外傷性脳損傷マウスへの神経細胞懸濁液の定位固定移植

固定注射器ポンプに取り付けられたプリロードされた注射器から始めます。

シリンジには、ヒト誘導多能性幹細胞由来の神経細胞懸濁液が含まれています。

外傷性脳損傷を負ったマウスの外科的に露出した脳皮質の上に針を置きます。

注射器を下げて針先で硬膜に触れ、損傷部位を狙うように座標を調整し、少し引っ込めます。次に、

小さな切開部を作成し、針の入り口を確立します。

次に、プランジャーを下げて細胞懸濁液の流れを可能にします。

針を下げて脳を貫通して、深部皮質の灰白質と白質の境界に到達します。

最後に、水分補給を維持するために手術部位に生理食塩水を洗浄しながら、細胞懸濁液をゆっくりと注入します。

完了したら、針を引き抜き、再洗浄し、切開部を閉じます。

時間が経つにつれて、移植された細胞は成熟し、神経回路が回復し、脳の損傷を修復します。

頭蓋切除術の約24時間後、マウスを定位固定フレームに戻します。

マウスを有窓手術用ドレープで覆います。切開部位を滅菌生理食塩水で洗浄し、その部位を洗浄し、縫合糸を緩めます。70%エタノールを染み込ませた綿棒で切開部位をやさしく滅菌し、細いピンセットや眼科用ハサミで縫合糸を外します。

次に、手術部位と頭蓋摘出部位を豊富な滅菌生理食塩水で洗浄します。細胞培養バイオセーフティフードで、細胞のチューブをそっと回転させるか軽くたたいて、均質な細胞懸濁液を確保します。マイクロピペットを使用して、プランジャー端から約7.5マイクロリットルの細胞をハミルトンシリンジにロードします。

プランジャーの端を下に向けてシリンジを120度の角度で持ち、サスペンションとプランジャー先端の間に気泡が入らないように注意してプランジャーを挿入します。ガスケットアセンブリをピペットニードルに取り付け、ニードルをシリンジに取り付けます。プランジャーを押して細胞懸濁液をピペットニードルに移動し、シリンジを定位固定シリンジポンプに取り付けます。

プランジャーを前進させてシリンジポンプアセンブリが適切に機能していることを確認し、針を注射の座標に移動します。針先をブレグマに合わせ、x座標とy座標をゼロに設定します。針先を頭蓋切除術の上で外側2ミリメートル、後方マイナス1ミリメートルに動かし、針先を硬膜表面に接触させます。

針を少し上げてから、針が接触した場所の硬膜に小さな切開を入れます。定位座標をzがゼロに等しいように設定し、プランジャーを押して細胞懸濁液が適切に流れていることを確認してから、針を脳に導入します。針をzの深さで脳にマイナス1.4ミリメートルまで導入し、深部皮質の灰白質/白質の境界に移植片を配置します。

シリンジポンプを始動して、15分間にわたって細胞懸濁液を注入します。長作動距離顕微鏡を使用して細胞懸濁液の流出を監視し、注射中に手術部位を滅菌生理食塩水で洗浄して組織の水分補給を維持します。すべての細胞が送達されたら、移植針をゆっくりと引き抜き、追加の生理食塩水で手術部位を洗浄してから、新しい縫合糸で切開部を閉じます。

次に、実証されたように術後ケアを提供します。