設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化

この手順の全体的な目的は、創薬を可能にするためのハイスループット化合物試験に向けて、感染させたゼブラフィッシュ胚を大量に作製することです。まず、大型の産卵容器を使用して、一度に大量の同期したゼブラフィッシュ卵を回収します。次に、卵をアロスグリッドに整列させ、自動マイクロインジェクターを用いて卵黄に細菌を感染させます。

感染が胚全体に広がった後、薬剤投与前に大粒子フローサイトメトリーを用いて事前分級を行います。最終的に、化合物処理後の感染胚における細菌負荷量を分析します。さらに、共焦点顕微鏡を用いて脊椎の高解像度分析を行います。

自動スクリーニングおよび大型粒子サンプリングを用いて、化合物が感染に及ぼす影響をより詳細に示します。手動注入やPIXスキャン解析などの既存の手法に対するこの方法の主な利点は、均一に影響を受けた胚を大量に生成でき、それをハイスループットに解析できることです。S epiderm接種液を調製するには、A PW VW 180 9由来のM cherry発現ベクターを含むS epiderm株O 47のプレートから複数の単一コロニーを分離し、接種します。

10 µg/mLのクロラムフェニコールを添加したLB培地25 mLを用い、37 °Cで一晩培養して対数増殖期まで育成させます。翌日、培養液1 mLを12,000 ×gで1分間遠心分離し、0.3% (v/v)のTween 80を含む滅菌PBS 1 mLを用いて、ペレットを3回洗浄します。OD 600で光学密度を測定し、PBS中の2% (w/v)ポリビニルピロロン40（PVP 40）を用いて、細菌懸濁液をOD 600が0.3または1 × 10⁸ CFU/mLとなるように希釈します。

アミノ接種源を調製するために、PS MT 3M cherryベクターを安定的に発現しているM. Meum株MまたはE 11の単一コロニーを数個、Middlebrook 7H 10培地から分離し、10% v/v Middlebrook ADC濃縮液および50 µg/mLのハイグロマイシンを添加した10 mLのMiddlebrook 7H 9液体培地に接種します。28 °Cで一晩培養します。翌日、培養液1 mLを12,000 ×gで1分間遠心分離し、0.3% v/v Tween 80を含む滅菌PBS 1 mLを用いてペレットを3回洗浄します。

細菌懸濁液のOD 600を測定し、PBSで希釈してOD 600が0.3、または0.3 × 10⁸ CFU/mLとなるようにし、2% w/v PVP 40を加えます。ゼブラフィッシュの卵を回収する前夜に、大型の繁殖容器の下部チャンバーに最大50匹のメスを、容器の上部に70匹のオスを入れます。翌朝、容器からセパレーターを取り除きます。約1時間後、繁殖容器底部の卵回収装置を通じて、卵回収用溶液を満たした50 mLチューブに卵を回収します。

自動マイクロインジェクターの操作ソフトウェア上のテキストプロトコルに従って注入プレートを準備した後、「calibrate stage」をクリックし、「10 24. Well grid」をクリックして、arosプレートをマイクロインジェクターに設置します。画面上のウェルの中心位置をクリックしてプレートのキャリブレーションを行います。次に、「needle」メニューに移動し、「calibrate needle holder」をクリックします。

マイクロローダーチップを使用して、直径10 µmの注入用ニードルに、S epidermを100 CFU/nL含有するPVP 40を10 µL、erumを30 CFU/nL含有するPVP 40を10 µL、または模擬注入用のPVP 40単独のいずれかを充填します。ニードルを自動マイクロインジェクターにセットし、ニードルを上下させたり移動させたりして、画面上のニードルの位置をクリックすることでXY位置を校正します。次に、画面上のニードルの先端の位置をクリックして、ニードルのZ位置を校正します。その後、プラスチック製転送ピペットを用いて、卵をarosグリッド上に分散させ、余分な卵の水を除去します。

