ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

このビデオでは、ゼブラフィッシュ胚を用いて、低分子化合物による線維芽細胞増殖因子（FGF）Ras-MAPKキナーゼ経路の調節を評価するための、画像ベースの高コンテンツスクリーニングを実施します。まず、遺伝子組み換えオスと野生型メスのゼブラフィッシュをブリーディングケージ内で交配させます。受精卵は底に沈むため、これを回収してペトリ皿に移します。胚を一晩インキュベートした後、96ウェル丸底プレートの各ウェルに配置します。

小分子BCIを添加してFGFシグナルを過剰活性化し、プレートを6時間インキュベートします。各ウェルから共焦点プレートリーダーで画像を撮影し、自作のアルゴリズムを用いて解析することで、特定の胚構造における蛍光強度を算出します。こんにちは、ピッツバーグ大学微生物学・分子遺伝学部のMichael Chang博士の研究室のHiba Kadoです。

ピッツバーグ大学創薬研究所のAndrea Spockです。本日は、化学物質処理のためにゼブラフィッシュ胚を交配、選別、およびアレイ配置する手順について説明します。96ウェルプレートを用い、線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor）活性を報告するトランスジェニック胚を使用し、このパスウェイを過剰活性化させる分子で処理します。

本ビデオでは、ハイコンテンツスクリーニング法を用いて、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚における線維芽細胞増殖因子活性を自動的に取得、解析、および定量化する方法を解説します。この手順では、トランスジェニックゼブラフィッシュとハイスループット化学スクリーニングを活用するためのプラットフォーム技術について重点的に説明します。それでは始めましょう。

処置の2日前、ホモ接合体雄のトランスジェニックゼブラフィッシュを選別し、個別の交配タンクに入れます。タンクにセパレーターを設置し、その後、各タンクに野生型雌の魚を加え、28°Cの交配ケージ内で一晩保持します。翌朝、セパレーターを取り除きます。1時間後、魚を新しいタンクに移し、胚をプラスチック製シフターに濾します。

胚をE3溶液が入った100 mmディッシュに移し、28 °Cで6〜8時間インキュベートします。インキュベーション後、実体顕微鏡下で胚を観察します。ガス形成段階にある胚が、実験に適した個体となります。

この時点で、単細胞期のままの受精していない胚を取り除きます。また、不透明なものや形態に異常がある生存不能な胚も取り除いてください。その後、新鮮なE three溶液を加え、28 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、胚を蛍光実体顕微鏡下に置き、発生段階が均一で同様のステージである形質転換胚を分取します。受精後 24 時間（24 HPF）で GFP 発現が見られる胚は、強い GFP 発現を伴う中脳後脳境界が視認でき、GFP 陽性の背側網膜を持つ形態の整った眼が観察されます。これらの胚は活動的であり、プラスチック製パステールピペットを用いると、卵膜の中で動き、身をよじらせます。

24 HPFの胚を、96ウェルプレートの各ウェルに1つずつ移します。マイクロピペットを用いて、ウェル内の余分なE three溶液を取り除きます。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに200 µLのE three溶液を加えます。

次に、1列目と12列目のすべてのウェルに2 µLのDMSOを加えます。続いて、DMSOで調製したBCLを次のように2 µLずつ加えます。2列目と7列目に1 µM、3列目と8列目に5 µM、4列目と9列目に10 µM、そして20 µMをそれぞれの列に加えます。

5列目と10列目にμMを、最後に6列目と11列目に25 μMを分注します。次に、プレートをアルミホイルで覆い、28 °Cで6時間インキュベートします。

30 HPFの胚を麻酔するために、各ウェルに10 µLのtricaを添加します。次に、プレートをMolecular Devices Image Express UltraのOpen Meta Expressソフトウェアにセットします。Forex対物レンズと最大ピンホール径の構成を選択してください。

レーザーのオートフォーカスを設定してプレート底面を検出し、あらかじめ決定した最適なZオフセットを使用します。関心領域を検出するために、スキャン領域をビニングなしの2000×2000ピクセルのシングルサイトに設定します。適切なプレートタイプを選択し、励起波長488 nm、蛍光波長525 nmの488 nmアルゴンレーザーを選択します。

