E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

こんにちは、Krete LabのWilliam Tisです。今日は、私とチームのメンバーで、胎生15日（E 15）のマウス胚への子宮内注入の方法について説明します。こんにちは、Laura Eliasです。

本日は、これから行う心室内注入およびエレクトロポレーションに使用する、マイクロインジェクション用ピペットの作成と充填方法について説明します。私はデビッド・カスタネーダです。本日は、マウス胚へのin vivo子宮内注入を補助します。発生中のマウス胚の側脳室にプラスミドDNAを注入します。

これらの胚のCE皮質を標的にすることで、グリア細胞および、その後の発生過程でニューロンとなる細胞における異なる分子の発現を得ることができます。これらの子宮内注射を行う際、いくつか使用すべき重要な器具がありますので、今からご紹介します。ここでは、フリーザーと、数本の鑷子を使用します。

1組は鋸歯状で、もう1組は先端に小さな突起があるものです。止血鉗子を使用します。こちらは鋏です。

次に、これら2種類のステープラーを使用します。こちらが大きい方で、ラットに使用します。そして、こちらが小さい方で、マウスに使用します。

サイズ7のステープルを使用し、こちらはサイズ9のステープルを使用しており、いずれもスプリングロード式です。手術を補助するためにここで使用している機器の一部として、ダブルヘッドを備えたシンプルなファイバー optic光源を使用しています。また、温水を循環させて保温するための加熱パッドを使用しています。

作業台では、BTX社製のこのエレクトロポレーションシステムを使用します。胚の大きさに合わせて、いくつかの異なるサイズのパドルを使用しています。青い側が陽極側です。

マウスの麻酔には、イソフルーラン気化器を使用します。これにより、母親マウスおよび胚の生存率が向上することがわかりました。また、動物の意識状態を非常に迅速かつ制御された方法で切り替えることができます。

そのため、これは非常に有用であると考えられました。それでは、次に注入用ピペットのベベル加工（面取り）を行います。これは、DNAをロードするのに十分な開口部を確保しつつ、注入時に胚を損傷させないよう非常に鋭利に仕上げるために極めて重要な工程です。

また、注入時に胚を傷つけてしまうと、死亡率が大幅に高まってしまいます。それは好ましくありません。したがって、この手術において、これは非常に重要な工程となります。

まず、ここで回転しているベベリングストーンに水をかけます。次に、スティックを1本用意します。そして、今プルしたピペットをテープでこのスティックに固定します。

そして、これらのマイクロマニピュレーターの1つを使用して、ピペットをベベル上に保持し、ここでベベルに合わせます。そこで、これを配置し、顕微鏡を用いてピペットの先端を視認します。そして、少量の圧力がかかるように、ベベル上の水中に直接配置します。

チップがここにある砥石に押し当てられているのがわかります。このまま少なくとも15分間は面取りを行ってください。私はさらに1時間ほど放置させるようにしています。

場合によっては非常に鋭利になりますが、ピペットのベベル（面取り）をどの程度行うかは、完全に個人によって異なります。さて、こちらをご覧ください。上部にあるのは、プルアウト済みでまだベベル加工をしていないピペットです。先端は鋭利ですが、DNAをロードするための開口部がありません。

これでピペットの先端が面取りされ、斜めの開口部ができたことが確認できます。これによりDNAをロードすることが可能になりますが、先端は鋭利なままなので、組織を傷つけることなく注入できます。それでは、注入用ピペットにDNAを満たします。DNAを注入する際にリポ多糖を同時に注入しないよう、エンドトキシンフリーの環境でDNAを調製することが重要です。

それでは、DNAを用意し、ここでパラフィルムを準備します。パラフィルムを広げ、DNAを少量ずつ採取し、パラフィルム上に小さなドット状に滴下します。通常、DNA 10 µLにつき（濃度は通常 1.5 〜 1.7 µg/µL を使用します）、以下のように採取します。

このファストグリーン染料を約1 µL使用します。これは、注入部位を特定し、脳室に正しく注入できたかを確認するためのものです。次に、このファストグリーン染料をDNAと混合します。

次に、注入電極を用意し、プランジャーを引いてピペット内に液体を充填します。ピペットの先端が正しく面取りされており、開口部が十分に大きければ、DNIは容易に充填されるはずです。うまく充填されない場合は、プランジャーを前後に動かして調整してください。

