トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

次の実験の全体的な目標は、InVivoモデルシステムにおけるベータアミロイドペプチドの毒性をアッセイすることです。このアッセイの再現性と比較的簡便なため、薬物、環境条件、またはベータアミロイド毒性の遺伝子修飾を迅速に試験できます。このアッセイを開発する上で重要な要素は、ベータアミロイドペプチドの筋肉特異的な温度誘導性発現を持つトランスジェニックclイーガン線虫の生成です。

この温度感受性発現は、異常に長い3つの主要な非翻訳領域を含む導入遺伝子を構築することによって操作され、導入遺伝子mRNAをmRNA監視の標的にするこの導入遺伝子の発現は、したがって、導入遺伝子mRNAの分解による機能的なmRNA監視システムを持つ野生型の線虫では不十分です。この導入遺伝子が、mRNAサーベイランスシステムの必須成分に変異を含む遺伝的背景に導入されると、導入遺伝子の発現は大幅に高くなる。遺伝的背景がmRNA監視システムに温度感受性変異を含んでいる場合、このトレンチジェニック株の非許容温度での増殖は、トレンチ遺伝子mRNAの分解をブロックし、このシステムを使用してベータアミロイドペプチドの体壁筋肉発現を調節する高トレンチ遺伝子発現トレンチジェニックワームをもたらします16°Cから25°Cへの温度上昇、 その結果、筋肉細胞のベータアミロイドペプチドの機能不全と線虫の麻痺が大量に蓄積し、時間の測定が行われます。

これらのトレンチジェニックワームの集団は、温度後に麻痺します。Upshiftは、ベータアミロイド毒性の高感度アッセイです。これは、麻痺アッセイ用の新鮮な線虫増殖培地プレートを作成することによって達成され、麻痺率に影響を与える可能性のある環境変数を最小限に抑えるのに役立ちます。

第2のステップとして、トレンチジェニックワームの年齢同期した集団を開始または開始し、これにより、導入遺伝子発現に対する発生段階の影響が最小限に抑えられます。次に、同期した第3幼虫期の幼虫が摂氏16度から摂氏25度に上昇し、導入遺伝子mRNAの安定性が向上し、ベータアミロイドペプチドの蓄積につながります。各線虫のアップシフトから麻痺までの時間を測定すると、筋肉機能障害の速度が捕捉され、それによりベータアミロイドペプチド蓄積の毒性効果をアッセイし、内因的に発現したベータアミロイドペプチドの毒性に対する特定の治療の効果を示す結果が得られます。

ですから、トランスジェニックマウスモデルを使用して薬物活性をアッセイするのとは対照的に、私たちの技術の主な利点は、はるかに迅速かつ安価にアッセイできることです。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。麻痺アッセイにおけるL 4匹の線虫のスコアリングは、習得するのが非常に困難です。

したがって、麻痺したL4ワームを採点しているとき、見たいのは、ワームの頭部領域の孤立したハローの動きです。それが動き出し、ワームの全身が麻痺すると、そのワームは麻痺しているとスコア付けされます。麻痺エッセイは、CLイーガンの増殖と遺伝学に日常的に使用される標準的な線虫増殖培地またはNGMのプレートで実行されます。

プレートオートクレーブを調製するには、三角フラスコに塩化ナトリウム、寒天、ペプチドを含むNGM溶液を添加し、添付の書面によるプロトコルに記載されている以下の滅菌溶液を適量追加します。10ミリリットルの液体NGMを各60ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿に分注します。NGMを室温で一晩固化させます。

化合物または抽出物の影響をテストする場合は、抽出物を各プレートに分注し、スプレッダーを使用してプレートの表面に均一に分散させます。プレートを室温で一晩乾燥させます。1ミリリットルを超える容量は、乾燥にさらに時間がかかります。

次に、各プレートに250マイクロリットルの大腸菌株OP 50をLB培地で一晩成長させ、光学密度0.4〜0.6にし、細菌を室温で一晩乾燥させます。プレートの年齢は麻痺率に大きな影響を与えるため、古いプレートは乾燥する傾向があります。プレートは、麻痺アッセイから1週間以内に注ぐ必要があります。

理想的には、あなたは、任意の実験で使用される同期卵の産卵プレートの前に3〜4日前に注がれたプレートを使用したい、芝生のサイズを変更する同じバッチから来るべきであり、または細菌もワームの挙動を変更します麻痺アッセイは、代替の大腸菌株を使用して行うことができます。例えば、HT one 15はRNAi実験で使用されます。ただし、これにより麻痺アッセイの動態が変わる可能性があります。

したがって、適切なひずみである内部統制を使用する必要があります。CL 476は、ベータ誘発性麻痺のアッセイに最も一般的に使用されます。この株と他のトランスジェニックモデルは、Saint Ahadi Genetic Centerからわずかな料金で学術研究者に提供されています。

テスト母集団の年齢同期性を最大化するためには、それが好ましい。同期された親世代から開始します。試験集団の麻痺アッセイを開始する1週間前に、プラチナワームピッカーを使用して、20〜30人の重篤な成体を数枚の10センチメートルNGMプレートに移します。

OP 50で2時間広げ、CL 4 1 76の許容温度である摂氏16度で卵を産みます。GRの成虫を取り除き、子孫を7日間成長させ、その時までに彼らは2日目の墓の成虫になります。2日目の重力。

