Name: 設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化表皮ブドウ球菌とマイコバクテリウムmarinumの感染症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶ ゼブラフィス胚を用いた高スループット感染法で創薬を加速する手法。自動マイクロインジェクションとフローサイトメトリーにより、S. epidermidisやM. marinum感染の均一な解析が可能となる。

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我々はSで私たちを提供するためのレオニー·デ·ボーアとバZaat（アカデミックメディカルセンター）に感謝しています表皮のO-47株。私たちは、COPAS XLおよびVASTバイオイメージ解析分析のヘルプやアドバイスをリコボンガーツ、フランシス·スメットとアンジェラ·コマス（ユニオンBiometrica）に感謝。我々は有用な議論のためにライデン大学からデービー·デ·ウィット、ウルリケNehrdich、および魚の留守番用のローラ·バンヒュルスト、および他の同僚に感謝します。本研究では、生体材料研究所、オランダ経済省が共同出資の研究プログラムのプロジェクトP5.03 IBIZAの一部を形成し、経済のオランダ省のスマートミックスプログラム（NWOA_6QY9BM）のとのオランダ教育省、文化科学。追加のサポートは、EUのプロジェクトZF-ヘルス（FP7健康 - 2009から242048）から入手し、そしてRMJは、EU初期トレーニングネットワークFishForPharma（PITN-GA-201で経験研究者としてマリー·キュリー·フェローシップによってサポートされていました1から289209）。 SJRは、付与契約に基づいて革新的な医薬品イニシアティブ共同事業からの資金提供を受け、N 115337を°、親切contribution.The著者の欧州連合（EU）の第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）とEFPIA会社から資金拠出によって構成されているのリソースがさらに認めるロボット工学のためのライデン大学基金（LUF）からCyttronからの財政支援、ひいては財政的に画像化施設の科学研究費オランダ機構によってサポートされてBesluit補助金Investeringen Kennisinfrastructuurプログラム内。 COPASシステムの取得は、部分的に科学研究費オランダ機構（NWO、834.10.004）からの資金援助と地球と生命科学（ALW）のための部門によってサポートされていました。

1。細菌株および増殖条件<ol><li> Sを準備する表皮接種<ol><li> Sから、いくつかの個々のコロニーを取る表皮株O-47、pWVW189を含有する補充した25ミリリットルのLB培地中で37℃で一晩10μg/ mlのクロラムフェニコールと文化を補ったルリアベルターニ（LB）寒天プレートからmCherry発現ベクター（未発表デ·ボーアL.）に由来舞台を中間対数増殖する10μg/ mlのクロラムフェニコール。 </li><li> 1分間、12,000×gで、続いて培養物の遠心1mlを、それらを0.3％（v / v）のTween-80をながら1 mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄する。 </li><li> 600度（OD 600）での光学密度を測定し、PBS中の2％で0.3のOD 600に細菌懸濁液（w / v）ポリビニルピロリドン40（PVP 40）を希釈する。注：OD 600×10 8〜1.0に相当する0.3のコロニー単位/ ml（cfu / mlで）を形成する。 </li></ol&gt; </li><li> Mを準備するmarinumの接種<ol><li> Mから、いくつかの個々のコロニーを取る安定して10mlに28℃で一晩、10％（V / V）ミドルOADCを50μg/ mlのハイグロで補充濃縮および文化にミドル7H10寒天プレートからmCherry 10を表現pSMT3-mCherryベクターを含むマリナム菌株MまたはE11 50μg/ mlのハイグロを補足した10％（V / V）ミドルADC濃縮したミドル7H9ブロス。 </li><li> 1分間、12,000×gで、続いて培養物の遠心1mlを、それが0.3％（v / v）のTween-80を用いて1mlの滅菌PBSで3回洗浄する。 </li><li> OD 600を測定し、PBS中の（W / V）PVP 40 2％OD 0.3の600に細菌懸濁液を希釈。注：1のOD 600が 1.0×10 8 CFU / mlに相当する。 </li></ol></li></ol> 2。ゼブラフィッシュの卵を準備<ol><li> 70男性と50女性の野生のTYの最大値を置き大繁殖容器に別々にゼブラフィッシュをPE。注：大規模な繁殖容器の下部にメスの魚を置きます。 </li><li>ゼブラフィッシュは飼育を開始できるように、午前中に次の日のセパレータを削除します。 </li><li>卵の水（60μg/ mlのインスタント海洋海塩）で満たされた50ミリリットルチューブ内の卵のコレクタに大繁殖容器の底に卵を収集します。 </li></ol> 3。注射針<ol><li> 10μmの内径を有する市販のカスタムメイドのガラスキャピラリー針を取得します。 </li></ol>注射の4。実験概要<ol><li>約40ºCのまで、1％の100ミリリットル（w / v）の卵、水にアガロース、とクールを沸かす自動化されたmicroinjectorsプレートにアガロース注ぎ、アガロースに1024ウェルスタンプを配置します。注意：プレートを冷却するときに使用する準備ができています。 </li><li> 「校正段階」に自動化されたマイクロインジェクターオペレーティングソフトウェアをクリックしたときに、その後、&#39;1024 &#39;だけでなくグリッドをクリックして、マイクロインジェクターでアガロースプレートを置き、ウェルの中心位置に画面をクリックすることで、プレートのキャリブレーションを行います。 </li><li> 「針メニュー」に移動し、「校正針ホルダ」をクリックしてください。 </li><li> 100 CFU / NL Sを含む10μlのPVP 40のいずれかでmicroloaderチップを使用して注射針を埋める表皮または30 CFU / NL M.マリヌム 、または偽注射剤としてPVP 40を使用しています。 </li><li>自動化されたマイクロインジェクターに針を置き、下げたり、針を上に移動すると、針の位置で画面をクリックすることで、Y位置をXのキャリブレーションを行います。次いで、針の先端の位置で画面をクリックすることによって、針のz位置を較正する。 </li><li>プラスチック転送ピペットを用いてアガロース、グリッド上で卵を配布し、余分な卵の水を除去する。自動化されたマイクロインジェクターでアガロースグリッドを配置します。 </li><li> 「充血に行くNメニュー &#39;と調整」Femtojet設定メニューで、1 NLと相関する」200ヘクトパスカルに設定し、「射出圧力射出時間」0.2秒と「報酬圧力&#39; 15ヘクトパスカルを。 </li><li>プレート全体を注入するために「すべてを注入」をクリックします。 </li><li>ペトリ皿当たり70胚の最大で、ペトリ皿（92×16 mm）のにそれらを洗浄することによって、注入後に卵を収集し、28℃でインキュベート</li></ol> 5。フローサイトメーター解析<ol><li>製造業者の指示に従って大粒フローサイトメーターを調製し、卵の水と試料カップおよびシース液容器を充填する。 </li><li>オペレーティングソフトウェアでは、「PMT」メニューに移動し、以下の設定を使用します。「グリーン」と「イエロー」のチャネルに対して650「赤」チャネル用のVと0Vに。そして、「しきい値」メニューに移動し、以下の設定を使用します &#39;視神経をデブリの影響を低減するために、lの密度」閾値信号：975 mVの（COPAS XL値：50）および「320マイクロ秒（800 COPAS XL値）飛行時間」（TOF）最小。 </li><li>胚は、分析のために、5.4に進み、ソートやシャーレに胚をソート5.5または分析のためのステップに移動し、96ウェルプレートに胚をソートすることなく、分析のための5.6に進みます。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、分析を開始する「スタート」をクリックしてください。すべての胚を分析する場合は、「停止」をクリックして、分析を停止。 「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして保存されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、「並べ替え」メニューに70を入力することによってソートされるプレート当たり70胚の最大値を定義します。ソーターの下に空のペトリ皿を置き、「手動で並べ替え」をクリックしてください。ときはペトリディ<html> SHは満たされている、「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして格納されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>サンプルカップに胚を置き、「並べ替え」メニューで1を入力してソートするウェルあたり1胚の最大値を定義します。左プレートホルダーに空の96ウェルプレートを配置し、「プレート塗りつぶし」をクリックしてください。 96ウェルプレートがいっぱいになると、「すべてのストア」​​をクリックして、データを保存します。注：すべてのデータはTXT、LMD、DAT、CSVおよびBSRTファイルとして格納されます。ステップ5.7で、プロトコルに従ってください。 </li><li>ソートモジュール &#39;ステータスのソート」を使用して40を、もし：&#39;ステータスを選択し「次のデータのフィルタ設定を使用して、生データを処理するためにTXTファイルを入手してください。6その後「赤から全蛍光信号から番号を使用平均値と平均値の標準誤差を計算する」チャンネル。