Name: トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 学ぶβ-アミロイド毒性アッセイ法。Caenorhabditis elegansを用いた温度誘導型筋肉特異的発現システムにより、麻痺表現型を指標に薬剤や遺伝子変異の影響を迅速かつ低コストで評価できます。

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我々は、プロトコルの開発を支援し、特に、ここで元のプロシージャを開発したジンフォンテを、説明したリンクのラボの現在および過去のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、NIH（AG12423）とアルツハイマー病協会（ゼニス賞）からCDLへの表彰ではサポートされています

1）麻痺のアッセイのために線虫の増殖培地のプレートを準備。 麻痺のアッセイは、日常的にCのために使用される標準的な線虫の成長メディア（NGM）プレート上で実行されます線虫伝播と遺伝学（Stiernagle、2006）。 <ol><li>三角フラスコ中のNaCl、寒天とペプトンを含むNGMソリューションをオートクレーブし、無菌のCaCl 2、ウラシル、コレステロール、1M MgSO 4で1M KPO 4の適切な量を追加します。各60ミリメートル× 15ミリメートルシャーレに液体NGMの一定分量を10mL。 NGMは、室温で一晩固化することができます。 </li><li>化合物/抽出物の効果のためのテストの場合、分注し、各プレート上に抽出し、均一にプレートの表面上に抽出液を配布するために、スプレッダを使用してください。室温で一晩乾燥させて抽出することができます。 1 mLの上のボリュームは、乾燥に時間がかかります。 </li><li> E.の250μLで各プレートを見つける大腸菌株のOP5Oは0.4〜0.6の光学密度のため一晩LB培地で増殖させた。細菌は室温で一晩乾燥することができます。 </li></ol>関連する変数古い板が乾燥する傾向があるので、プレートの年齢は、麻痺の検定に大きな影響を及ぼす場合がある。麻痺アッセイの一週間以内に注がプレートを使用してください。理想的な結果を得るためには、同期ワーム集団の開始前に3-4日は、[（2）を参照してください]プレートを注ぐ。どんな実験では、同じバッチから注がプレートをのみを使​​用してください。 芝生のサイズ（すなわち斑点対スプレッド）及び/または細菌の種類を変更すると、またワームの動作を変更します。麻痺のアッセイは別のEを使用して行うことができます。 大腸菌の食料源（例えば、RNAi実験を餌に使用されるHT115歪み）などの系統が、これは、このように、適切な内部統制を必要とする、麻痺の速度を変更することができます。 年齢同期ワームの個体群の2）の調製ひずみCL4176（SMG - 1（cc546 TS）I; dvIs27 [ミオ- 3 /はAβミニジーン+ ROL - 6（su1006）マーカー遺伝子] Xは、最も一般的にAβ誘発性麻痺をアッセイするために使用され、この菌株と他のトランスジェニックモデルが利用可能である。 線虫遺伝学センター （http://www.cbs.umn.edu/CGC/）からわずかな料金で学術研究者に。 <ol><li>テストの人口の年齢の同期を最大化するためには、同期された親世代から始めるのが好ましい。週間前には、試験集団の麻痺アッセイを開始、16歳でレイアウト2時間の卵のためOP50で広がる数十cmのNGMプレート上に20〜30妊娠成人を転送するためにプラチナのワームピッカーを使用して° C（CL4176のための許容温度）。妊娠成人を削除し、子孫がその時点で彼らは妊娠成人"二日目"となる、7日間に成長することができます。 </li><li> （1日目）二日目の妊娠大人の年齢同期テストの集団を調製するのに使用されています。各実験条件の場合、オブジェクトが50〜75歳同期ワームを含む三連のプレートを生成することです。プラチナのワームピッカーを使用して、60ミリ（10 mLの体積）OP50をスポットしたNGMプレート上に2日目妊娠成人の10-12を転送する。ワームはその後、大人を狙い撃ちし、卵が孵化することができますし、16で成長し、2時間16℃で産卵のために℃に許可するこの時点ではそれらをコーディングするためにプレートをスコアリングされることはありません誰かを持っていることが最善である、得点王は、実験条件に盲目になるように。 </li></ol>関連する変数卵が配置されている胚発生の段階（最適な条件の下で野生型のワームのための〜26細胞期）は、成人年齢と栄養の関数です。試験集団の調製に使用される妊娠大人が古いまたは飢餓の場合は、後の段階の卵は、人口の年齢の同調性と麻痺の動態の再現性を減らす、レイアウトされます。