は、 化合物の転送がロボットの転送方法を自動化することができますが、我々は、手動転送方法を説明します。 <ol><li>小分子ライブラリーは、典型的には10 mMストックとしてDMSOに格納された各化合物を、96ウェルフォーマットで供給されます。化合物が追加されるときに胚がステージに到達する約60分前に、小分子のアリコート（ソースプレート）を含む96ウェルプレートの希望番号を解凍。ソースプレートのシリアルまたはその他の識別番号をメモしておいてください。プレート上の結露を最小限に抑えるために、融解はDRIERITEを（ワシントン州ハモンドDRIERITE CO、セニア、オハイオ州）を含む乾燥室内で発生する可能性があります。 </li><li>簡単に言うと、マルチウェルプレートアダプタを搭載した卓上型遠心機のプレートをスピンダウン。 </li><li>ソースプレートからアルミシールテープを取り外します。 12チャンネルピペットを使用して、0.5mMの濃度（例えば、10mmの株式250 NLのアリコートで始まる場合、各ウェルにDMSO 4.75μLを加える）にソースプレート内の化合物を希釈する。 </li><li> 96ウェルプレート（受信者のプレート）の胚は、含まれている受信者のプレートにソースプレートから化合物（0.5）の2.5μLを転送するために、12チャンネル（2-20μL）ピペットを使用して、必要な段階に到達したとき胚。 </li><li>レシピエント胚のプレート上にソースプレートの識別番号を記録します。今蓋つきの胚と化合物を含む受信者のプレートをカバーし、穏やかに穏やかに渦巻くことでプレートを混合し、28.5 ° Cのインキュベーターに置いてください。 </li><li>長期保存のため-80℃の冷凍庫にアルミシールテープと場所で使用されていない小分子（0.5 mm）を含む各ソースプレートをカバーしています。 </li></ol>表現型の目視検査による低分子の効果4）スクリーニング<ol><li>画面を実行する前に、&quot;ヒット&quot;を構成するであろう何のために特定の基準を策定する。 </li><li>開発の目的の時間に、インキュベーターから化合物で処理した胚を含む96ウェルプレートを取り出して、実体顕微鏡下で各ウェルを調べます。このような循環パターンの変化などの微妙な変化、のよりよい視覚化のために、位相差倒立顕微鏡を使用することができます。蛍光顕微鏡は、組織特異的プロモーター下にGFPまたはDsRedタンパク質の発現の摂動を調べるために使用することができます。 </li><li>すぐに5胚の内少なくとも3つの任意ウェルの96ウェルプレートは、所定の&quot;ヒット&quot;表現型を示すスキャンします。プレートの識別と各潜在的なヒットのも場所を記録します。 </li><li>いくつかの投与量（1μMの、5μmの、10μMおよび50μM）における化合物の効果を再検査することにより、潜在的なヒットを再確認する。各用量については、10胚を48ウェルプレートフォーマットでのE3メディアの0.5mlにテストされています。再試験のための化合物の添加時期は、オリジナルのスクリーニングのと同じである必要があります。引き出した表現型がcompounの再検査で再現されたときにヒットが確認されD </li><li>化学ライブラリー内の小分子のデータベースからヒット化合物を識別する。 </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ゼブラフィッシュベースの化学スクリーンを計画する場合は、特に注意が検討中の表現型とそのような表現型のバックグラウンドレートの堅牢性に注意する必要があります。これは、誘導表現型の化学的抑制のためのスクリーンのために特に重要です。例えば、導入遺伝子の熱ショック誘導による表現型のため、表現型を誘導する条件は、再現性良く正確に容認できないほど高い偽陽性率を避けるために画面を開始する前からマップする必要があります。綿密な計画で、ささやかな設備投資を必要とゼブラフィッシュの化学物質の画面では、細胞シグナル伝達および生理学の新たな変調器の発見につながるだけでなく、ヒト疾患のモデルを反転させる化合物を導くことができる。最後に、古典的な前進遺伝子スクリーニングの類推によって、ゼブラフィッシュベースの化学物質の画面では、基本的な生物学的プロセスの化学遺伝学的解剖のために役立つことがあります。

