設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化表皮ブドウ球菌とマイコバクテリウムmarinumの感染症

この手順の全体的な目標は、感染したゼブラフィッシュの胚を大量に生成し、ハイスループット化合物試験を行い、創薬を可能にすることです。これは、まず大型の繁殖船を使用して、1回のイベントで多数の同期ゼブラフィッシュの卵を得ることによって達成されます。次に、卵をアロスグリッドに整列させ、自動マイクロインジェクターを使用して卵黄の細菌に感染させます。

感染が胚全体に広がった場合、胚は薬剤で治療される前に、大粒子フローサイトメトリーによって事前に選別されます。最後に、感染した胚の細菌負荷レベルを化合物処理後に分析します。最終的には、共焦点顕微鏡による椎骨による高解像度分析。

自動スクリーニングと大粒子サンプリングを使用して、化合物が感染に及ぼす影響をより詳細に示します。この方法の主な利点は、手動注入やPIXスキャン分析などの既存の技術と比較すると、均質に影響を受けた胚を大量に生成でき、ハイスループットで分析できることです。S表皮株のプレートから数個の個々のコロニーを分離したS表皮接種物を調製し、A pw VW1809を含有するO47にMチェリー発現ベクターを、接種する。

25ミリリットルのLBに1ミリリットルあたり10マイクログラムを補給しました。クロラムフェニコールは、翌日のミッドロックステージまで摂氏37度で一晩インキュベートし、1分間12, 000 GSで1ミリリットルの培養物を遠心分離し、80の間の容量あたり0.3%の容量の滅菌PBS1ミリリットルを使用してペレットを3回洗浄します。OD 600で光学密度を測定し、体積あたり2%の重量、PBS中のポリビニルペロン40またはPVP40を使用して、細菌懸濁液を0.3または1ミリリットルあたり8CFUの10倍に等しいOD600に希釈します。

Middlebrook seven H 10からPS MT 3Mチェリーベクターを安定して発現させるM Meum株MまたはE 11からいくつかの個々のコロニーを分離し、10ミリリットルのMiddlebrook seven H nineブロスを1体積あたり10%含有するイオンを接種する。ミドルブルック:DC濃縮物に1ミリリットルあたり50マイクログラムのハイグロマイシンを添加し、翌日28°Cで一晩インキュベートします。1 ミリリットルの培養物を 1 分間 12, 000 GS で遠心分離し、1 ミリリットルの滅菌 PBS を 80 リットルの間の 80 リットルの体積で 3 回洗浄します。

細菌懸濁液のOD600を測定し、体積あたり2%の重量で測定します。PBS中のPVP 40をOD 600に希釈し、1ミリリットルあたり8CFUの10倍または0.3倍に希釈してゼブラフィッシュの卵を得るため、収集前夜に最大50匹のメスのゼブラフィッシュを大型の繁殖船の底室に、70匹のオスを容器の上部に入れます。翌朝、容器からセパレーターを取り出します 約1時間後、繁殖容器の底にある卵コレクターを通して、卵を卵水で満たされた50ミリリットルのチューブに集めます。

インジェクションプレートを調製した後、自動マイクロインジェクターオペレーティングソフトウェアのテキストプロトコルに従って、キャリブレーションステージをクリックし、次に10 24をクリックします。ウェルグリッドを作成し、アロスプレートをマイクロインジェクターに配置し、ウェルの中央位置にある画面をクリックしてプレートをキャリブレーションします。次に、ニードルメニューに移動し、[ニードルホルダーのキャリブレーション]をクリックします。

マイクロローダーを使用して、直径10ミクロンの先端注射針に、S表皮のナノリットルあたり100CFUを含むPVP 40の10マイクロリットル、エルムのナノリットルあたり30CFU、または模擬注射用のPVP 40のみのいずれかで充填し、自動マイクロインジェクターに針を置き、針を下げるか上に動かして針の位置で画面をクリックしてXY位置を校正します。次に、針の先端の位置で画面をクリックして、針のZ位置を校正します。次に、プラスチック製の移送ピペットを使用して卵をアロスグリッドに分配し、余分な卵の水分を取り除きます。