バーや散布グラフにこれらのデータセットをプロットします。 </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6。薬物療法<ol><li>分析し、並べ替えで3日間注射後（DPI）、M. marinumのは、大きな粒子流サイトメータ（工程5.5）を用いて二つの等しいグループ内の胚を感染させた。そのキャリア溶媒中で関心のある化合物と1グループを扱い、キャリア溶媒のみ（コントロール）を持つ他の。抗生物質の副作用をテストするために注入されたコントロールモックを作成する同様の処理を適用します。 </li><li> 4と5 dpiの分析（ステップ5.5）で繰り返して化合物を含有する卵の水または卵水をリフレッシュ。 </li></ol> 7。高分解能イメージング<ol><li> （w / v）の10分分析の前に、卵の水に3 - アミノ安息香酸エチルエステル（トリカイン）を緩衝0.02％で胚を麻酔。 </li><li>メーカーの指示に従って脊椎動物自動スクリーニング技術システムと大粒子サンプラーを準備します。 </li><li> 「イメージングから胚の時代に対応する参照画像を選択 - オブジェクト211;検出の設定」メニュー。 </li><li>メニュー - 「自動保存画像イメージング」から脊椎動物自動スクリーニング技術システムによってなされる写真の量と方向を選択します。 </li><li>大パーティクルサンプラの左プレートホルダーに（ステップ5.6から）の胚で満たさ96ウェルプレートを配置し、「実行プレート」をクリックしてください。 </li><li>胚が検出され、位置が合っていれば;画像ヘッドとCLSMは10X無地ドライ対物レンズを用いて、画像処理ソフトウェアを使用して、後で画像をパノラマで別々にテール。 </li></ol>

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</ol>

JSは、この記事で使用する楽器を作り出す生命科学の方法BVの所有者である。

このホワイトペーパーで説明した高スループットの方法論は、感染症のさまざまな種類の魚の胚および幼虫の多数をスクリーニングする迅速かつ費用対効果のパイプラインを提供しています。代わりに、伝統的な単一または家族繁殖タンクの大繁殖容器を使用すると、生成されているプロセスの制御および同期の卵より多数の生成を容易にした。自動化されたマイクロインジェクション装置7の改良版では、1時間以内に同一の細胞の段階でほぼ全て2,500個もの卵を注入することができる。これらの更新及び改良されたソフトウェアを使用してそれを読み出すなどの細菌増殖に大きな薬物スクリーニングを行うために使用することができ、以前可能であったよりも多くの卵を注入することが可能である。しかし、この方法は依然として注射、ベナードセルらにより記載され、例えば、他の注射経路を卵黄に限定される。 （2012）6、願わくは近い将来に自動化されたマイクロインジェクション装置に組み込まれます。 &lt;これらのメソッドは、ゼブラフィッシュをスクリーニングするためにベンチマークされていますが、Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;、それは同様に他の魚種とするアプリケーションのために有用であろう。例えば、コイ、薬物スクリーニングのための利点を有することが示されている。ゼブラフィッシュのように、コイの卵や初期段階の胚は透明ますが、その大きな卵の卵の百何千もの大きさと、より一定の遺伝的背景16を提供する近交系の可用性の主な利点である。 感染した胚の大量の分析は、ハイスループット大粒フローサイトメーターを用いて行われる。このデバイスは、ソート、マルチウェルプレートまたは多数の化合物を試験するためには特に適してペトリ皿に胚を分析することができる。セットアップが技術サイトメーター大きな粒子流が予備スクリーニングするために使用し、続いて媒体を介して、サンプルを分析することができるような方法で適合されているよりも高い撮像分解能が必要な場合高い解像度で置く。これは、脊椎動物の自動スクリーニング技術17,18を用いて行うことができる。このデバイスは、自動的にマルチウェルプレートまたはバルクコンテナ、画像CLSMまたはステレオ顕微鏡法を用いて、毛細管を通して360度から2〜7日後に受精の間、ライブまたは固定胚を収集し、ベースの胚の手選別を可能2バルクコンテナに再処分することができます顕微鏡画像上。将来の改善は、CLSMで経時的に個々の胚を自動的多数をスクリーニングすることがことが可能となる、マルチウエルプレートに結像した後、胚の選別を可能にする。将来の用途において脊椎動物自動スクリーニング技術のシステムはまた、マルチウェルプレートに分配前の幼虫の技術を必要とせずにサイトメーター大きな粒子流に接続することができると仮定すると、より高度な並べ替えにつながる。 本論文では、確立ANを説明S.を研究するための高スループット·セットアップのD最適化表皮とM.創薬のためのモデルとしてmarinumの感染症。それは、卵黄に注入されたこれらの細菌の結果は、注射時の卵の発達段階に依存していることを示しています。 Mを注入する16-64細胞期の16から128細胞期またはM株のマリヌム E11が尾静脈注射2、6と同じ感染パターンにつながる。