<ol><li>目的の遺伝子型の大人のゼブラフィッシュの20組の最小値。 </li><li>取り外し可能なインナーコンテナと仕切り（水生生息地）と魚網、繁殖タンク、。 </li><li>ペトリ皿（10センチ）。 </li><li>プラスチック製の茶こし。 </li><li>ボトルcontaing胚の水を洗浄してください。 </li><li>使い捨てポリエチレン転送ピペット。 </li><li>ポリスチレン96穴丸底アッセイプレート（コーニングCOSTAR、ローウェル、マサチューセッツ州）。 </li><li>ガラスパスツールピペット（フィッシャーサイエンティフィック）。 </li><li>手動ピペットポンプ、10 mLの（ベルアート製品、ペクアノック、NJ）。 </li><li> E3胚の培地：0.003％PTUを（フェニルチオ-カルバミド、シグマ、セントルイス、MO）を含有する5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMのCaCl 2を 、0.33 mMのMgSO 4を 、。 PTUは、E3胚の培地1 Lに0.3 - gオプションPTUを溶解することにより10倍の溶液として調製することができます。 PTUを含む溶液をアルミホイルで覆うことにより、光から保護する必要があります。 </li><li> 12チャンネルピペット、20から20μL（エッペンドルフ）。 </li><li> 12チャンネルピペット、300〜300μL（エッペンドルフ）。 </li><li>使い捨てポリスチレンピペット流域、50 mLの（フィッシャーサイエンティフィック）。 </li><li> DMSO中の10mMストックで96 - WLL形式に配列された構造的に多様な化合物の小分子ライブラリ。各マスタープレートは96ウェルポリプロピレンストレージプレート（コーニング）に分注し、-80℃で使用時まで保存されます。 </li><li> 96ウェルプレート（Nunc、ロチェスター、ニューヨーク州）のためのアルミシールテープ。 </li><li> DMSO（シグマ、セントルイス、MO）。 </li><li>基本的なインキュベーター、28.5 ° C（フィッシャーサイエンティフィック）。 </li><li>透過光のベース（ライカマイクロシステムズ、バノックバーン、イリノイ州）と実体顕微鏡。 </li></ol>

大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

彼らの小さな胚の大​​きさ、急速な発展、透明性、繁殖力、そして哺乳類に多数の分子、形態学的および生理学的類似性を考えると、ゼブラフィッシュは、強力なとして浮上している<em&gt; in vivoで</em表現ベースの薬剤の画面と化学遺伝学的解析のための&gt;プラットフォーム。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚を用いた小分子の大規模スクリーニングのためのシンプルで実用的な方法を示しています。

ゼブラフィッシュは、強力なとして浮上している<em&gt; in vivoで</em表現ベースの薬剤の画面と化学遺伝学的解析のための&gt;プラットフォーム。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚を用いた小分子の大規模スクリーニングのためのシンプルで実用的な方法を示しています。