次に、卵で満たされたアグロスグリッドを注入メニューの自動マイクロインジェクターに配置し、注入圧力設定を200ヘクタールパスカルに、注入時間を0.2秒に、補償圧力を15ヘクターパスカルに調整します。これは、フェムトジェット設定メニューの1ナノリットルと相関します。「inject all」をクリックし、注入後に胚のプレート全体を注入します。卵をペトリ皿で洗って卵を集め、摂氏28度で孵化させます。

大型パーティクルフローサイトメーターをセットアップしたら、PMTメニューに入り、赤のチャンネルを650ボルトに、緑と黄色のチャンネルを0ボルトに設定します。次に、しきい値メニュー内で、光学密度しきい値信号を50(975ミリボルトに対応し、飛行時間の最小値を800(320マイクロ秒)に対応)に設定します。破片の影響を減らすために、胚をサンプルカップとソートメニューに配置し、70を入力してプレートごとに最大70個の胚を見つけて選別します。

空のペトリ皿をソーターの下に置き、手動ソートをクリックします。ペトリ皿がいっぱいになったら、ストアをクリックしてデータを保存します。高分解能の分析またはイメージングが必要な場合は、胚を96ウェルプレートのウェルに個別に選別できます。

胚をサンプルカップに入れ、ウェルごとに最大1つの胚を選別します。次に、空の96ウェルプレートを左側のプレートホルダーに配置し、[プレートの充填]をクリックします。プレートが満たされたら、erum注入後3日で薬物処理された胚を分析するためのストアをクリックしてデータを保存します。

胚の1つのグループを溶媒中の目的の化合物で処理し、2番目のグループを溶媒のみで処理します。受精後4日および5日で処理した胚をフローサイトメーターのサンプルカップにセットし、トリカで胚を麻酔した後、プレートあたり70個の胚に選別を設定し、脊椎動物自動スクリーニングシステムと大型粒子サンプラーをセットアップします。イメージングオブジェクト検出セットアップメニューからテキストプロトコルに従って、イメージングオートストア画像メニューで胚の年齢に対応する参照画像を選択し、作成する画像の数と使用する向きを選択します。

胚を充填した96ウェルプレートを大型パーティクルサンプラーの左プレートホルダーにセットし、ランプレートをクリックします。胚が正しく配置されたら、10 x プレーンドライ対物レンズを使用し、頭部と尾部を別々に画像化します。次に、画像処理ソフトウェアを使用して画像をつなぎ合わせ、卵黄感染に最適な発達段階を評価します。

皮膚炎とマルムの注射は、1細胞期と512細胞期の間のすべての異なる段階で行われました。ここに見られるように、16細胞期と128細胞期の間に行われた100CFUの皮膚炎の注射は、最良の感染パターンを提供しました。この細菌は卵黄の中で3日間増殖し、感染後3日以降は体内に広がりました。

細菌負荷のハイスループット定量は、Large Particle Flow Cytometerを用いた蛍光強度分析により行いました。ここに示すように、胚の内部に存在する生きた細菌の量は、測定された蛍光シグナルと非常によく一致しています。この図は、30 CFUのアミナムを注入するための最適な発生段階が、E 11株の16〜128細胞期と、16〜64細胞期の間であることを示しています。

これらの段階で注入された胚は、より毒性の強いEM株により、オーク内部での細菌増殖と胚を通じた細菌の拡散を示しました。エメリン感染胚のプセレント治療後、異なる濃度のリファンピシンを持つ胚は、用量依存的にマイコバクテリア感染の減少を示しました。.200マイクロモルの用量で薬物を使用すると、治療後11、24時間後、およびそれ以降のM mein Eの細菌進行を効果的に停止することが実証されました。

これらの技術は、化合物試験や医薬品開発の分野の研究者に道を開き、結核や生体材料関連感染症などの感染症の新しい治療法を探していました。