それは（微生物汚染が深刻なこのアッセイに影響を与えることができる）が使用されているモノ - 無菌（すなわち、のみOP50細菌）の培養より本質的なさ、そして三重のプレートは、ワームの似たような数字を持っている場合、再現性は最高です。 3）導入遺伝子の誘導と麻痺アッセイ<ol><li> （3日目）25〜アップシフトプレート℃で48時間同期卵の産卵終了後、ワームは、サード幼虫（L3）になっているはず。プレートは、全てのプレートが同時に25℃に達するように25℃インキュベーターでスタッキングすることなく配置する必要があります。 </li><li> （4日目）シフトアップの開始後18〜20時間でワーム（株CL4176）の麻痺の得点を開始します。この時点で、人口のすべてのワームは第幼虫（L4）の段階に達している必要があります。プレートの各上のすべてのワームが麻痺しているまでは2時間単位でスコアリングを続ける。理由は不明であるが、麻痺があっても、人体の長さを越えていないです：頭部は移動停止するワームの最後の部分です。このように、W最近麻痺を開始したORMはプレートを介して変換することはできませんが、それによって彼らの前方周囲に細菌をクリアし、クリアバクテリアの"ハロー"を残し、彼らの頭を移動することができます。これらのワームは、常に完全に麻痺になるので、ハローを持つワームが麻痺したように分類されます。いくつかのワームは、ハローを持ってされませんが、また自発的な動きが表示されません。これらは、ワームのピッカーでつついによってテストされています。採用を働きかけワームがつついによって全身の波動伝播を受けることができない場合、それはまた、麻痺スコアされる。効率的なスコアリングに、それは彼らが意図せずに次の得点の期間をrescoredされないようにプレートの気づかれていないセクタに麻痺ワームを移動するのが最も簡単です。 （これは、スコアリング補正が可能、誤分類されたワームの動きを実証することができます）。 </li><li>麻痺の曲線を生成するには、各時点で麻痺されていない各プレート上でワームの割合がパーセンテージに変換され、平均的な"unparalyzed"割合は、シフトアップ開始からの時間に対してプロットされる。 （この方法でプロットするための理論的根拠は、結果の曲線は生存曲線に正式に類似しているため、標準的なノンパラメトリックな生存の統計を使用して分析できることです。） </li></ol>関連する変数彼らはミオ- 3プロモーターが的に調節されると、開始する、と大幅に遅れてL4または成虫で発現を減少している麻痺のために半ばL4段階に達する前に、トランスジェニックmyo-3/Aβのワームのシフトアップが発生する必要があります。同様に、この導入遺伝子の発現がブロックされているワームが飢餓になれば、それはワームが実験全体を通して十分に供給されることが不可欠ですので。彼らは16℃にシフトダウンされている場合でも、我々はいかなる条件の下で回復するために麻痺ワームを観察したことがない、とシフトアップの12から16時間後、すべてのCL4176ワームが麻痺されます。ひずみCL4176で、導入遺伝子発現の十分なアップレギュレーションは、麻痺のタイミングが変更されますが麻痺（すなわち、20〜25℃）より低い温度で発生する可能性が生じるため。麻痺率が使用される特定のトランスジェニック系統（我々はCL4176より速く、遅い速度の両方でmyo-3/Aβ株を構築している）に依存するので、別の系統でスコアウィンドウは調整する必要があります。 4）代表者の結果図1に示すように未処理とカフェイン6.27 mMの（NGMプレートに終濃度）に暴露された両方CL4176のための麻痺の曲線のプロットである。この治療法を我々はこのモデルでAβ毒性の抑制のような指標と解釈する約4時間、の麻痺の高度に統計的に有意な遅延の結果。図2に示すようにカフェストール、コーヒーに見られる別の化合物の効果を測定する独立した実験です。このプロットは、Aβ毒性に影響を与えない治療法が一般的です。両方の実験では約半分の未処理CL4176集団が24時間で麻痺し、麻痺が28時間で完了していることに注意してください。これらは、コントロールCL4176集団の麻痺の典型的な時間枠です。このタイミングから大きく逸脱は、変化した環境条件や導入遺伝子のコピーの自発的削除を示すものである。 （CL4176はmyo-3/Aβ導入遺伝子の複数コピーを持つ染色体に組み込まれたトランスジェニック配列を含んでいる。このトランスジェニック配列は通常、非常に安定していますが、高温でのひずみの任意の伝播は、&gt; 16 ° Cで受けた珍しいワームのために選択されますAβ発現と遅い麻痺の結果を減らしているだろう変種で、その結果導入遺伝子の自発的削除、。） <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。未処理または6.27 mMのカフェイン（シグマ）にさらされた菌株CL4176ワームの麻痺の曲線。指示された時間は、温度上昇の開始から取得しています。エラーバーは= SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 0.48 mMのカフェストール（シグマ）にさらされるCL4176ワームの麻痺のカーブ。エラーバーは= SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