このようにしてピペットを充填します。これでDNAがピペットに完全に充填され、注入できる状態になりました。それでは、動物をアルコールとヨードで洗浄しますが、その前にまず、動物が完全に麻酔状態にあるかを確認するため、足指をピンチして確認します。問題ないようです。

それでは、開始します。ラットの場合と同様に、まずエタノールから始めて、3回連続でこの操作を行います。次に、ヨウ素を使用します。

感染のリスクを最小限に抑えるため、ウィリアムがワイプを開封した際、指で触れていない部分で動物を拭いていることに注意してください。これにより、拭き取り箇所の清潔さを最大限に確保できます。次に、腹部表面に菌を拡散させるのを防ぐため、拭き取りは1回のみ行います。

それでは、少し片付けをしてから、手術用手袋を着用します。はい。はい。では、マウスを開腹して子宮角を取り出します。まず、皮膚を少しつまむことから始めます。

完全に麻酔がかかっているか確認するため、もう一度趾（あしゆび）をつまみます。これで大丈夫です。次に、皮膚をつまんで少し盛り上げ、切りやすくします。ここでも、血管を避けるため、動物の正中線に沿って切開します。

通常、このように皮膚を切開して剥離し、筋肉を露出させます。そうすると、筋肉の中央線がはっきりと確認でき、非常に明確に分かります。

筋肉を一部掴んで、切開します。切開サイズはこの程度が適切です。これ以上の拡大は避けます。次に、このフリーアを用いて筋肉と皮膚を持ち上げて横に寄せ、内部を非常に慎重に探ります。2つの胚の間にフリーアを配置し、胚を全く傷つけることなく、優しく引き出します。

場合によって、やりやすい時とそうでない時があります。これでいきました。このように、ゆっくりと引き抜いて、通り抜けたところで、軽く押し出して取り出します。

胚を絶対に挟み込まないことが重要です。あくまで誘導するように、軽く押して移動させてください。また、取り出した後は、常に十分に濡れた状態に保つようにし、乾燥させないように注意してください。

それでは、もう一度フリーザーを使用して、周囲を探索してみましょう。できました。これで完璧です。

そのため、卵巣を確認せずに作業すると、一つを内部に残したままにしてしまいやすいため、必ずすべて取り出しているか確認するようにしています。ここでも、非常に慎重に引き出しますが、最後にこちらにある卵巣があるかどうかを確認します。この個体では、小さな赤い組織の塊のように見えます。

次に、それらを裏返しにして、反対側を確認します。そこに胚があるのが見えます。ですので、必ず水分を保持するようにしてください。これで準備完了です。一点注意したいのは、胚を非常に慎重に、胚のみをつかまえるようにすることです。

血管がある部分は、非常に損傷しやすく、動物に出血が起こり生存率が劇的に低下するため、掴まないでください。そのため、まず最初に行うのは、DNAを注入したい胚の頭部の位置を確認することです。動物をゆっくりと回転させ、腹側をそれぞれ観察することで、位置を特定します。

今回の例では、頭側が私の右側にあり、尾側が左側にあります。正中線はこの位置にあります。ウィリアムが胚を適切に配置し、私が注入できるようにします。ラットの場合と同様に、常に頭側を母体の右側にし、こちらを向くように配置します。

それでは、今から開始します。左側のフロアポールが見えますね。少し動かすと、ちょうどそこに正中線が見えます。デビッドにとって最適な位置になるよう、少し回転させて調整します。

それでは、左心室への注入に進みます。ここでは、左心室が完全にDNAで満たされていることがわかります。また、一部の染料が右心室、および第3、第4心室まで広がっていることが確認できます。

これは注入が適切に行われた良い指標となります。それでは、DNAを細胞内にエレクトロポレーション（電気穿孔法）で導入します。ここでの重要な注意点は、どちらの電極が陽極であるかを確認しておくことです。

ここにある青いハンドルの方が陽極であり、DNAをエレクトロポレーションさせたい側に配置する必要があります。今回は左心室にDNAの大部分を注入したため、このように陽極を左側に配置し、5パルスを印加して完了です。電極と子宮の間の接触を良好にし、電気パルスの伝達を適切にするために、電極をPBSで完全に濡らしておくことが重要です。

