ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

この手順の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの幼生のエストロゲン応答性細胞を自動的に検出することです。これは、最初に5匹のX-E-R-E-G-F-P成魚を繁殖させて、エストロゲンレポーターゼブラフィッシュの胚を生成することによって達成されます。次に、胚を96ウェルプレートの個々のウェルに入れます。

その後、エストロゲンが胚のプレートに加えられます。最後に、プレートの蛍光を、電動ステージを備えたエピ蛍光顕微鏡を使用して蛍光をスキャンします。最終的に、蛍光顕微鏡法を使用して、エストロゲン受容体の組織特異的な活性を示します。

したがって、ハイスループットやハイコンテントスクリーニングなどの他の従来の技術よりもこの技術を使用する主な利点は、ゼブラフィッシュの幼生の組織特異的蛍光を標準的なエピ蛍光顕微鏡だけでイメージングできることです。電動ステージを装備しているため、専用のプレートリーダーは必要ありません。注意:BPAとエストラジオールを含む化学物質は危険であり、人間の胎児に悪影響を与える可能性があります。

内分泌かく乱物質の取り扱いには注意し、常に適切な個人用保護具を使用してください。このデモンストレーションでは、ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュの繁殖後受精後48時間から開始し、エストロゲン17ベータエストラジオール、ビスフェノールA、およびゲニンにさまざまな用量で曝露され、卵を収集して同一視されます。治療当日のテキストによると、希釈液の薬液を解凍し、E3BプラスPTU渦の1ミリリットルに1〜1000

車両制御として。E、3、B、およびPTUでDMSOの1〜1000希釈を、大口径プラスチック転写剤を使用して使用します。ピペットでウェルごとに3つの胚を96ウェルプレートに移し、条件ごとに3つのウェルを準備します。

長期間の治療中に培地が蒸発するのを防ぐために、胚を外側のウェルに置くことは避けてください。胚の乾燥を避けるために迅速に作業し、各ウェルから培地を取り出し、200マイクロリットルのよく混合された処理溶液を追加します。すべての胚が溶液に沈められ、ウェルの側面に付着していないことを視覚的に確認します。

胚を摂氏28.5度で72時間インキュベートします。受精後、トリカ1ミリリットルあたり4ミリグラムの10マイクロリットルを追加することにより、胚に麻酔をかけます。それぞれに、96ウェルプレートを電動ステージにしっかりと置き、Zeiss Zen Blue 2011ソフトウェアを使用します。

サンプルキャリアオプションを選択し、マルチウェル96を選択してステージを校正します。次に、段階的な指示に従う前に、10倍対物レンズと明視野またはBF設定を使用してキャリブレーションを選択し、ポジティブコントロール胚を特定し、BFおよびGFPチャネルの露出設定を適切に設定して、蛍光信号がカメラを飽和させていないことを確認します。1つの胚に焦点を当て、顕微鏡をプログラムして、現在の焦点面から50マイクロメートル上の画像と50マイクロメートル下の画像を含む合計3つのZセクションを取得します。

次に、GFPおよびBFチャネルを使用してタイル画像を取得するためのソフトウェアパラメータを設定します。[取得] タブで、[詳細設定] を選択し、 [タイル領域] を選択し、次に [タイル] を選択します。円を選択します。

ウェルオプションは、キャリアとフィルファクター90%を選択して、選択したウェルの複数の画像をキャプチャし、各ウェルの面積の90%が合成画像に表示されるようにします。[オプション]で、画像間のシームレスな継ぎ目を可能にする5〜10%など、必要なオーバーラップの量を選択します。次に、イメージングを開始し、20倍対物レンズとBF設定を使用して手動で画像をキャプチャし、ポジティブコントロール胚を同定します。

先ほどと同様にBFとGFPの設定を行い、画像を撮影します。この図は、96ウェルプレートの個々のウェルからの合成画像を示しています。各画像は、59 個の個別の画像で構成され、5% の画像が重なっています。

生きたゼブラフィッシュは、各ウェル内でランダムに配向されていることに注意してください。しかし、私たちは心臓の蛍光と肝臓の蛍光を区別することができます。明視野画像は、ゼブラフィッシュの向きを評価し、形態学的異常を視覚化するための参考資料として有用です。

ここに示されている画像は、より詳細な分析のために20倍の長作動距離対物レンズで撮影されたもので、顕微鏡ステージからプレートを取り外すことなく、示したばかりの自動スキャンの直後に撮影されました。20倍対物レンズを使用すると、心臓の蛍光を矢印で示された心房心室弁と矢印で示された大動脈弁に正確に局在させることができます。この技術を習得すると、1日あたり3,96枚のウォールプレートから画像をキャプチャできます。

内分泌かく乱化合物の取り扱いは危険な場合があるため、この手順を実行するときは、適切な個人用保護具を着用するなど、常に適切な予防措置を講じてください。