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<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちが説明しているプロトコルは効果的にアッセイAβ毒性に対する化合物の影響をするために使用することができます。公開された例では、イチョウ葉エキスの成分（Wu ら、2006）とレセルピン（アーヤら 2009）の効果が含まれています。他のシステムにおけるAβ毒性に対する保護されている化合物はまた、（例えば、メマンチン、私たちの未発表結果）このモデルでは、保護であることが示されている。このモデルを確立するための重要な根拠は、Cでそのよく発達した遺伝子や分子のツールが利用可能です。 エレガンスは、Aβ毒性のメカニズムを調べるために使用することができます。従って、Aβ毒性への影響の特定の変異が分析することができる（例えば、インスリン様DAF - 2の機能喪失変異が、フローレス-マクルーアらを導入することによってシグナル伝達を低減させる効果。2007）、そしてこのモデルこともできます過剰発現トランスジーン（フォンテら 2008）の効果を調べるために使用される。我々は最近、Aβの単一のアミノ酸置換（未発表データ）の毒性への影響を調べるためにこのモデルを広範囲に使用してきた。 トランスジェニックモデルはここにアッセイの筋細胞機能に対する急性Aβ発現の効果を説明した。麻痺の筋細胞とそれらのサルコメアの時にそのまま残っています。麻痺の表現型は、筋肉の細胞死の結果ではない。しかし、麻痺した後（初期シフトアップ後〜48時間）筋肉の整合性やワームの最終的な死の内訳があります。我々はAβ発現のこの下流に及ぼす影響を検討または毒性のマーカーとしてそれを使用していない。 ここで説明した誘導Aβ発現のモデルはそれ自体がβ-アミロイドの形成を調節治療を調査するための適切ではありません。構成的Aβの表現形式容易に検出可能なアミロイドの沈着によるトランスジェニックワームが（フェイら1998;。。リンクら 2001）、誘導Aβの発現とトランスジェニックのワームはほとんどのアミロイド沈着がなく、麻痺の表現型は、アミロイドの沈着（ドレイクらの独立が表示されます。 2003年）。我々の結果は、可溶性オリゴマーAβの蓄積から誘導Aβの発現の結果のビューその急性毒性ではなく、アミロイドの沈着と一致している。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬</td><td> Quantity/2L </td><td>会社/カタログ＃ </td><td>コメント</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 6グラ​​ム</td><td>シグマアルドリッチ/ S9888 </td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td> 40グラム</td><td>シグマアルドリッチ/ A7002 </td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td> 5グラム</td><td>シグマアルドリッチ/ P0556 </td><td></td></tr><tr><td>のddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1MのCaCl 2 </td><td> 2mLの</td><td></td><td>のddH 2 Oで147.02mg/mL </td></tr><tr><td>ウラシル</td><td> 2mLの</td><td></td><td>のddH 2 Oで2mg/mL </td></tr><tr><td>コレステロール</td><td> 2mLの</td><td></td><td>エタノールで5mg/mL（オートクレーブしない） </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4を </td><td> 2mLの</td><td></td><td>のddH 2 Oで246.5mg/mL </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mLの</td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4。のddH 2 O、pHの液、48mg K2HPO4/mL </td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 c.エレガンスモデル

