Name: ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュの自動画像解析システムを用いた高スループット化学スクリーニング。BCI処理によるFGFシグナル伝達の用量依存的効果を定量化し、発生生物学における創薬研究を効率化する革新的プラットフォーム技術です。

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この作品は、ツァンにHukriede、NCI / NIH（P01 CA78039）フォークトに、とNHLBI / NIH（1R01HL088016）にNICHD / NIH（1R01HD053287）によって運営されている。

1）ゼブラフィッシュの交配とBCIの治療を設定します。 <ol><li>個別に交配タンク1内にPT6ゼブラフィッシュと場所：2日前治療に、ホモ接合体の雄Tgを（d2eGFP dusp6）識別する。セパレータと野生型AB *メスの魚を追加し、一晩交配ケージに残す。 </li><li>翌朝には、区切り文字を削除し、そして1時間後に胚を収集する。 E3（5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMの塩化カルシウム、0.33 mMの硫酸マグネシウム）、6時間28℃で溶液とインキュベートして100ミリメートル皿に胚を移す。死んで削除し、胚を不受精の、新鮮なE3のソリューションを追加し、そして一晩インキュベートする。 </li><li>同じようなステージ（24hpf）と均一なGFPの発現のためのトランスジェニック胚を並べ替えます。 96ウェルプレートの各ウェルに個別に配列の胚。 </li><li>マイクロピペットによる過剰E3ソリューションを削除します。各ウェルにマルチチャンネルピペッターを持つE3ソリューションの200μlの追加。 </li><li>として記載されている以下の化合物を追加します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5メートルM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr></tbody></table>最終濃度は1％DMSOで1μM、5μM、10μM、20μM、25μmのBCIです。アルミ箔でプレートをカバーし、28で6時間インキュベート℃を</li></ol> 96ウェルプレートおよび分析の2）自動化イメージング。 <ol><li> 30hpf胚を麻酔するために各ウェルにtricaine（0.61mM）の10μlを追加します。 </li><li>分子デバイスImagexpressウルトラにプレートをロードする。 </li><li> Metaxpressソフトウェアを開きます。 4xの客観的かつ最大のピンホールの直径を持つ構成を選択し、レーザーオートフォーカスは、プレートの底部を検出し、関心領域を検出するために最適なZ -平面を決定するために設定する。 525分の488 nmの（GFP）の励起/発光波長での画像を取得する。ないビニングと2000x2000ピクセル（4 × 4 mm）の単一のサイトとして領域をスキャン設定する。レーザーパワーを設定し、ポジティブコントロールイメージのように明るい領域が飽和していない得る。いくつかのポジティブおよびネガティブコントロールのウェル内の適切な画像の取得を確認してください。 </li><li>プレートのスキャンを開始します。測定器は自動的にすべてのウェルとアーカイブするSQL Serverデータベース内から画像を取得します。 </li><li> Cellengerアプリケーションモジュールと分子デバイスImagexpressウルトラプラットフォームで生成される画像形式とファイル構造を認識するインポートフィルタを使用して定義するものの開発者向けに画像をアップロードする。 </li><li>カスタム設計された認知ネットワーク技術のアルゴリズム（これもルールセットと呼ばれる）を持つプロセスの画像。我々のカスタムは、最近発表されたルールセット2に基づいて開発されたアルゴリズムは、自動的に胚、卵黄、そして頭を識別するために設計されており、GFP発現ヘッド構造の明るさと面積を定量化する。 （例えば、フォーカス画像の高い化合物の毒性または外付）は胚が検出されているか、ヘッドを明確に割り当てることができない場所ウェルは分析から除外されます。いくつかのネガティブコントロールイメージ（ビヒクル処理）と陽性対照の画像（BCI処理）頭と卵黄が正しく両方で識別されるように使用するアルゴリズムを設定します。明るいヘッド構造の検出は目視観察と一致するまでの平均卵黄の強度の倍数として"頭の構造が"検出のしきい値を設定します。エクスポートするパラメータを定義します。この例では、最も有益なパラメータは以下、"総頭の構造の輝度"（図1）と呼ばれるヘッド内でGFP -陽性領域の全積分明るさだった。 <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 グラフは、トランスジェニック胚におけるGFPの発現にBCIの用量依存性の影響をdepicitng。 </li><li>統合されたジョブスケジューラを使用して、すべてのプレートの画像上でアルゴリズムを実行します。定義するもののソフトウェアは、複数の画像の同時分析を可能にする、複数のプロセッサ（"エンジン"）で分散コンピューティングを使用しています。アルゴリズムでは、応用解析と処理された画像のコピーと一緒にデータベースに保存されている画像解析、、の結果に基づいて数値の措置を計算します。 </li></ol>代表的な結果： すべての画像が分析された後、データはCellenger内で可視化することや、さらに詳しい分析やグラフ表示のためのサードパーティソフトウェア（エクセル、グラフパッドプリズム）にエクスポートできます。図2は、治療を受けた車両からのスキャン画像をアーカイブし、適用されたとCNTの分析せずに、よくBCI -扱わ。図1文書TgのGFPレポーター遺伝子の発現（dusp6：d2EGFP）でBCIの用量依存効果PT6胚。半最大応答（EC50）を引き出すために必要な濃度は約12μmであった。 <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 トランスジェニックゼブラフィッシュの胚の自動化されたイメージのキャプチャと分析。 30hpfでPT6胚：（A）DMSOの車両は、Tg（d2eGFP dusp6）を扱う。 （B）20μMBCIショーで治療したトランスジェニック胚では、GFPの発現で増加する。頭の中でGFPの発現を検出するルールセット定義するものを実行した後から胚（）の（C）画像。オレンジ色の斑点は、ソフトウェアがGFPの強度を測定する場所表す。頭の中でGFPの発現を検出するルールセット定義するものを実行した後（B）からの胚の（D）イメージ。オレンジ色の斑点は、ソフトウェアがGFPの強度を測定する場所表す。ルールセットが処理された胚にGFPの発現の拡張された領域を見つけることができたことに注意してください。