しかしながら、このセットアップでのみ細菌性病原体の増殖に限定されるものではない。それはロボットでそれぞれ13、過剰発現および遺伝子ノックダウン研究を形質転換するためのDNA、RNAまたはモルホリノを含有する溶液を注入することが可能であることが以前に示された。さらに、このセットアップはまた、癌細胞の増殖および遊走を研究するために有用であることが示された。したがって、このパイプラインは、コンテキスト内の信号の様々なメカニズムのハイスループットスクリーニングのための汎用的な方法を提示し自然免疫の、感染症および癌の開発に適用。これらの画面は、薬剤発見のための他のユーザーにも適用可能な薬剤の同定可能な毒性効果の分析と組み合わせることができる。

現在までにゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が正常に感染症1の様々な研究する効率的なモデルとして確立されている。ゼブラフィッシュ胚は、その透明性及び蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック既存のレポーター株の多数のインビボイメージングの可能性に固有の提供。この強力な組み合わせは、 マイコバクテリウムmarinumの、M.最も近い相対などの病原体と相互作用しつつ、即座に別の免疫細胞タイプを追跡することを可能にする結核2、または表皮ブドウ球菌 、生体材料関連感染3-5の主な原因となる。感染の異なる経路は、試験6の目的に応じて、ゼブラフィッシュ胚において使用することができる。 これらの感染経路の一つは、細菌の卵黄注射である。他の人に比べてこの方法の主な利点は、卵黄infectiです上では有意に噴射時間を短縮し、感染7,8の高い再現性を可能にする、ロボット注射を介して自動的に行うことができる。 前作、Sの研究のための生体モデル系において 、高スループットなどのゼブラフィッシュを用いて、 表皮とM. marinumの感染は7,8成功したことを示した。このシステムは、初期胚の卵黄ロボット注射を介して疾患の進行をスクリーニングすることが可能であり、細菌負荷の尺度として蛍光読み出しを使用する。この概念と一致して、このセットアップでは、最適化され、均質に感染した胚を大量に生成し、多くの化合物で処理した後の時間の間、感染の進行を追跡する可能性を秘めた非常に効率的な高スループットパイプラインを確立した。確立された設定で、それは画面に8000同期胚まで発生させることができる病気の進行のために、時間あたり2,500胚まで、このように処理。胚は、感染した幼虫の均質なグループを確保し、自動化されたシステムを使用して、細菌の負荷に基づいて並べ替えられています。さらに、セットアップを検証するために、哺乳動物における結核の進行を防ぐために、既知の基準の影響は、M.に感染した胚でテストされていますマリヌム E11株以上の病原性のM株9。 本研究では、詳細に開発中に、化合物処理後に、感染した胚および細菌の進行のその後の分析を大量に生成することができるように確立されたハイスループット·パイプラインを記述する。

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H10 agar</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>L5542</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>L3022</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td><td>16785.03</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td><td>25966.01</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>P1754</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone40</td><td>Calbiochem, San Diego, California, USA</td><td>529504</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td> <td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td><td>S103</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Instant ocean sea salt</td><td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td><td>5460</td><td></td></tr><tr><td>iSPAWN</td><td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td><td>iSPAWN</td><td></td></tr><tr><td>自動マイクロインジェクションシステム</td><td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td><td>自動マイクロインジェクションシステム</td><td></td></tr><tr><td>複素粒子分析装置およびソーター