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

β-アミロイドペプチド（Aβ）の蓄積は、一般的にアルツハイマー病の誘導の中心と考えられていますが、毒性の関連機構（s）はまだ明らかではないさ。 Aβは、封入体筋炎、深刻な人間の筋障害で筋肉内に堆積される。激しく研究線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、トランスジェニックヒトAβを発現するように設計することができます。 Aβ発現の組織やタイミングに応じて、トランスジェニックワームは、Aβ毒性の読み出しとして容易に測定可能な表現型を持つことができます。例えば、汎神経Aβの発現とトランスジェニックワームは、欠陥を持っている構成的筋肉特異的発現トランスジェニックワームはプログレッシブ、年齢依存性麻痺の表現型（リンク、1995年を表示しながら、連想学習（Dosanjh ら2009。）であり、Cohen ら2006年）。特に有用なC.エレガンスモデルは、温度上昇（リンクら、2003）によって再現性の麻痺の表現型で、その結果、Aβ遺伝子の温度によって誘発された筋の表現を設計するためのmRNAサーベイランスシステムの温度感受性変異を採用しています。このモデルのカウンタAβ毒性[例えば、保護遺伝子（ハッサンら 2009）やイチョウ葉抽出物への曝露の発現（Wu ら 2006）]再現性これらのトランスジェニックの温度上昇によって誘発される麻痺の速度を変更することが治療法ワーム。ここでは、このトランスジェニックCに麻痺の速度を測定するため、我々のプロトコルを記述するこの測定に影響を与えることができる実験的な変数に特に注意を払って虫モデル 、。

激しく研究線虫<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;は、トランスジェニックヒトβ-アミロイドペプチド（Aβ）を表現するように設計することができます。におけるAβの誘導発現<em&gt; C.エレガンス</em&gt;筋肉は、Aβ毒性を調節する治療法を監視するために使用することができる迅速な、再現性の麻痺の表現型につながる。

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

β-アミロイドペプチド（Aβ）の蓄積は、一般にアルツハイマー病の誘発における中心的な要因であると考えられているが、関連する...

本実験の全般的な目的は、InVivoモデルシステムを用いてベータアミロイドペプチドの毒性を評価することです。このアッセイは再現性が高く、比較的簡便であるため、薬剤や環境条件、あるいは遺伝子改変がベータアミロイドの毒性に及ぼす影響を迅速に検証することが可能です。このアッセイを開発する上での鍵となる要因は、筋肉特異的な温度誘導性ベータアミロイドペプチド発現を持つC. elegansのトランスジェニック虫を作出することです。この温度感受性発現は、異常に長い3'非翻訳領域を含む外来遺伝子を構築することで設計されており、これにより外来遺伝子のmRNAがmRNA監視機構の標的となります。したがって、機能的なmRNA監視機構を持つ野生型虫では、外来遺伝子mRNAの分解が起こるため、この外来遺伝子の発現は低くなります。この外来遺伝子を、mRNA監視機構の必須構成要素に突然変異を持つ遺伝的背景に導入すると、外来遺伝子の発現は著しく高まります。また、遺伝的背景にmRNA監視機構の温度感受性変異がある場合、非許容温度でこのトランスジェニック系統を増殖させると、外来遺伝子mRNAの分解が阻止され、高い外来遺伝子発現がもたらされます。このシステムを用いて体壁筋におけるベータアミロイドペプチドの発現を制御するトランスジェニック虫では、温度を16 °Cから25 °Cに上昇させることで、ベータアミロイドペプチドの高度な蓄積、筋細胞の機能不全、および虫の麻痺が引き起こされます。時間の測定。これらのトレンチジェニック虫の集団が、温度上昇後に麻痺するまでの時間を測定します。温度上昇は、アミロイドベータ毒性を評価するための感度の高いアッセイです。麻痺率に影響を与える可能性のある環境変数を最小限に抑えるため、麻痺アッセイ用に新鮮な線虫増殖培地プレートを作成してこれを実施します。第2段階として、トランスジェニック線虫の年齢を同期させ、発生段階がトランスジーンの発現に及ぼす影響を最小限に抑えます。