次に、卵が入ったAgrosグリッドを自動マイクロインジェクターにセットし、インジェクションメニューで注入圧力を200 hPa、注入時間を0.2秒、補正圧力を15 hPaに設定します。これはFemtoJetの設定メニューにおける1 nLに相当します。「Inject All」をクリックして、プレート上のすべての胚に注入を行います。注入後、卵をペトリ皿に移して洗浄して回収し、28 °Cでインキュベートします。

大型粒子フローサイトメーターのセットアップが完了したら、PMTメニューに入り、レッドチャンネルを650 Vに、グリーンおよびイエローチャンネルを0 Vに設定します。次に、しきい値メニューで、光学密度しきい値信号を975 mVに相当する50に、飛行時間（time of flight）の最小値を320 µsに相当する800に設定します。デブリの影響を軽減するため、サンプルカップに胚を入れ、ソートメニューで70を入力し、1プレートあたり最大70個の胚をソートするように設定します。

ソーターの下に空のペトリ皿を配置し、[manual sort]をクリックします。ペトリ皿が満杯になったら、[store]をクリックしてデータを保存します。高解像度の解析やイメージングが必要な場合は、胚を96ウェルプレートの各ウェルに個別にソートすることができます。

胚をサンプルカップに入れ、ソートするウェルあたりの胚数を最大1個に設定します。次に、空の96ウェルプレートを左側のプレートホルダーに配置し、「fill plate」をクリックします。プレートが満たされたら、「store」をクリックしてデータを保存し、注入から3日後の薬剤処理された胚をerumで解析します。

一方の胚のグループには溶媒に溶解させた目的化合物を投与し、もう一方のグループには溶媒のみを投与します。受精後4日および5日の処理済み胚をフローサイトメーターのサンプルカップに設置し、胚をトリカインで麻酔したあと、脊椎動物自動スクリーニングシステムと大型粒子サンプラーをセットアップし、1プレートあたり70個の胚をソートするように設定します。イメージング物体検出セットアップメニューのテキストプロトコルに従い、イメージング自動保存画像メニューから胚の日齢に対応する参照画像を選択し、作成する写真の枚数と使用する方向を選択します。

胚を入れた96ウェルプレートを大型粒子サンプラーの左側プレートホルダーに設置し、[run plate]をクリックします。胚が正しく配置されたら、10倍のプレーンドライ対物レンズを用いて、頭部と尾部を個別に撮影します。その後、画像処理ソフトウェアで画像を接合し、卵黄感染に最適な発生段階を評価します。

dermitisとmarumを用いた注射を、1細胞期から512細胞期までのあらゆる異なる段階で実施しました。ここで示されているように、16細胞期から128細胞期の間に100 CFUのdermitisを注射した際に、最適に感染が進行するパターンが得られました。細菌は卵黄内で3日間増殖し、感染から3日後以降に体内に広がりました。

大粒子フローサイトメーターを用いた蛍光強度解析により、細菌量のハイスループット定量を行いました。ここに示すように、胚内部に存在する生菌数は、測定された蛍光信号と非常によく一致しています。この図は、E 11株において30 CFUのaminumを注入するための最適な発生段階が16細胞期から128細胞期の間であり、また16細胞期から64細胞期の間であることを示しています。

より毒性の強いEM株を用いた場合、これらの段階で胚に注入すると、胚の中に細菌が増殖し、胚全体に細菌が広がることが示されました。エメリンに感染した胚に対して異なる濃度のリファンピシンで前処理を行ったところ、用量依存的にマイコバクテリア感染の減少が認められました。200 µMの用量で薬剤を使用したところ、投与後24時間以降、M mein E 11の細菌の進行を効果的に停止させることが実証されました。

これらの手法は、結核などの感染症やバイオマテリアル関連感染症に対する新たな治療法を模索する、化合物試験および創薬分野の研究者に道を開きました。