XL (COPAS XL)</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>COPAS XL</td><td></td></tr><tr><td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>VAST BioImager</td><td></td></tr><tr><td>LP Sampler</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>LP Sampler</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザースキャン顕微鏡</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Injection needle 10 & micro;m 内径</td><td>Qvotek, ミシサガ, カナダ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

ゼブラフィッシュは、ハイスループットスクリーニングの可能性と全体の動物モデルとして、創薬スクリーニングの前臨床段階での貴重なツールになりつつあります。彼らは、このようにして、還元、はるかに高価なげっ歯類モデルでのテストを通過する多数の化合物を初期段階での哺乳動物モデルにおけるインビボの検証における細胞ベースのアッセイの間のギャップを埋めるために使用することができる。この観点から、現在の原稿に表皮ブドウ球菌およびマイコバクテリウムmarinumの感染症の研究のためのin vivoモデル系としてゼブラフィッシュを使用して、新しい高スループットパイプラインを説明している。このセットアップでは、同期胚の多数の生成と解析が均一に感染したことができます。また、パイプラインの柔軟性により、ユーザは必要なときに容易に分析の分解能を改善するための他のプラットフォームを実装することができます。一緒に革新的な高スループットTEでゼブラフィッシュの組み合わせchnologiesために全動物モデルを用いての強度だけでなく、ために新規化合物の作用様式を解読するために使用することができる利用可能なトランスジェニック系統の多数だけでなく、新たな可能性への薬物検査と発見の分野を開く。

本結果は、高スループット·パイプラインはS.を研究することを示す表皮とM. marinumの感染は正常に確立されており、それは、他の感染モデルに拡張することができる。まず、Adatto らによって公開システムに基づいて大規模な飼育容器（ 図1A）、（2011）11の使用は、生成されているプロセスの高い制御を与える一つのイベントに同期の卵を大量に生成することができます。以前に開発された自動化されたマイクロインジェクションシステム7の改良版は、（ 図1A）を使用し、短時間で多数の胚を注入することができることが急ぎ。卵黄の感染のための最高の発達段階でロバ、Sと注射へ表皮とM. marinumのはキンメルらによって行われた説明によれば、1〜512細胞期の間のすべての異なる段階で実施した。（1995）12 </suP&gt;。 100 CFU Sに注射表皮は、16〜128細胞期の間の最良の感染パターン（ 図2）を得た。細菌は3日間、卵黄の中に増殖し、以降3解像度から体内に広がった。 256細胞期胚の体内に広がってほとんどの細菌と卵黄の中に、主に細菌の成長を示した後16細胞期の前に注射を行うことにより、4 DPI、および射出から高い死亡率につながった。細菌負荷の定量はベネマンらによって記載されるように、大きな粒子がフローサイトメーターを用いた蛍光強度分析により行った。（2013）8（ 図3）。 観測は30 CFU Mの注入のための最適な発達段階あることを示したマリヌム注入はE11株（ 図4A）のために、より毒性の強い男straiで16-64細胞期間16から128細胞期の間にあるN（ 図4B）。これらの段階で注入した胚は卵黄の中に細菌の増殖を示し、胚（ 図7）を介して細菌の広がり。早い段階での両株の感染は4 dpiの後に死ぬために胚をリードする非特異的な一般化された細菌の増殖を発表した。一方、後の段階で注入した胚で細菌量は卵黄に限定されていた。 次に、大きな粒子との事前ソート（ 図1B）フローサイトメーターは、非または高度感染した胚（ 図5A及び6A）を除いた、感染した魚を大量に均質なグループを生成した。事前ソートした後、M. marinumの感染した胚を、リファンピシン、最初のラインの抗結核薬で処理した。これまでの研究では、200μMの用量のリファンピシンによる治療が効果的にMを減少させることを実証しゼブラフィッシュ7、13 マリナム感染。 advantagを取っハイスループット設定で生成均質に感染した胚の大多数の電子は、異なる用量での処置を行った。 M.