次に、同期させた第3幼虫期の個体を16 °Cから25 °Cに温度上昇（アップシフト）させ、トランスジーンmRNAの安定性を高めることで、βアミロイドペプチドを蓄積させます。各線虫について、温度上昇から麻痺に至るまでの時間を測定することで、筋肉機能不全の速度を把握し、これによりβアミロイドペプチド蓄積の毒性作用を評価します。得られた結果から、特定の処理が内生的に発現したβアミロイドペプチドの毒性に及ぼす影響を明らかにします。したがって、薬物活性を評価するためにトランスジェニックマウスモデルを使用する場合と比較して、本手法の主な利点は、はるかに迅速かつ低コストで実施できる点にあります。この手法を視覚的に提示することは非常に重要です。麻痺アッセイにおけるL4期のワームのスコアリングを習得するのは非常に困難であるためです。麻痺したL4期の個体をスコアリングする際は、虫の頭部領域のみが独立して動いているかを確認します。頭部は動いているが、虫の体全体が麻痺している場合に、その個体を「麻痺」としてスコアリングします。麻痺アッセイは、C. elegansの維持および遺伝学研究に日常的に使用されている標準的な線虫増殖培地（NGM）プレートを用いて行います。プレートを準備するために、塩化ナトリウム、アガロース、およびペプチドを含むNGM溶液をエルレンマイヤーフラスコに入れ、オートクレーブで滅菌します。その後、付属の書面プロトコルに記載されている適切な量の各滅菌溶液を添加します。液体状のNGMを、60 mm × 15 mmのペトリ皿1枚あたり10 mLずつ分注します。NGMを室温で一晩静置し、凝固させます。化合物や抽出物の効果を試験する場合は、抽出物を各プレートに分注し、スプレッダーを用いてプレート表面に均一に塗布します。プレートを室温で一晩乾燥させてください。1 mLを超える容量の場合は、乾燥にさらに時間を要します。次に、LB培地でOD 0.4から0.6まで一晩培養したe coli strain OP 50を、各プレートに250 µLずつスポットし、室温で一晩置いて細菌を乾燥させます。プレートの作成からの経過日数は麻痺率に大きな影響を与え、古いプレートほど乾燥する傾向があります。プレートは麻痺アッセイの1週間以内に作製してください。理想的には、同期卵産卵の3〜4日前に作製したプレートを使用してください。実験に使用するプレートはすべて同じバッチである必要があります。ローン（菌叢）のサイズや細菌を変更すると、ワームの行動も変化します。麻痺アッセイは、代替の e coli 株を用いて実施することも可能です。例えば、RNAi実験ではHT115が使用されます。ただし、これにより麻痺アッセイのキネティクスが変化する可能性があります。したがって、適切な系統の内部コントロールを使用する必要があります。β誘導性麻痺のアッセイには、一般的にCL 476系統が用いられます。この系統およびその他のトランスジェニックモデルは、Saint Ahadi Genetic Centerから少額の手数料で学術研究者が利用可能です。試験集団の齢同期性を最大限に高めるためには、同期させた親世代から開始することが望ましい。試験集団の麻痺アッセイを開始する1週間前に、プラチナワームピッカーを用いて、20〜30匹の成熟成虫を数枚の10 centimeter NGMプレートに転移させる。CL 4 1 76の許容温度である16°Cにて、OP 50と共に2時間播種し、産卵させます。GR成虫を除去し、子孫を7日間育成させます。この時点で、それらは2日目のgravid adult（抱卵成虫）となります。2日目のgravid stateです。各実験条件における年齢同期化した試験集団を調製するために、成虫を使用します。目的は、白金線ワームピッカーを用いて、50から75匹の年齢同期化したワームを含むプレートを3枚作成することです。day 2の成虫10から12匹を、OP 50をスポットした60 mm NGMプレートに移します。16 °Cで2時間、ワームに産卵させ、その後成虫を除去し、16 °Cで卵を孵化・成長させます。この時点で、プレートのスコア付けを行わない人物にコーディングを行ってもらい、実験条件が分からない状態でスコア付けができるようにするのが最善です。産卵時の胚発生段階（最適条件下での野生型虫の場合、およそ26細胞期）は、成虫の齢および栄養状態に依存します。産卵に使用する成虫が高齢であるか、あるいは飢餓状態にある場合、より発生段階が進んだ卵が産み付けられるため、同期集団が得られず、結果として麻痺アッセイの速度論に影響を及ぼします。いかなる種類の細菌汚染も本アッセイに深刻な影響を及ぼす可能性があるため、E. coli OP50などの単一菌株の細菌培養物を使用することが不可欠です。3連のプレート間で線虫の数が同程度である場合に、再現性が最も高くなります。