Name: 初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 52 s
Description: 学ぼう、ゼブラフィッシュ幼生を用いた低分子スクリーニングと形態学的評価による薬物毒性試験の手法。心膜浮腫や発達遅延などの表現型変化を観察し、発生生物学と薬理学研究に貢献します。

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<ol><li>Teame, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models.</a> Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).</li>
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<li>Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+disease+models+in+drug+discovery%3A+From+preclinical+modelling+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).</li>
<li>Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+behavior+in+zebrafish+larvae%3A+Effects+of+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding.</a> Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).</li>
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<li>Tonelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+resourceful+vertebrate+model+to+investigate+skeletal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Test+no.+236%3A+Fish+embryo+acute+toxicity+%28FET%29%22">Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET)</a>. , (2013).</li>
<li>Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fluorescent+staining+platform+for+drug-screening+and+mechanism-analysis+in+zebrafish+for+bone+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization.</a> Molecules. 22 (12), 2068(2017).</li>
<li>He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanisms+of+prednisolone-induced+osteoporosis+in+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva.</a> Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).</li>
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<li>Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+of+primary+patient+derived+tumor+xenografts+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish.</a> J Vis Exp. (158), e60996(2020).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+zebrafish+in+systems+toxicology+for+developmental+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Congenit+Anom+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing.</a> Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).</li>
<li>Hayot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+toxicity+of+chemicals+using+a+zebrafish+vibration+startle+response+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system.</a> J Vis Exp. (203), e66153(2024).</li>
<li>Hoyberghs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+concentrations+up+to+1%25+are+safe+to+be+used+in+the+zebrafish+embryo+developmental+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay.</a> Front Toxicol. 3, 804033(2021).</li>
<li>Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+the+management+of+patients+treated+with+bosutinib+for+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Hematol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia.</a> Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL微量遠心チューブ</td><td>Starlab</td><td>E1415-1510</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;Lマイクロピペット (P10)</td><td>ギルソン</td><td>F144802&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10月20日 & マイクロ;Lピペットチップ</td><td>Starlab</td><td>S1110-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 & マイクロ;Lマイクロピペット(P1000)</td><td>ギルソン</td><td>F123602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 &マイクロ;Lピペットチップ</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7512</td><td>滅菌済み、シングルラップ、未処理、蓋付き</td></tr><tr><td>20 &micro;Lマイクロピペット (P20)</td><td>ギルソン</td><td>F123600&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;Lマイクロピペット(P200)</td><td>ギルソン</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;Lマルチチャンネルピペット&nbsp;</td><td>ギルソン</td><td>F81024</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;Lピペットチップ</td><td>Starlab</td><td>S1113-1006</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>滅菌、シングルラップ、平底、未処理、蓋付き</td></tr><tr><td>内側グリッド傾斜底、タンク仕切り、蓋付き</td><td>Tecniplast</td><td>ZB17BTISLOP、ZB17BTE、&nbsp;ZB17BTL、</td><td>ZB17BTD傾斜インナータンク</td></tr><tr><td>メッシュストレーナー</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>メルカトル</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>ペトリ皿&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>CC7672-3394/CC7672-3359</td><td>100 x 20 mm or 60 x 15 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ M205 FCA 蛍光実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>ペルチェ冷却インキュベーター(ライトモジュール付き棚2個付き) コールドホワイト</td><td>Memmert</td><td>IPP110ecoplus, T8</td><td>デイ/ナイトサイクル</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>を装備 ジ<tr><td>メチルスルホキシド</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>504341000</td> E3塩化カルシウム二水和物<td>に1%溶液を調製する</td></tr><tr><td></td><td>Biochem Chemopharma</td><td>303080500</td><td>E3</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td>を調製する <td>Biochem Chemopharma</td><td>313060500</td><td>E3</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>を調製する <td>Biochem Chemopharma</td><td>316030500</td><td>E3</td></tr><tr><td>SCREEN-WELL&nbsp;Wnt Pathway library (Bosutinib)</td><td>Enzo</td><td>BML-2838-0500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3161/53</td><td>E3 を調製する</td></tr></tbody></table>