に感染した胚M marinumの株および12,24、および200μMリファンピシンで48時間処理は、用量依存的に（ 図5B）で効率的にマイコバクテリア感染を低減することが示された。この濃度は、将来の実験のために使用した200μMの用量でリファンピシンを用いて、感染の効率的な低減の点で好ましい。前の結果に沿って、Mを使用して細菌負荷の進行を研究マリヌム E11株を大幅に削減、24時間目以降200μMのリファンピシンで処理した後には、（ 図6B）が観察された。 高倍率撮影をこれらの胚が要求される場合にはさらに、それらは、サンプルが使用して分析することができ、そこから、96ウェルプレート（ 図1C）に自動的に表示することができる大きなパーティクルサンプラ脊椎動物自動スクリーニング技術システムは、CLSM上に実装。 大粒子サンプラー脊椎動物自動スクリーニング技術システムのいずれかCLSMや実体顕微鏡に取り付けることができるシステムです。このデバイスは、自動的にガラスキャピラリーを介して96ウェルプレートまたはバルク容器から、ライブまたは固定された胚のローディングを可能にし、所望の角度（ 例えば 、背側または横方向）でのカメラの前でそれを配向させる。すべての向きでの胚の画像は、オンボードカメラで、または外部CLSM（ 図7）を用いて行うことができる。胚はその後、収集されたか、廃棄物コンテナに転送されます。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> 図1。主流の実験OUTLINE。大によるA）成魚が卵を集め、アガロースプレートに整列して注入され、結合するように一緒に入れている。B）が注入された卵は28℃でインキュベートされ、可能な薬物治療のために事前にソートされます。C）その後の分析粒子は、フローサイトメーターおよび/ ​​またはCLSMと大きなパーティクルサンプラ/脊椎動物自動スクリーニング技術。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> 図2。S.のための最高の細胞期の確立表皮は、注射卵黄。ゼブラフィッシュ胚は、Sの100 cfuの1〜512細胞期までさまざまな発生段階の卵黄に注入した表皮ブドウ 。 1 Aとの間で注入された胚ND 8細胞期は4解像度から卵黄と高い死亡率で細菌の増殖を示した。 16および128細胞期の間に注入胚は卵黄中の3 dpiで始まる体内に細菌の増殖を示した。 256および512細胞期の間に注入胚は卵黄の中に多くの細菌の増殖を示した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> 図3サイトメーター大きな粒子流を用いて細菌負荷の定量 S.の100のcfu 表皮は、ゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。A）5解像度まで、毎日、10胚のグループが2つの生物学的レプリカ（エラーバーに基づいて平均指数関数的な成長を見せ、均質化し、直接播種した分析サイトメーター= SEM）。B）大粒子流は、非注入し、S.からの平均蛍光シグナルを示してい表皮は、胚を注入した。条件あたり30から160胚（エラーバー= SEM）を分析した、異なる文字はTukeyの事後検定（P &lt;0.001）、NSが続く一方向ANOVAによって統計的有意差を示す：CFUの間には有意ではない差異C）の相関をと10 S.の群の平均蛍光シグナル表皮は、胚（エラーバー= SEM）を感染させた。この図は、ベネマンらから変更されている。（2013年）8。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> 図4。EstablisM.のための最高の細胞期のhment マリヌム卵黄注入。ゼブラフィッシュ胚がMの30 cfuの1〜512細胞期までのすべての異なる発生段階で注入したmarinumの E11およびM株はA、B）は、胚を示した8細胞期から注入同様の拡散及びそれらが注入されながらE11株は肉芽腫および全身性感染症の形成を示した両方の株による死亡率は、A）胚は、16〜128細胞期の間に注入256から512細胞期は、卵黄に細菌負荷を保った。B）の胚が128〜512細胞期から注入されたものは、卵黄に細菌負荷を保ちながら、様構造肉芽腫および全身感染症の形成を示し、M株と16-64細胞期の間に注入。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt;：FOコンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; 図5。M.の治療ファーストラインの抗結核薬とマリヌム急性感染。胚はMの30 cfuの16-64細胞期の間に注入マリヌム M株は両群で、個々の胚の非および/ ​​または高度に感染した胚。A）の蛍光を捨てた後2つのグループにソートする3 dpiでフローサイトメーター大きな粒子を介して実行された。B）の胚は、リファンピシン（RIFで処理）12、24の用量で48時間、および200μMのは4 dpiで分析した。その細菌負荷が大幅に。C）代表COPASの12の用量でDMSOおよびリファンピシンで処理された胚のプロファイル、24、および24時間200μmで還元される。