成人は、各実験条件の年齢同期テスト母集団を準備するために使用されます。目的は、プラチナウォームピッカーを使用して50〜75歳の同期ワームを含む三重プレートを生成することです トランスファー 10 から 12 日の、2つのより重い成虫をOP 50でスポットされた60ミリメートルのNGMプレートに。ワームが摂氏16度で2時間産卵するのを待ってから、成虫を選び、卵が孵化して摂氏16度で成長するのを待ちます。

この時点では、プレートをスコアリングしない人にコーディングしてもらうのが最善であり、スコアが実験条件に対して盲目になります。卵が産まれるときの胚発生の段階は、最適な条件下での野生型線虫の約26細胞段階であり、成虫の年齢と栄養の関数です。産卵に使用された重力成虫が高齢であるか飢餓状態の場合、後段の卵が産まれ、同期個体群が達成されないため、麻痺アッセイの動態に影響を与えます。

あらゆる種類の細菌汚染がこのアッセイに深刻な影響を与える可能性があるため、大腸菌、OP 50などの単一遺伝子細菌培養物を使用することが不可欠です。再現性は、トリプリケートプレートが同数の寄生虫を持っている場合に最も高くなります 導入遺伝子を誘導し、麻痺アッセイを実施します。プレートを摂氏25度にアップシフトします。

同期卵の終了後48時間で、産卵虫は3番目の幼虫期になるはずです。プレートは、プレートがこの温度に達するように、摂氏25度のインキュベーターに積み重ねずに配置する必要があります。同時に、アップシフトが開始されてから18〜20時間後に、ワームの麻痺のスコアリングを開始します。

この時点で、集団内のすべての線虫は4番目の幼虫段階に達しているはずであり、各プレート上のすべての線虫が麻痺するまで2時間刻みでスコアリングを続けます。理由は不明ですが、麻痺は体の長さを超えてさえありません。頭部領域は、ワームの最後の部分で動きを止めます。

したがって、最近麻痺を始めた線虫は、プレートを横切って移動することはできませんが、頭を動かすことができるため、前部の周りの細菌が一掃され、一掃された細菌のハローが残ります。これらのワームは常に完全に麻痺するため、ハローのあるワームは麻痺していると特徴付けられます。一部のワームにはハローがありませんが、自発的な動きも示されません。

これらは、ワームピッカーで突いてテストされます。突き刺さった線虫が突っ込んだときに全身の波動伝播を起こせない場合、効率的なスコアリングのために麻痺しているとスコアリングされます。麻痺したワームをプレートの斑点のないセクターに移動するのが最も簡単で、次のスコアリング期間で意図せずに再スコアリング

これにより、誤って分類されたワームが動きを示すこともでき、スコアリング補正によって麻痺曲線を生成できます。各時点で、麻痺していない各プレート上の線虫の割合がパーセンテージに変換され、アップシフトが開始された時点からの時間に対して比類のない平均パーセンテージがプロットされます。結果として得られる曲線は、形式的には生存曲線に類似しているため、標準的なノンパラメトリック生存統計を使用して分析できます。

麻痺を開始するためには、トランスジェニックmyo three AベータワームのアップシフトをL4ステージ半ばまでに実行する必要があります。Myo 3プロモーターは発達的に調節されています。線虫がL4後期または成虫期に達すると、発現レベルは大幅に減少します。

線虫が飢餓状態になると、導入遺伝子の発現がブロックされるため、実験全体を通して線虫に十分な栄養を与えることが非常に重要です。麻痺した線虫がどのような条件下でも回復するのを観察したことはありません。シフトアップの12〜16時間後、CL 41 76は麻痺しますが、ひずみで16度にシフトダウンしても、CL 41 76は麻痺を引き起こす導入遺伝子発現のアップレギュレーションが低温で発生する可能性があります。

ただし、そのタイミングで麻痺率に影響が出ますのでご注意ください。麻痺率は、使用する特定の導入遺伝子株によって異なります。私たちは、CL 41 76よりも麻痺速度が速く、より遅いmyo three Aベータ株を構築したため、麻痺アッセイのスコアリングウィンドウをそれに応じて調整する必要があります。

ここに示されているのは、未治療のCL 4 1 76と6.27ミリモルのカフェインに曝露された麻痺曲線のプロットです。この治療により、麻痺の遅延が統計的に非常に有意に約4時間発生し、ベータ毒性の抑制を示していると解釈しています。このモデルでは、この実験はコーヒーに含まれる別の化合物の影響を分析しました。

プロットは、ベータ毒性に影響を与えない治療に典型的です。両方の実験において、未治療のCL4 1 76集団の約半分が24時間で麻痺し、麻痺が28時間で完了することに注意してください。これらは、制御の麻痺の典型的な時間枠です。

CL 4 1 7 6 集団のこのタイミングからの有意な逸脱は、環境条件の変化または導入遺伝子コピーの自然欠失を示している。CL 4 1 76株に関する追加情報については、添付のプロトコルを参照してください。この手順を試みる際には、プレートの年齢、ワームの個体数のステージ、およびワームの麻痺率をスコアリングする能力に留意することが重要です。

このビデオを見た後、このウミエルガンシステムを使用してベータアミロイド毒性を慎重に分析する方法がよくわかるはずです。さまざまな環境治療や薬物治療のこの毒性に対する非常に微妙な影響を検出できるはずです。これまでお話ししてきた変数は、非常に再現性が高く、一貫した麻痺動態でアッセイを行うことができるため、注意を払うことが重要です。

これは、さまざまな人が異なる時間にラボで行った結果を比較したい場合や、このモデルシステムを使用して結果を他の研究者と比較する場合に、実際には非常に重要です。