次に、ベヒクル処理した胚を含むウェルを選択し、[find sample]をクリックします。装置がオートフォーカススキャンを実行し、適切に画像が取得できているかを確認するために単一の画像を取得します。ベヒクル処理したウェルをランダムに選択し、画像を取得してください。

画像にピントが合い、頭部でGFP発現が確認できれば、最も明るい領域にカーソルを合わせ、蛍光強度が16ビットカメラの範囲内（65,000ユニット未満）であることを確認してください。

これらの手順を、別のビークルコントロールおよび数個の化合物処理ウェルで繰り返します。必要に応じて、ポジティブコントロール画像の最も明るい領域が飽和しないよう、レーザー出力とゲインを調整してください。次に、プレート取得および制御ウィンドウで［acquire plate］を選択し、プレートスキャンを開始します。

装置はマイクロプレート全体の各ウェルにつき1枚の画像を自動的に取得し、SQLサーバーデータベースにアーカイブします。スキャンが完了したら、slingerオプションを有効にしてDeveloperを開き、画像をD definitionにアップロードしてください。

新しいワークスペースを作成します。次に、ファイルメニューから「customized import」を選択します。続いて、画像が保存されているフォルダに移動し、サンプルファイルを開きます。

Molecular Devices Image Express Ultraプラットフォームによって生成された画像形式およびファイル構造を認識するインポートフィルターを選択します。次に、画像を処理するためにコントロール画像を開き、目的のCognition Network Technology（CNT）アルゴリズムまたはルールセットをロードします。ここで使用するカスタムアルゴリズムは、胚、卵黄、および頭部を自動的に識別し、GFPを発現している頭部構造の輝度と面積を定量化するように設計されています。頭部および卵黄の検出ステージまでルールセットを実行してください。

卵黄嚢と頭部の適切な割り当てを確実にするため、卵黄が大きすぎるか小さすぎる場合に卵黄検出閾値を調整するようにルールセットを変更します。次に、明るい頭部構造の検出段階までルールセットを実行します。頭部におけるGFP発現領域を適切に割り当てるため、明るい頭部構造の検出結果が視覚的観察と一致するまで、頭部構造検出閾値を平均強度の倍数として調整し、ルールセットを変更します。

次に、Vehicle処理した胚から生成されたランダムに選択したいくつかの画像と、PCI処理した胚からのポジティブコントロール画像に対して、ルールセット全体を手動で実行します。すべてのプレート画像に対してアルゴリズムを実行するには、解析するプレートを選択して「Analyze」を選択し、最適化されたルールセットに移動してすべてのウェルを解析します。

統合ジョブスケジューラを使用することで、スキャン中の解析から空のウェルや不明瞭な画像が自動的に除外されます。継続的に更新されるキープマップが表示されます。また、実行中にデータと画像の両方にアクセスし、視覚的な確認を行うことができます。

数値データと処理済み画像は自動的に保存されます。すべての画像の解析が完了した後、データはExcel、GraphPad、またはPrismなどのサードパーティ製ソフトウェアにエクスポートできます。この図は、CNT解析ありおよびなしの状態における、対照群（vehicle treated）およびBCI処理群のアーカイブスキャン画像を示しています。

導入された緑色蛍光タンパク質（GFP）が、形質転換胚の眼、中後脳境界、および三叉神経節で検出されています。GFPの強度と発現領域の両方が拡大していることに注目してください。ここでのBCI処理胚では、形質転換胚におけるGFPリポーター遺伝子の発現に対し、BCIの用量依存的な影響が見られます。

半最大反応を誘発するために必要な濃度、すなわちEC 50は約12 µMでした。ここまで、形質転換ゼブラフィッシュ胚の繁殖、採取、および96ウェルプレートへの配置方法について説明しました。シグナル伝達経路の活性化剤として、PCIの濃度を段階的に上げて添加しました。

また、トランスジェニック胚のイメージングを自動化する方法を示し、認知ネットワーク技術に基づいたカスタム設計のアルゴリズムを用いて画像を解析しました。このアプローチにより、線維芽細胞増殖因子シグナリングの低分子活性化剤の効果を、段階的に定量的に測定することができました。この手順を行う際は、個体間のばらつきを最小限に抑えるために、胚を慎重に選択することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。