胚のサイズが小さく、発生が速いこと、透明であること、産卵数が多いこと、そして...との分子標的、形態学的および生理学的な類似性が数多くあることから、

本実験の全体的な目的は、胚発生および生理学的機能の重要な側面を特異的に調節する低分子化合物を探索することです。これは、まず多数の受精卵を96ウェルプレートに配置し、次にスクリーニングを行うことで達成されます。低分子化合物ライブラリーの分注液を、プレート内の胚に添加します。ウェルプレートを用いて、低分子化合物によって誘発された表現型を検討します。これにより、どの低分子化合物がスーパーフィッシュの発達または生理機能に特異的に影響を与えるかという結果が得られます。こんにちは、ヴァンダービルト大学医学部のチャールズ・ホンです。当研究室では、ゼブラフィッシュの胚を用いてハイスループット化学スクリーニングを行っています。これは比較的容易な手法であり、新規の生理活性化合物を探索するために幅広く応用することが可能です。化学スクリーニング実施日の前日の午後に、10〜20個のゼブラフィッシュ繁殖水槽を準備します。各水槽に仕切り板を設置し、魚用ネットを用いて養殖システムから水を取り込み、各水槽を満たします。その後、成体オス1匹と成体メス1〜2匹を内部容器に入れます。繁殖に使用する各水槽にラベルを貼り、スクリーニングの朝に蓋をします。繁殖水槽から仕切り板を取り除き、ゼブラフィッシュを交配させます。その後1時間かけて、受精卵が各内部容器の底にあるグリッドから落下するようにします。1時間後、成魚のゼブラフィッシュを恒久的な保管タンクに戻します。内部容器を取り出し、各繁殖タンクの水をプラスチック製ティーストレーナーで濾して卵を回収します。ストレーナーをペトリ皿の上で逆さまにし、静かにすすいで卵をペトリ皿の中に流し込みます。E three mediumが入った洗浄ボトルを使用して、不透明に見える未受精卵をすべて取り除きます。使い捨てプラスチックピペットを使用し、各交配から約200個の胚を得ます。次に、ガラスパスツールピペットを用いて、E3培地中の胚約5個を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。これで、胚が96ウェルプレートに配置されました。12チャンネルピペットを使用して、ウェルからE three培地を可能な限り除去します。その際、胚を傷つけないように注意してください。次に、12チャンネルピペットを用いて、E threeを250 µL分注します。胚が乾燥しないよう、可能な限り迅速に、0.5 µg/mLのカナマイシンを含む培地を各ウェルに加えます。化合物を添加する目的の段階に達するまで、96ウェルプレートを28.5 °Cのインキュベーターに入れます。本プロトコルでは、初期胚のパターン形成を乱す化合物を探索するため、胚を3時間、または胚の90%以上が1000細胞期に達するまでインキュベートします。低分子化合物ライブラリーは通常、提供されています。各化合物が10 millimolarのストックとしてDMSOに保存されている96ウェルソースプレートを用意し、胚が目的の段階に達する約60分前に、小分子の分注分を含む適切な数の96ウェルプレートを解凍します。プレートへの結露を最小限に抑えるため、ソースプレートのシリアル番号またはその他の識別番号を記録してください。乾燥剤を入れたデシケーター内で静置します。マルチウェルプレート用アダプターを備えた卓上遠心機で、プレートを短時間遠心します。12チャンネルピペットを用いて、ソースプレートからアルミシールを剥がします。ソースプレート内の化合物をDMSOで目的の濃度まで希釈します。本プロトコルでは、最終濃度を0.5 millimolarとし、10 millimolarのストックプレートに4.75 µLのDMSOを加えて希釈します。96ウェルプレート内の胚が目的の段階に達したら、12チャンネルピペットを使用して、ソースプレートから胚を含むレシピエントプレートへ化合物を2.5 µL分転移させます。胚と化合物が入ったプレートに蓋をし、胚プレートにソースプレートの識別番号を記録します。プレートを軽く回して混ぜ合わせ、28.5 °Cのインキュベーターに入れます。未使用の低分子化合物を含む各ソースプレートをアルミ箔で覆い、テープで固定して、長期保存のために-80 °Cのフリーザーに保管します。視覚的スクリーニングを実施する前に、具体的なヒット基準を策定します。例えば、脳の発達における低分子阻害剤のスクリーニングでは、前脳の消失をもたらす化合物ヒットとして定義することができます。眼の欠損は前脳喪失の容易な視覚的指標であり、発生の任意のタイミングで評価する際に蛍光を用いる必要がありません。化合物を処理した胚を含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、実体顕微鏡下で各ウェルを観察します。前脳発生の低分子阻害剤をスクリーニングする場合、前脳発生阻害のマーカーとして眼の欠損を確認するため、28時間後にプレートを観察してください。5個中3個以上の胚に規定の表現型が見られたウェルについて、プレートの識別番号とウェルの位置を記録します。その後、96ウェルプレートをインキュベーターに戻します。48時間後に、眼および前脳の消失を再確認します。胚に前脳は形成されませんが、少なくとも4日間は生存します。化合物を複数の用量で再試験し、ヒットの可能性を再確認します。各用量について、48ウェルプレートを用いて、0.5 mLのE3培地内で10個の胚をテストします。再試験のための化合物の調製タイミングは、初回スクリーニング時と同一にする必要があります。化合物の再試験において、得られた表現型が用量依存的に再現された場合に、HIITであると確定します。最後に、化学ライブラリーの小分子データベースから、当該のhi化合物を特定します。ゼブラフィッシュを用いた視覚的化学スクリーニングにより、体軸への影響に基づいた低分子ヘッジホッグシグナル阻害剤を発見しました。この画像は、ヘッジホッグ阻害剤に曝露され、尾部の顕著な腹側湾曲を示している胚を示しています。24時間後に観察したこれらの胚を48時間後に再確認したところ、依然として腹側湾曲の表現型を示していました。この画像は、化合物を処理した胚とヘッジホッグ経路変異体胚を比較したものです。この手法を習得すれば、1人で週に約400種類の化合物を、わずか数時間でスクリーニングすることが可能です。また、この手法により、化学生物学者が細胞分化、細胞シグナル伝達経路、および胚発生などを研究する道が開かれました。未同定の低分子化合物を扱う際は、これらの分子が潜在的に有害である可能性があるため、白衣と手袋などの適切な安全装備を着用することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。...