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

ゼブラフィッシュの化学物質の画面のスループットを制限する主な要因は、体系的にプロセスのイメージングと解析のための96ウェルプレートへの方法論の欠如です。多細胞生物の画像は、複雑な低コントラスト、そして自然の中で異質なので、既存の画像解析アルゴリズムは、生体内の特定の構造を検出し、定量化に失敗する。ほとんど公開されてゼブラフィッシュの化学物質の画面では、そのための手順全体に専用の担当者による個々のウェルの目視検査を含む。これは通常、数値リードアウトの生成と画面イメージとデータのアーカイブを完全に防ぐことができます。また、マニュアルの評価、すなわちイメージベースのスクリーニング、、スクリーンの性能のレトロスペクティブ分析を実施するためのスクリーニングキャンペーン（例えば、毒性または発達障害）の主な焦点ではなかった表現型の変化を調べ、交差する機能のいくつかの重要な利点を排除同じ化合物ライブラリーを使用して過去や未来の画面で参照スクリーニングデータ。 本報告書では、ユーザーの介入なしに、マルチウェルプレート内のゼブラフィッシュ胚の自動化されたイメージングと解析のための方法論を強調する。我々のイメージTG（dusp6：d2EGFP）に焦点リーダー（Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール）のスキャンImageXpressウルトラレーザーで自動化された画像キャプチャ96ウェルプレートでPT6胚と定義するもの&quot;認知ネットワーク技術定量化することGFPに基づいた画像解析アルゴリズムを開発トランスジェニック胚の頭部で発現。方法は、段階的応答を達成し、小分子FGFシグナル伝達の活性化因子のin vivo活性の定量化。同様の結果がそれは市販のプレートリーダー2の様々なゼブラフィッシュ胚の自動化された画像キャプチャを実現することが可能であることを文書化する落射蛍光ベースのArrayScan II（セロミクス社、ピッツバーグPA）が得られた。自動的に多細胞生物の画像を分析する方法論の開発は、人間の観察によって、視覚スコアリングの必要性を排除し、将来のスクリーン付きレトロスペクティブ分析と比較のための数値データと画像の生成とアーカイブを有効にする。

<table><tbody><tr><td>トリカイン (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

我々は、ゼブラフィッシュの胚ではFGF / RAS / MAPK経路を調節できる小さな分子を識別するためのイメージベースのハイコンテンツスクリーニング（HCS）方法論の適用を示しています。ゼブラフィッシュの胚は、生体内の高含有量化学物質の画面で最適なシステムです。 1日齢の胚は、直径1mm程度であり、簡単に96ウェルプレート、ハイスループットスクリーニングのための標準形式に配列することができます。開発の最初の日の間に、胚は、このように、胚発生時の組織形成の可視化を可能にする、現在の主要な臓器のほとんどが透明です。ゼブラフィッシュの化学画面の完全な自動化は、特に自動化されたイメージの取得と分析の開発では、しかしながら、依然として課題です。我々は以前にFGF活性の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックレポーターのラインを生成し、化学物質の画面でその有用性を実証<sup&gt; 1</sup&gt;。ハイスループット生物全体のスクリーンのための方法論を確立するために、我々は、96ウェルプレートで24〜48時間の後の受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚の自動化された画像と解析のためのシステムを開発<sup&gt; 2</sup&gt;。このビデオでは、24hpfでマルチウェルプレートにトランスジェニック胚をアレーする際の手順を強調表示し、FGFシグナリングをhyperactivates小分子（BCI）の追加<sup&gt; 3</sup&gt;。プレートは、モレキュラーデバイスImageXpressウルトラレーザースキャニング共焦点HCSリーダー上で自動化されたイメージングする前に幼虫を麻酔tricaineを加えて6時間インキュベートする。画像は、我々はトランスジェニック胚の頭部にGFPの発現を検出し、定量化するために開発された認知ネットワーク技術のアルゴリズムを使用して定義するものの開発者のソフトウェアによって処理されます。この例では、治療胚におけるGFPレポーター遺伝子の発現にBCIの用量依存的効果を測定するためにアルゴリズムの能力を強調。