それでは、探索が完了しましたので、角を元の位置に戻します。方法は、まず角を非常にゆっくりと片側に寄せ、中の筋肉と皮膚をつかんで、ゆっくりと慎重に中に戻します。よし、うまくいきました。

膀胱に注意してください。反対側は私が行います。その後、中にあるものを落ち着かせるために、軽く揺らします。

フリーアを使って、軽く平らに整えます。次に、抗生物質・抗真菌剤 3 mL でフラッシュします。縫合を開始する前に、趾（あしゆび）を挟んで、完全に麻酔が効いているか確認しましょう。

これでよしです。ヘンリーシャイン社の6番手術用縫合糸を使用します。

私はブロックステッチで行うことを好みます。その方がよりしっかり固定されると思うからです。まず、針をそこに通りませ、引き抜いてから3回巻きつけ、端を掴んで引き抜くところから始めます。

1、2、3と、余分な部分を切り落とします。このように、均等な間隔を空けて列に沿って進み、きつく引き締めていきます。切開が終わったところを少し越えた位置まで進み、再度結紮します。

そして、今そこに近づいています。組織または皮膚を少し後方に引きます。そこでわずかに出血しています。

問題ないはずです。時折出血することがあるため、念のため電気焼灼器を用意しています。出血を止めるには、この焼灼器が非常に有効です。

それでは、切開線を越えました。ここで止めます。引き出してループを作り、3回回転させ、ループを掴んで下に引きます。

3回回転させ、ループを掴んで引き抜き、余分な部分を切り落とします。針を鋭利物廃棄容器に捨ててください。次に、ステープラーを使用します。

この動物には7番のステープルを使用します。マウスには7番を、ラットには9番を使用します。

皮膚をつまんで少し持ち上げ、クリップし始めます。再びクリップをつかみます。切開部位を少し超えるまで、等間隔に配置していきます。これで完了です。

その後、領域全体をアルコール綿で拭き取ります。そして、痛みがまったくないように、ブプレノルフィンを注射します。今後数日間、彼女が健康な状態を維持し、痛みがないことを確認するために、継続的に観察を行います。

ブプレノルフィンを注射しましたので、覚醒時に安心感を得られるよう、マウスを元のケージに戻します。その後、インキュベーターに入れ、完全に覚醒し、体が乾くまで20分ほど静置します。これで、プラスミドDNAを用いたin vivo in uteroエレクトロポレーションの実施方法について説明しました。この手法では、あらゆる分子を注入することが可能です。

それはpDNAである可能性もあり、薬剤である可能性もあります。また、成長因子である場合もあります。これらの分子を細胞内に届ける必要があり、受動拡散で通過しない場合は、エレクトロポレーションが必要となります。そのためには、分子が電荷を帯びている必要があります。

基本的には、可能性は無限にあります。細胞に遺伝子を導入するための代替ベクターの一例として、ウイルスが挙げられます。

これまで、レトロウイルスを用いてGLsをDNAで標識し、それらがどのように分裂してニューロンとなり、最終的に皮質へ遊走するかを観察してきました。細胞をウイルスで標識したり、エレクトロポレーションを用いたり、あるいは薬剤やその他の分子を注入して脳の発達に影響を与えたりすることで、これを研究できます。いくつかの手法で検討が可能であり、その一つが、器官培養スライス（organotypic slice cultures）を用いたタイムラプス観察です。

そして、顕微鏡を用いて細胞の運命を追跡します。こちらにあるように、時間 0.0 です。側脳室のごく近くにある細胞群から開始します。

時間が経過するにつれて、細胞が脳室帯から脱出し、皮質板に向かって移動し始めるのが観察できます。さらに、胚を固定して免疫組織化学染色を行い、さまざまな分子の分布を調べたり、これらの異なる細胞の運命を決定したりします。また、電気生理学的解析を行うという選択肢もあります。

標識細胞を特定し、それらの電気的特性を解析します。本日はご視聴ありがとうございました。私たちのデモンストレーションがお役に立ち、皆様の実験が成功することを願っております。

ご質問がある場合は、お気軽にお問い合わせください。それでは、ご成功をお祈りいたします。