ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

このビデオでは、ゼブラフィッシュの胚における線維芽細胞成長因子Rasmマップキナーゼ経路の低分子ベースの調節を評価するために、画像ベースのハイコンテントスクリーニングが行われ、ゼブラフィッシュの胚ではトランスジェニック雄と野生型の雌ゼブラフィッシュが繁殖ケージで交配されます。受精卵は底に落ち、集められてシャーレに移されます。胚を一晩インキュベートした後、96ウェルの丸い底板の個々のウェルに入れます。

低分子BCIをハイパー活性化FGFシグナル伝達に添加し、プレートを6時間インキュベートします。各遺言からの画像は、共焦点プレートリーダーでキャプチャされ、特定の胚構造の蛍光強度を報告する自己設計のアルゴリズムを使用して分析されます。こんにちは、ピッツバーグ大学微生物学・分子遺伝学部のマイケル・チャン博士研究室の角ヒ

こんにちは、ピッツバーグ大学創薬研究所のアンドレア・スポックです。今日は、化学処理のためのゼブラフィッシュの胚の繁殖、選択、配列の手順をお見せします。96ウェルプレートでは、グラスファイバー成長因子の活性を報告し、この過去の白を過剰に活性化する分子で処理したトランスジェニック胚を使用します。

コンテントスクリーニング法を用いて、トランスジェニックゼブラフィッシュの胚における線維芽細胞成長因子活性を自動的に取得、分析、定量する方法をご紹介します。この手順では、トランスジェニックゼブラフィッシュとハイスループットケミカルスクリーニングを利用するためのプラットフォーム技術に焦点を当てます。それでは始めましょう。

処理の2日前に、ホモ接合体のオスのトランスジェニックゼブラフィッシュを同定し、それらを個々の交配水槽に入れます。水槽にセパレーターを追加し、次に野生型の雌魚を各水槽に追加し、魚を摂氏28度の交尾ケージに一晩置いておきます。翌朝、セパレーターを取り外します1時間後、魚を新しいタンクに移し、胚をプラスチック製のふるいに注ぎます。

胚をE 3溶液で100mm皿に移し、摂氏28度で6〜8時間インキュベートします。インキュベーション後、実体顕微鏡で胚を検査します。実験に適した胚はガスを受けます。

このとき、単一細胞段階に残る未受精の胚をすべて取り除きます。また、不透明または奇形に見える生存不能な胚を切除します。次に、新しいE three溶液を加え、摂氏28度で一晩インキュベートします。

翌日、胚を蛍光実体顕微鏡下に置き、トランスジェニック胚を同様のステージと均一に選別します。GFP発現 24個のHPF胚は、強いGFP発現とGFP陽性の背側網膜を持つ整形された眼で、目に見える中中部脳の脳内境界を示します。これらの胚は活発で、プラスチック製の牧草用ピペットを使用してコリオン内で動き、小刻みに動きます。

24個のHPF胚を一度に1つずつ、96ウェルプレートの個々のウェルに移します。マイクロピペットを使用して、ウェルから余分なE-3溶液を取り除きます。次に、マルチチャンネルピペッターを使用して、各ウェルに200マイクロリットルのE 3溶液を加えます。

次に、列 1 と 12 のすべてのウェルに 2 マイクロリットルの DMSO を追加します。次に、次のようにDMSOで調製した2マイクロリットルのBCLを、1マイクロモルをカラム2と7に追加します。5マイクロモルから3と8、10マイクロモルから4と920。

マイクロモルからカラム5と10。そして最後に、25マイクロモルからカラム6と11。次に、プレートをアルミホイルで覆い、摂氏28度で6時間インキュベートします。

各ウェルに10マイクロリットルのトリカを加えて、30個のHPF胚を麻酔します。次に、プレートを分子デバイスImage Express ultra open meta expressソフトウェアにロードします。Forexの目的と最大ピンホールの直径を持つ構成を選択してください。

レーザーオートフォーカスをプレートの底面を検出するように構成し、所定の最適なZオフセットを使用します。関心領域を検出するには、スキャン領域を 2000 x 2000 ピクセルの 1 つのサイトとして設定し、ベニングなしに設定します。適切なプレートタイプと、525ナノメートルを超える488の発光波長で励起する488ナノメートルのアルゴンレーザーを選択します。