我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。

我々は、FGF/RAS/MAPK経路を調節できる低分子化合物を同定するため、画像ベースの高コンテンツスクリーニング（HCS）手法の適用について実演します。

このビデオでは、ゼブラフィッシュ胚を用いて、低分子化合物による線維芽細胞増殖因子（FGF）Ras/MAPK経路の調節を評価するための画像ベースのハイコンテンツスクリーニングを実施します。まず、ブリーディングケージ内でトランスジェニックのオスと野生型のメスのゼブラフィッシュを交配させます。受精卵は底に落下するため、これを回収してペトリ皿に移します。胚を一晩インキュベートした後、96ウェル丸底プレートの各ウェルに配置します。低分子化合物BCIを添加してFGFシグナリングを過剰に活性化させ、プレートを6時間インキュベートします。それぞれのウェルから共焦点プレートリーダーを用いて画像をキャプチャし、自作のアルゴリズムを用いて解析することで、特定の胚構造における蛍光強度を算出します。こんにちは、私はピッツバーグ大学微生物学・分子遺伝学部のMichael Chang博士の研究室のHiba Kadoです。ピッツバーグ大学創薬研究所のAndrea Spockです。今日は、化学物質処理のためにゼブラフィッシュ胚を繁殖、選別、およびアレイ化する手順をご紹介します。96ウェルプレートを用いて、線維芽細胞増殖因子（FGF）活性を報告する転移遺伝子組み換え胚を使用し、この経路を過剰活性化させる分子で処理します。本ビデオでは、ハイコンテンツスクリーニング法を用いて、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚における線維芽細胞増殖因子活性を自動的に取得、解析、および定量化する方法を説明します。この手順では、トランスジェニックゼブラフィッシュとハイスループット化学スクリーニングを活用するためのプラットフォーム技術に焦点を当てます。それでは始めていきましょう。処置の2日前、ホモ接合体のオス・トランスジェニックゼブラフィッシュを特定し、個別の交配タンクに移します。タンクにセパレーターを設置した後、各タンクに野生型のメスを加え、28 °Cの交配ケージ内で一晩飼育します。翌朝、セパレーターを取り除きます。1時間後、魚を新しいタンクに移し、胚をプラスチック製シブに漉します。胚をE3溶液が入った100 mmディッシュに移し、28 °Cで6〜8時間インキュベートします。インキュベーション後、実体顕微鏡で胚を観察します。ガス交換期にある胚が実験に適しています。この時点で、単細胞期のままの未受精卵を除去します。また、不透明または形態異常が見られる生存不可能な胚も除去してください。その後、新鮮なE three溶液を加え、28 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。翌日、胚を蛍光実体顕微鏡下に置き、発生段階が等しく均一なトランスジェニック胚を選別します。受精後24時間（24 HPF）でGFPを発現している胚は、中脳後脳境界に強いGFP発現が見られ、背側網膜がGFP陽性で眼が十分に形成されています。これらの胚は活発であり、プラスチック製パスチャーピペットを用いて操作すると、卵膜内で動き、身をよじります。24 HPFの胚を、1匹ずつ96ウェルプレートの個別のウェルに移します。マイクロピペットを使用して、ウェル内の余分なE three溶液を取り除きます。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに200 µLのE three溶液を加えます。次に、1列目と12列目のすべてのウェルに2 µLのDMSOを加えます。続いて、DMSOで調製したBCLを次のように2 µLずつ加えます。2列目と7列目に1 µM、3列目と8列目に5 µM、4列目と9列目に10 µM、そして5列目と10列目に20 µMを加えます。5列目と10列目にmicromolarを、最後に6列目と11列目に25 micromolarを加えます。次に、プレートをアルミホイルで覆い、28 °Cで6時間インキュベートします。30 HPFの胚を麻酔するために、各ウェルに10 µLのtricaを添加します。次に、プレートをmolecular devices image express ultra open meta expressソフトウェアにロードします。4x対物レンズと最大ピンホール径の構成を選択してください。レーザーオートフォーカスを設定してプレート底面を検出し、あらかじめ決定した最適なZオフセットを使用します。関心領域を検出するため、スキャンエリアをビニングなしの2000×2000ピクセルのシングルサイトに設定します。適切なプレートタイプを選択し、励起波長488 nm、蛍光波長525 nmの488 nmアルゴンレーザーを選択します。次に、ビークル処理した胚が入ったウェルを選択し、「find sample」をクリックします。