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

この記事では、ゼブラフィッシュの胚を化学的毒性スクリーニングに使用しています。化学的毒性は、表現型の読み出しと相関しています。サンプルプロトコルは、化学的毒性スクリーニングを実施するための方法論的アプローチを示しています。...

胚ベースの化学毒性スクリーニング:ゼブラフィッシュ胚の発生に対する影響の評価

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。...

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。...

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生過程とモデルヒト疾患を研究するための優れた実験的な生物である。ここでは、読み出しをホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）とゼブラフィッシュ胚で手動ハイスループット化学画面を実行する方法についてのプロトコルを記述します。...

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

ゼブラフィッシュは、遺伝学および発生研究のための優れたモデルシステムです。ビーズ移植は、局所的な細胞環境の変化を導入することにより、発生メカニズムを調査するために使用できる貴重な組織操作技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚にマイクロビーズ移植を行う方法について説明します。...

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

ゼブラフィッシュ胚は、化学化合物の毒性を評価するために使用されます。それらは外部で発達し、化学物質に敏感であり、微妙な形知らずの変化の検出を可能にする。実験は少量の化合物しか必要としないが、これは胚を含むプレートに直接添加され、試験システムを効率的かつ費用対効果の高い方法にする。...

ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価

ゼブラフィッシュ異種移植片モデルは、生体内微小環境におけるヒト癌細胞のハイスループット薬物スクリーニングおよび蛍光イメージングを可能にする。当社は、自動蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットを用いて、ゼブラフィッシュにおける患者由来白血病サンプルに対する大規模な自動薬物スクリーニングのワークフローを開発しました。...

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

このプロトコルは、受精後3〜7日のゼブラフィッシュの幼生における薬物スクリーニング手順と、それに続く形態学的評価を説明しています。...

初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験

RASopathyiesは、RAS-MAPK経路の過剰活性化によって引き起こされる多系統遺伝性症候群です。検証を待っている潜在的に病原性の多様体が次々と出現する一方で、前臨床のエビデンスが乏しいため治療が制限されています。ここでは、Teen-reporter ZebrafishのライブFRETイメージングにより、RASopathy関連ERK活性化レベルとその薬理学的調節を胚発生時に試験および交差検証するためのin...

ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

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大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

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