次に、ビヒクル処理された胚を含むウェルを選択し、[サンプルの検索]をクリックします。装置はオートフォーカススキャンを実行し、単一の画像を取得して、適切な画像取得を確認します。手入れの行き届いた車両をランダムに選択し、画像を取得します。

画像にピントが合っていて、頭にGFP発現が見られる場合。カーソルを最も明るい領域に置き、蛍光強度が 16 ビット カメラの範囲内にあることを確認します。65 、 000 ユニット未満。

これらの手順を別の車両制御といくつかの化合物処理ウェルで繰り返します。必要に応じて、ポジコントロール画像の最も明るい領域が飽和しないように、レーザー出力とゲインを調整します。次に、プレート取得および制御ウィンドウで、プレート取得を選択してプレートスキャンを開始します。

装置は、マイクロプレート全体についてウェルごとに1つの画像を自動的に取得し、SQLサーバーデータベースにアーカイブします。スキャンが終了したら、画像をD定義にアップロードします。開発者は、slinger オプションを有効にして developer を開きます。

新しいワークスペースを作成します。次に、ファイルメニューから、カスタマイズされたインポートを選択します。次に、画像が含まれているフォルダーに移動し、サンプル ファイルを開きます。

分子デバイスimage express ultraプラットフォームによって生成された画像形式とファイル構造を認識するインポートフィルターを選択します。次に、画像を処理するには、制御画像を開き、目的の認知ネットワーク技術またはCNTアルゴリズムまたはルールセットをロードします。ここで使用されるカスタムアルゴリズムは、胚、卵黄、頭部を自動的に識別し、GFP発現する頭部構造の明るさと面積を定量化し、頭部と卵黄の検出段階に設定されたルールを実行するように設計されています。

卵黄の袋と頭が適切に割り当てられていることを確認するには、ルールセットを変更して、卵黄が大きすぎるか小さすぎる場合に卵黄検出しきい値を調整します。次に、明るい頭部構造検出の段階に設定されたルールを実行します。頭部内の GFP 発現領域を適切に割り当てるには、ルール セットを変更して、明るい頭部構造の検出が目視と一致するまで、頭部構造の検出しきい値を単純強度の倍数として調整します。

次に、ビヒクル処理された胚から生成されたランダムに選択されたいくつかの画像とPCI処理された胚からのポジティブコントロール画像に対して、ルールセット全体を手動で実行します。すべてのプレート画像でアルゴリズムを実行するには、解析するプレートを選択して選択します。分析してから、最適化されたルールセットに移動し、すべてのウェルを分析します。

統合されたジョブスケジューラを使用すると、空のウェルやあいまいな画像は、スキャン中に分析から自動的に除外されます。継続的に更新されるキープマップが表示されます。データと画像の両方は、目視検査のために実行中にアクセスできます。

数値データと処理された画像は自動的に保存されます。すべての画像が分析された後、データはExcel、GraphPad、prismなどのサードパーティソフトウェアにエクスポートできます。この図は、CNT分析の有無にかかわらず、処理された車両とA BCIが良好に処理された車両からのアーカイブスキャン画像を示しています。

適用された緑色蛍光タンパク質またはGFPは、トランスジェニック胚の眼、中後脳境界、および三叉神経節で検出されます。GFP強度と発現ドメインの両方が拡張されていることに注意してください。ここでBCI処理した胚では、トランスジェニック胚におけるGFPレポーター遺伝子発現に対するBCIの用量依存的な影響が見られます。

半値最大応答またはEC 50を誘発するために必要な濃度は、約12マイクロモルであった。トランスジェニックゼブラフィッシュの胚を育種、収集、96ウェルプレートに配列する方法をお見せしました。シグナル伝達経路の自身の活性化因子にPCIの濃度を高めました。

また、トランスジェニック胚のイメージングを自動化する方法を示し、認知ネットワーク技術に基づくカスタム設計アルゴリズムで画像を分析しました。このアプローチにより、線維芽細胞成長因子シグナル伝達の低分子活性化因子の影響を段階的に定量的に測定することができました。この手順を行うときは、標本間のばらつきを最小限に抑えるために胚を慎重に選択することを覚えておくことが重要です。

それです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。