装置がオートフォーカススキャンを行い、適切な画像取得を確認するために単一の画像を撮影します。ビークル処理したウェルをランダムに選択し、画像を撮影してください。画像にピントが合っており、頭部でGFP発現が確認できることを確認します。最も明るい領域にカーソルを合わせ、蛍光強度が16ビットカメラの範囲内（65,000ユニット未満）であることを検証します。これらの手順を、別のビークルコントロールおよびいくつかの化合物処理ウェルで繰り返します。必要に応じて、ポジティブコントロール画像の最も明るい領域が飽和しないように、レーザー出力とゲインを調整してください。次に、「Plate Acquisition and Control」ウィンドウで、「Acquire Plate」を選択してプレートスキャンを開始します。装置はマイクロプレート全体のウェルごとに1枚の画像を自動的に取得し、SQLサーバーデータベースにアーカイブします。スキャンが完了したら、slingerオプションを有効にしてDeveloperを開き、画像をD definitionのDeveloperにアップロードしてください。新しいワークスペースを作成します。次に、ファイルメニューから「customized import」を選択します。続いて、画像が保存されているフォルダに移動し、サンプルファイルを開きます。Molecular Devices社のImageXpress Ultraプラットフォームで生成された画像形式およびファイル構造を認識するインポートフィルターを選択します。次に画像を処理するため、コントロール画像を開き、目的のCognition Network Technology（CNT）アルゴリズムまたはルールセットをロードします。ここで使用するカスタムアルゴリズムは、胚、卵黄、および頭部を自動的に識別し、GFPを発現している頭部構造の輝度と面積を定量化するように設計されています。頭部および卵黄の検出段階まで、ルールセットを実行してください。卵黄嚢と頭部の適切な割り当てを確実にするため、卵黄が大きすぎるか小さすぎる場合に卵黄検出しきい値を調整するようにルールセットを変更します。次に、明るい頭部構造の検出段階までルールセットを実行します。頭部におけるGFP発現領域を適切に割り当てるため、明るい頭部構造の検出結果が視覚的な観察と一致するまで、頭部構造の検出しきい値を最小強度の倍数として調整するようにルールセットを変更します。次に、ビークル処理した胚から生成されたランダムに選択した数枚の画像と、PCI処理した胚からの陽性対照画像に対して、ルールセット全体を手動で実行します。すべてのプレート画像にアルゴリズムを適用するには、解析するプレートを選択して「Analyze」を選びます。その後、最適化されたルールセットに移動し、すべてのウェルを解析します。統合ジョブスケジューラを使用すると、スキャン中に空のウェルや不明瞭な画像が解析から自動的に除外されます。継続的に更新されるキープマップが表示されます。また、実行中にデータと画像の両方にアクセスし、視覚的な確認を行うことができます。数値データと処理済み画像は自動的に保存されます。すべての画像の解析が完了した後、データはExcel、GraphPad、またはprismなどのサードパーティ製ソフトウェアにエクスポートできます。この図は、CNT解析ありおよびなしの条件下で、vehicle投与群およびBCI投与群で処理されたウェルのアーカイブスキャン画像を示しています。導入された緑色蛍光タンパク質（GFP）が、形質転換胚の眼、中後脳境界および三叉神経節で検出されています。GFPの強度と発現領域の両方が拡大していることに注目してください。こちらのBCI処理胚では、形質転換胚におけるGFPレポーター遺伝子の発現に対し、BCIの用量依存的な影響が見られます。最大反応の半分を誘導する濃度（EC 50）は約12 micromolarでした。ここまで、トランスジェニックゼブラフィッシュの胚を交配・採取し、96ウェルプレートに配置する方法について解説しました。シグナル伝達経路の活性化剤として、PCIの濃度を段階的に上げて添加しました。また、形質転換胚のイメージングを自動化する方法を示し、認知ネットワーク技術に基づく独自に設計したアルゴリズムを用いて画像を解析しました。このアプローチにより、線維芽細胞増殖因子シグナリングの低分子活性化剤の効果を、段階的に定量測定することができました。この手順を行う際は、個体間のばらつきを最小限に抑えるために、胚を慎重に選択することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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生物学

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3 次元 (3 D)-高スループット ゼブラフィッシュ胚配列複写のためテンプレートを印刷

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