トランスジェーンを誘導し、麻痺アッセイを実施するために、プレートを25 °Cに昇温させます。同期産卵の終了から48時間後、線虫は第3 larval stage（L3期）に達しているはずです。プレートを25 °Cのインキュベーター内で積み重ねずに配置し、プレートをこの温度に到達させます。同時に、温度上昇（upshift）の開始から18〜20時間後に、線虫の麻痺のスコアリングを開始してください。この時点で、個体群内のすべての虫が第4 larval stageに達しているはずです。各プレート上のすべての虫が麻痺するまで、2時間おきにスコアリングを続けてください。理由は不明ですが、麻痺は体の全長にわたって均一に起こるわけではありません。頭部領域が、虫の体の中で最後に動きが止まる部位となります。したがって、麻痺が始まったばかりの虫はプレート上を移動することはできませんが、頭部を動かすことは可能であり、それによって前方の細菌を除去し、細菌が消失したハロー（浄化帯）を形成します。これらの虫は必然的に完全に麻痺するため、ハローを持つ虫は麻痺していると定義されます。一部の虫はハローを持ちませんが、同時に自発的な運動も見られません。これらはワームピッカーでつつくことでテストします。つついた際、全身に波状の伝播が起こらないワームは、効率的にスコアリングを行うため、同様に麻痺していると判定します。麻痺したワームは、次のスコアリング期間に誤って再度カウントされないよう、プレート上の印のないセクターに移動させるのが最も簡単です。これにより、誤って分類されたワームが運動を示すことができ、スコアリングの修正を行うことで麻痺曲線を生成することが可能になります。各時点で、各プレート上の麻痺していないワームの割合をパーセンテージに変換し、平均非麻痺率を、アップシフト開始時からの時間に対してプロットします。得られた曲線は形式的に生存曲線と同様であるため、標準的な非パラメトリック生存統計を用いて分析することができます。麻痺を誘発させるには、トランスジェニックmyo-3 Aβ虫のアップシフトをL4期の中盤までに完了させる必要があります。Myo-3プロモーターは発生的に調節されており、虫がL4期後半または成虫に達すると、発現レベルが著しく低下します。線虫を飢餓状態にすると導入遺伝子の発現が阻害されるため、実験期間中、線虫に十分な餌を与えることが非常に重要です。麻痺した線虫が回復した例は、どのような条件下でも観察されていません。Upshift後12〜16時間で、CL 41 76は麻痺します。たとえ16 ℃にdownshiftしても、CL 41 76株では麻痺を引き起こす導入遺伝子の発現上昇がより低い温度で起こる可能性があるためです。ただし、麻痺率が生じるタイミングは影響を受けることにご注意ください。麻痺率は、使用する特定の導入遺伝子系統によって異なります。当研究室では、CL 41 76よりも麻痺率が速い系統および遅い系統のmyo-3 Aβ系統を構築しており、そのため、麻痺アッセイのスコアリングウィンドウを適宜調整する必要があります。ここでは、未処理および 6.27 millimolar のカフェインに曝露させた CL 4 1 76 の麻痺曲線のプロットを示します。この処理により、約 4 時間という統計的に極めて有意な麻痺の遅延が生じており、これはベータ毒性の抑制を示唆していると解釈されます。このモデルにおける本実験では、コーヒーに含まれる別の化合物の影響を評価しました。このプロットは、ベータ毒性に影響を与えない処置における典型的な結果です。どちらの実験においても、未処理のCL 4 1 76個体群の約半分が24時間で麻痺し、28時間までに完全に麻痺していることに注意してください。これらは対照群の麻痺における典型的なタイムフレームです。CL 4 1 7 6集団において、このタイミングから大幅に逸脱した場合は、環境条件の変化または導入遺伝子コピーの自発的欠失が示唆されます。菌株CL 4 1 76に関する詳細については、付属のプロトコルを参照してください。本手順を実施する際は、プレートの経過日数、虫集団の齢期、および虫の麻痺率をスコアする能力に留意することが重要です。このビデオを視聴することで、この海鞘（かいちゅう）システムを用いてベータアミロイドの毒性を慎重に測定する方法を十分に理解できたはずです。これにより、さまざまな環境要因や薬剤処理がこの毒性に及ぼす非常に微細な影響を検出できるようになります。ここまで説明した変数は、アッセイの再現性を高め、麻痺のキネティクスを一貫させるために非常に重要であるため、十分注意して管理してください。これは、異なる時期に異なる担当者が同じ研究室で行った結果を比較する場合や、このモデルシステムを用いた他の研究者の結果と自身の結果を比較する場合において、非常に重要です。

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