大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

本実験の総合的な目的は、胚の発達および生理学的な重要側面を特異的に調節する低分子化合物を探索することです。これは、まず多数の受精卵を96ウェルプレートに配置し、次いでスクリーニングを行うことで達成されます。低分子化合物ライブラリの分注液を、96ウェルプレート内の胚に添加します。

ウェルプレートを観察し、低分子化合物によって誘導される表現型を確認します。これにより、どの低分子化合物がスーパーフィッシュの発達または生理機能に特異的に影響を与えるかという結果が得られます。こんにちは、ヴァンダービルト大学医学部のCharles Hongです。

当研究室では、ゼブラフィッシュの胚を用いてハイスループット化学スクリーニングを行っています。これは比較的簡便な手法であり、新規の生理活性化合物を探索するために幅広く応用することが可能です。化学スクリーニング実施日の前日の午後に、10〜20個のゼブラフィッシュ繁殖タンクを準備します。

各タンクに仕切り板を設置し、魚用ネットを用いて、成体オス1匹と成体メス1〜2匹を内側容器に入れ、水産養殖システムからの水で各タンクを満たします。それぞれの繁殖タンクにラベルを貼り、スクリーニングの朝に蓋をします。繁殖タンクから仕切り板を取り除き、ゼブラフィッシュを交配させます。

その後1時間にかけて、受精卵を各インナーコンテナ底部のグリッドから落下させます。1時間後、成体のゼブラフィッシュを恒久的な飼育水槽に戻します。

内側のコンテナを取り出し、各繁殖タンクの水をプラスチック製ティー・ストレーナーで漉して卵を回収します。ストレーナーをペトリ皿の上で逆さまにし、優しくすすいで卵をペトリ皿の中に洗い出します。E3培地を入れた洗浄ボトルを用いて、不透明に見える未受精卵をすべて取り除きます。

使い捨てプラスチックピペットを使用し、各交配組み合わせから約200個の胚を得ます。次に、ガラスパステルピペットを用いて、E3培地中の胚を約5個ずつ96ウェルプレートの各ウェルに転移させます。これで、胚が96ウェルプレートに配置されました。

12チャンネルピペットを使用して、ウェルからE three培地を可能な限り除去します。この際、胚を傷つけないよう注意してください。次に、12チャンネルピペットを用いて、E threeを250 µL分注します。

胚が乾燥しないよう、できるだけ速やかに各ウェルに0.5 µg/mLのカナマイシンを含む培地を添加します。化合物を追加する目的のステージに達するまで、96ウェルプレートを28.5 °Cのインキュベーターに入れます。本プロトコルでは、初期胚のパターニングを乱す化合物を探索するため、胚を3時間、または胚の90%以上が1000細胞期のステージに達するまでインキュベートします。低分子化合物ライブラリーは通常、このように提供されています。

各化合物が10 millimolarのストックとしてDMSOに保存されている96ウェルソースプレートを用意し、胚が目的のステージに達する約60分前に、低分子化合物の分注分を含む適切な数の96ウェルプレートを融解させます。プレートへの結露を最小限に抑えるため、ソースプレートのシリアル番号またはその他の識別番号を記録してください。乾燥剤の入ったデシケーター内で静置します。

マルチウェルプレート用アダプターを備えた卓上遠心機で、プレートを短時間遠心します。12チャンネルピペットを用いて、ソースプレートからアルミシールを剥がします。DMSOを用いて、ソースプレート内の化合物を目的の濃度に希釈します。本プロトコールでは、最終濃度を0.5 millimolarとし、10 millimolarのストックプレートに4.75 µLのDMSOを加えて希釈します。

96ウェルプレート内の胚が目的の段階に達したら、12チャンネルピペットを使用して、ソースプレートから2.5 µLの化合物を胚が入ったレシピエントプレートへ移します。胚と化合物が入ったプレートに蓋をし、胚プレートにソースプレートの識別番号を記録します。プレートを軽く円を描くように揺らして混ぜ合わせ、28.5 °Cのインキュベーターに入れます。

未使用のスモール分子を含む各ソースプレートをアルミ箔で密閉し、テープで固定して、長期保存のために-80°Cのフリーザーに保管します。ビジュアルスクリーンを実施する前に、具体的なヒット基準を策定してください。例えば、脳の発達を阻害するスモール分子阻害剤のスクリーニングでは、前脳の消失をもたらす化合物などをヒットと定義します。

眼の欠損は前脳喪失の容易な視覚的指標であり、発生の任意の時点で評価する際に蛍光標識を必要としません。化合物を処理した胚を含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、実体顕微鏡下で各ウェルを観察します。前脳発生の低分子阻害剤をスクリーニングする場合、前脳発生抑制のマーカーとして、28時間目に眼の欠損があるかプレートを観察してください。5個中3個以上の胚に規定の表現型が見られるウェルについて、プレートの識別番号とウェルの位置を記録します。その後、96ウェルプレートをインキュベーターに戻してください。

48時間後に、眼および前脳の消失を再確認します。胚に前脳は形成されませんが、少なくとも4日間は生存します。化合物の影響を複数の用量で再試験し、ヒットの可能性を再確認します。各用量につき10個の胚を、48ウェルプレートを用いて0.5 millilitersのE3 mediumでテストします。

再試験のための化合物の調製タイミングは、元のスクリーニング時と同一にする必要があります。化合物の再試験において、惹起された表現型が用量依存的に再現された場合、HIITであると確認されます。最後に、化学ライブラリーの低分子データベースから、当該のhi化合物を特定します。

ゼブラフィッシュを用いた視覚的な化学スクリーニングにより、体軸への影響に基づいてヘッジホグシグナル阻害剤となる低分子化合物を発見しました。この画像は、ヘッジホグ阻害剤に曝露され、尾部に顕著な腹側への湾曲を示す胚を示しています。24時間後に観察したこれらの胚を48時間後に再確認しても、依然として腹側湾曲の表現型を示しています。

この画像は、化合物を処理した胚とヘッジホッグ経路変異胚を比較したものです。この手法を習得すれば、1人で週に約400種類の化合物をわずか数時間でスクリーニングすることが可能です。また、この手法は、細胞分化、細胞シグナル伝達経路、胚発生などの研究を行うケミカルバイオロジストにとっても道を開くものとなりました。

特性が未解明の低分子化合物を扱う際は、これらの分子が潜在的に有害である可能性があるため、白衣や手袋を着用し、適切な安全対策を講じることが重要です。