細菌負荷および分布は、赤いピークで表示されます。青い線は、ゼブラフィッシュの電子DPF要素替え（4のプロファイルを表すmbryo）COPASによる。条件あたり60〜90の胚を分析した。各データポイントは、個々の胚を表す。値は平均±SEMとして示されている。 NS：有意ではない差異。差異の統計的有意性の解析は、ANOVAはTukeyの事後検定に続く1の方法により実施した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> 図6。M.の治療最初の行の抗結核薬とマリヌム慢性感染症。胚はMの30 cfuの16-64細胞期の間に注入マリヌム E11株は大きな粒子非および/ ​​または高度に感染した胚を破棄した後に2つのグループにソートされている3 dpiでフローサイトメーターに通した。<html> A）両群における個々の胚の蛍光。B）4日間、200μMのリファンピシン（RIF）で処理された胚は、治療の1日後の細菌負荷の大幅な減少を示して分析した。条件ごとに90の胚を分析した。値は平均±SEMとして示されている。異なる文字は、同じ治療の時点の間に有意な差を示す。 *対照群との有意差を示している。 NS：有意ではない差異。差の統計的有意性の分析は、ANOVAはチューキーの事後検定に続く片道により行った。 （P &lt;0.05）。図B）はSpaink らから変更されている。（2013）13。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> hres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; 図7。M.の結果マリヌム E11卵黄注入は、脊椎動物の自動スクリーニング技術とCLSMを使用して画像化した。Mの5解像度FLI1-EGFP 14胚。A）ライブ胚を示す増殖の共焦点Zスタック（ステッチ3画像）体全体マリヌム E11菌（赤）。B）は、M. を示す5 dpiのFLI-EGFP胚を修正しました体全体マリヌム E11菌（赤）白血球のL-プラスチンが15を免疫染色によって検出された（水色）との共局在化する。

このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

この手順の全体的な目的は、創薬を可能にするためのハイスループット化合物試験に向けて、感染させたゼブラフィッシュ胚を大量に作製することです。まず、大型の産卵容器を使用して、一度に大量の同期したゼブラフィッシュ卵を回収します。次に、卵をアロスグリッドに整列させ、自動マイクロインジェクターを用いて卵黄に細菌を感染させます。感染が胚全体に広がった後、薬剤投与前に大粒子フローサイトメトリーを用いて事前分級を行います。最終的に、化合物処理後の感染胚における細菌負荷量を分析します。さらに、共焦点顕微鏡を用いて脊椎の高解像度分析を行います。自動スクリーニングおよび大型粒子サンプリングを用いて、化合物が感染に及ぼす影響をより詳細に示します。手動注入やPIXスキャン解析などの既存の手法に対するこの方法の主な利点は、均一に影響を受けた胚を大量に生成でき、それをハイスループットに解析できることです。S epiderm接種液を調製するには、A PW VW 180 9由来のM cherry発現ベクターを含むS epiderm株O 47のプレートから複数の単一コロニーを分離し、接種します。10 µg/mLのクロラムフェニコールを添加したLB培地25 mLを用い、37 °Cで一晩培養して対数増殖期まで育成させます。翌日、培養液1 mLを12,000 ×gで1分間遠心分離し、0.3% (v/v)のTween 80を含む滅菌PBS 1 mLを用いて、ペレットを3回洗浄します。OD 600で光学密度を測定し、PBS中の2% (w/v)ポリビニルピロロン40（PVP 40）を用いて、細菌懸濁液をOD 600が0.3または1 × 10⁸ CFU/mLとなるように希釈します。アミノ接種源を調製するために、PS MT 3M cherryベクターを安定的に発現しているM. Meum株MまたはE 11の単一コロニーを数個、Middlebrook 7H 10培地から分離し、10% v/v Middlebrook ADC濃縮液および50 µg/mLのハイグロマイシンを添加した10 mLのMiddlebrook 7H 9液体培地に接種します。28 °Cで一晩培養します。翌日、培養液1 mLを12,000 ×gで1分間遠心分離し、0.3% v/v Tween 80を含む滅菌PBS 1 mLを用いてペレットを3回洗浄します。細菌懸濁液のOD 600を測定し、PBSで希釈してOD 600が0.3、または0.3 × 10⁸ CFU/mLとなるようにし、2% w/v PVP 40を加えます。ゼブラフィッシュの卵を回収する前夜に、大型の繁殖容器の下部チャンバーに最大50匹のメスを、容器の上部に70匹のオスを入れます。翌朝、容器からセパレーターを取り除きます。約1時間後、繁殖容器底部の卵回収装置を通じて、卵回収用溶液を満たした50 mLチューブに卵を回収します。