初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

異常は、7 dpf まで、実験タイムライン全体で個別または累積的に調べることができます。異常ごとの最大形態スコアを使用して、形態学的異常を使用される幼虫の数のパーセンテージとして計算できます。たとえば、7 日目に心膜浮腫の形態スコアがスコアラー 1 と 2 でそれぞれ 19 と 20 の場合、可能なスコアが 24 の場合、つまり 24 匹のうち 19 匹または 20 匹の幼虫が心膜浮腫を示している場合、パーセンテージ スコアは次のように計算できます。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67759/67759eq1.jpg">
補足表S1 は、慢性骨髄性白血病の治療に適応されるチロシンキナーゼ阻害剤である化合物ボスチニブの毒性試験後の4 dpfでの形態学的スコアリング結果(両方のスコアラー)を示しています15。同じ形態スコアリングが、5 dpfから7 dpfの露出魚に対して繰り返されます。この化合物は、100 μMから6.25 μMの濃度範囲を使用して試験しました。異なる時点で3回の技術的反復が行われ、7 dpfでの平均累積死亡率を使用して、幼虫の50%が生存する濃度であるLC50を決定しました。LC50 は、任意の露光時間時点で測定できます。ただし、これを 7 dpf で計算することをお勧めします。
7 dpf での累積平均死亡率を使用して、図 3 に示す LC50 曲線を生成しました。ボスチニブの場合、LC50濃度は37.95μMと推定されました。
注:この推定LC50 濃度は、このモデルシステムに厳密に適用され、その後、さらに下流の表現型アッセイに使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig1.jpg"> 
図1:3-7 dpfでの幼虫における提案された薬物スクリーニングの概略図。 96ウェルテストプレートは、化合物ボスチニブの100 μMから6.25 μMまでの5つの濃度の調査用にセットアップされています。略語:dpf =受精後日数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig2.jpg"> 
図2:ゼブラフィッシュの幼生に観察された代表的な形態学的欠陥、5dpfでさまざまな化学物質濃度に曝露されたとき(曝露後2日で)。(A)対照(影響を受けない)ゼブラフィッシュ、(B)軽度の心膜浮腫を示すゼブラフィッシュの幼生、(C)重度の心膜浮腫と卵黄出血を伴うゼブラフィッシュ、(D)発達遅延、色素沈着の減少、小さな遊泳膀胱を伴うゼブラフィッシュ、(E)卵黄が腫れ、尾びれがねじれたゼブラフィッシュ、(F)尾びれがないゼブラフィッシュ、(G)湾曲した脊索を持つゼブラフィッシュ、(H)尾が切り詰められたゼブラフィッシュ、 (I)壊死したゼブラフィッシュの死骸。欠陥は赤い矢印で示されます。スケールバー = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig3.jpg"> 
図3:死亡率に対する濃度を示すLC50曲線。試験した5つの濃度は、100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、および6.25 μMであり、死亡率はそれぞれ100%、100%、29.2%、12.5%、および12.5%でした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>形態学的欠陥</td>
			<td>形容</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心膜浮腫</td>
			<td>心臓の周囲に体液が溜まり、心臓が伸び、血液循環が機能不全になる</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心拍数(分あたり)</td>
			<td>1分あたりのビート数の削減</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>黄身</td>
			<td>-心臓の欠陥と同時に発生する可能性のある卵黄浮腫または出血の有無</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>卵黄エクステンション</td>
			<td>腫れている、薄い、または存在しない卵黄</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>湾曲した脊索</td>
			<td>ねじれた、または起伏のある脊索、および/または湾曲した尾の存在</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鰾</td>
			<td>水泳用膀胱の存在、不在、または部分的な発達</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>色素沈着</td>
			<td>メラノサイトは、同じ年齢の未処理の魚と比較して少ないか、まったくありません</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>壊死</td>
			<td>-体のいずれかの部分に壊死の存在(軽度または重度)または欠如</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>開発の遅れ</td>
			<td>同じ年齢の野生型コントロールと比較して、開発が遅れたり、停滞したりしました。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>タッチへの反応</td>
			<td>驚愕後の応答の遅延または応答なし(ピペットチップの使用など)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>切り捨て</td>
			<td>後部ゼブラフィッシュの体がない(つまり、尾の形成)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>フィン</td>
			<td>薄い卵黄の伸展を伴う可能性のある尾びれの有無</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体軸の縮小</td>
			<td>正常に見える魚は、測定すると体長が短くなります</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:薬物曝露研究後に観察できる視覚形態学的欠陥のリスト。
補足表S1: 4 dpf(曝露後1日)でのボスチニブの代表的な形態学的結果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/SupplementalTable_1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...

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