自動マイクロインジェクターの操作ソフトウェア上のテキストプロトコルに従って注入プレートを準備した後、「calibrate stage」をクリックし、「10 24. Well grid」をクリックして、arosプレートをマイクロインジェクターに設置します。画面上のウェルの中心位置をクリックしてプレートのキャリブレーションを行います。次に、「needle」メニューに移動し、「calibrate needle holder」をクリックします。マイクロローダーチップを使用して、直径10 µmの注入用ニードルに、S epidermを100 CFU/nL含有するPVP 40を10 µL、erumを30 CFU/nL含有するPVP 40を10 µL、または模擬注入用のPVP 40単独のいずれかを充填します。ニードルを自動マイクロインジェクターにセットし、ニードルを上下させたり移動させたりして、画面上のニードルの位置をクリックすることでXY位置を校正します。次に、画面上のニードルの先端の位置をクリックして、ニードルのZ位置を校正します。その後、プラスチック製転送ピペットを用いて、卵をarosグリッド上に分散させ、余分な卵の水を除去します。次に、卵が入ったAgrosグリッドを自動マイクロインジェクターにセットし、インジェクションメニューで注入圧力を200 hPa、注入時間を0.2秒、補正圧力を15 hPaに設定します。これはFemtoJetの設定メニューにおける1 nLに相当します。「Inject All」をクリックして、プレート上のすべての胚に注入を行います。注入後、卵をペトリ皿に移して洗浄して回収し、28 °Cでインキュベートします。大型粒子フローサイトメーターのセットアップが完了したら、PMTメニューに入り、レッドチャンネルを650 Vに、グリーンおよびイエローチャンネルを0 Vに設定します。次に、しきい値メニューで、光学密度しきい値信号を975 mVに相当する50に、飛行時間（time of flight）の最小値を320 µsに相当する800に設定します。デブリの影響を軽減するため、サンプルカップに胚を入れ、ソートメニューで70を入力し、1プレートあたり最大70個の胚をソートするように設定します。ソーターの下に空のペトリ皿を配置し、[manual sort]をクリックします。ペトリ皿が満杯になったら、[store]をクリックしてデータを保存します。高解像度の解析やイメージングが必要な場合は、胚を96ウェルプレートの各ウェルに個別にソートすることができます。胚をサンプルカップに入れ、ソートするウェルあたりの胚数を最大1個に設定します。次に、空の96ウェルプレートを左側のプレートホルダーに配置し、「fill plate」をクリックします。プレートが満たされたら、「store」をクリックしてデータを保存し、注入から3日後の薬剤処理された胚をerumで解析します。一方の胚のグループには溶媒に溶解させた目的化合物を投与し、もう一方のグループには溶媒のみを投与します。受精後4日および5日の処理済み胚をフローサイトメーターのサンプルカップに設置し、胚をトリカインで麻酔したあと、脊椎動物自動スクリーニングシステムと大型粒子サンプラーをセットアップし、1プレートあたり70個の胚をソートするように設定します。イメージング物体検出セットアップメニューのテキストプロトコルに従い、イメージング自動保存画像メニューから胚の日齢に対応する参照画像を選択し、作成する写真の枚数と使用する方向を選択します。胚を入れた96ウェルプレートを大型粒子サンプラーの左側プレートホルダーに設置し、[run plate]をクリックします。胚が正しく配置されたら、10倍のプレーンドライ対物レンズを用いて、頭部と尾部を個別に撮影します。その後、画像処理ソフトウェアで画像を接合し、卵黄感染に最適な発生段階を評価します。dermitisとmarumを用いた注射を、1細胞期から512細胞期までのあらゆる異なる段階で実施しました。ここで示されているように、16細胞期から128細胞期の間に100 CFUのdermitisを注射した際に、最適に感染が進行するパターンが得られました。細菌は卵黄内で3日間増殖し、感染から3日後以降に体内に広がりました。大粒子フローサイトメーターを用いた蛍光強度解析により、細菌量のハイスループット定量を行いました。ここに示すように、胚内部に存在する生菌数は、測定された蛍光信号と非常によく一致しています。この図は、E 11株において30 CFUのaminumを注入するための最適な発生段階が16細胞期から128細胞期の間であり、また16細胞期から64細胞期の間であることを示しています。より毒性の強いEM株を用いた場合、これらの段階で胚に注入すると、胚の中に細菌が増殖し、胚全体に細菌が広がることが示されました。エメリンに感染した胚に対して異なる濃度のリファンピシンで前処理を行ったところ、用量依存的にマイコバクテリア感染の減少が認められました。200 µMの用量で薬剤を使用したところ、投与後24時間以降、M mein E 11の細菌の進行を効果的に停止させることが実証されました。これらの手法は、結核などの感染症やバイオマテリアル関連感染症に対する新たな治療法を模索する、化合物試験および創薬分野の研究者に道を開きました。

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