E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

こんにちは、Krete LabのWilliam Tisです。今日は、私と他の人々がE 15マウス胚の子宮内注射を見せます。こんにちは、私の名前はローラ・エリアスです。

マイクロインジェクションピペットの準備方法と、これから行う心室注射とエレクトロポレーションのためのピペットのロード方法をご紹介します。私の名前はデビッド・カスタネダで、今日はマウス胚の子宮内生体内注射をお手伝いします。発生中のマウス胚の側脳室にプラスミドDNAを注入します。

これらの胚のCE皮質を標的とすることで、グリア細胞によってさまざまな分子が発現し、それが発生の後半でニューロンになります。これらの子宮内注射を行う際には、使用する必要があるいくつかの重要なツールがあり、それらをお見せします。今。私たちはより自由な、いくつかのアドイン鉗子を使用します。

1つは鋸歯状のペア、もう1つは端に小さな歯があるペアです。私たちは一対の止血剤を使用します。これはハサミです。

そして、この2つのホッチキスを使います。これは、私たちがネズミに使用する大きいものです。これは、マウスに使用する小さい方です。

サイズ7のステープルを使用し、これはサイズ9のステープルを使用しており、バネ仕掛けです。ここで手術を支援するために使用するもののいくつかは、ダブルヘッドが付いた単純な光ファイバー光源を使用するだけです。温めたお湯を循環させて保温するだけの加熱パッドを使用しています。

作業面には、BTX製のこのporエレクトロポレーションシステムを使用しています。私たちは、胚の大きさや大きさに基づいて使用するパドルのサイズをいくつか持っています。青い側は正の側です。

さて、マウスにはイソフッ素気化器を使用します。その結果、母親と胚の生存率が向上することがわかりました。それはまた、動物を非常に迅速かつ非常に制御された方法で意識の内外に連れ出すことを可能にします。

そのため、非常に便利だと思いました。さて、それではインジェクションピペットを面取りします。これは非常に重要なことで、ピペットにはDNAをロードするための十分な大きさの開口部があり、また、注入時に胚を傷つけないように非常に鋭利です。

そして、注射時に胚を傷つけると、死亡率がはるかに高くなります。だから、それは良くない。ですから、この手術のように、これは実際には非常に重要なプロセスです。

そして最初に、ここで回転しているこの面取り石に水を入れます。そして、ここで見てみましょう、ただのa、a、棒を取ります。そして、引っ張ったばかりのピペットをテープでこのスティックに置きます。

そして、これらのマイクロマニピュレーターの1つを使用して、ピペットをベベルに保持し、ここでベベルできるようにします。そこで、これを置くだけで、顕微鏡を使用してピペットの先端を視覚化します。そして、それをベベルの上の水の中に置いて、少し圧力がかかるようにします。

そして、先端が石に押し付けられているのが見えます。そして、少なくとも15分間は面取りします。私は彼らを1時間でも放置するのが好きです。

時には、本当に、本当に鋭くなることもありますが、ピペットをどれだけ長く面取りするかは、人によって確実に異なります。さて、これがここにあります、上部にはまだ面取りされていない引っ張られたピペットがあります。そのため、シャープでありながら、DNAをロードできる開口部はありません。

これで、下部のピペットが面取りされ、この素敵な角度の開口部が見えます これでDNAをロードできるようになりますが、先端はまだ鋭いので、損傷を与えることなく注入できます。さて、では、注射ピペットにDNAを充填します。ですから、DNAを注入するときにリポ多糖類を注入しないように、エンドトキシンフリーの方法でDNAを調製することが重要です。

ですから、私たちはDNAを採取し、実際にここでパラフォームを準備します。ですから、ここでパラフォームを作り、DNAを集めて、このパラフィルムに小さな点として配置したいと思うでしょう。そして、私は通常、DNAの10マイクロリットルごとに摂取しますが、これは通常、1マイクロリットルから約1.5〜1.7マイクログラムで使用します。

私はこの速い緑色の染料を約1マイクロリットル使用します。これは、注射の位置を特定し、心室への注射が成功したことを確認するためだけです。だから、この速い緑色の染料を私のDNAと混ぜるだけです。

そして、注入電極を取り、プランジャーを引き戻してピペットを充填します。そして、ピペットが正しく面取りされ、十分な開口部がある場合、DNIはかなり簡単にロードされるはずです。プランジャーを正しくロードするために、プランジャーを前後に動かす必要がある場合があります。

そして、このようにピペットをロードできます。そして、DNAがこのピペットに完全に挿入され、注射の準備が整いました。さて、では、これから動物をアルコールとヨウ素で洗いますが、まずはつま先をつまんで、動物が完全に下に入っていて、見た目が良さそうであることを確認したいと思います。

それでは、先に進んで始めることができます。そして、私はラットと同じように、エタノールから始めるこれらの3つのシリーズを開始します。よし、ヨウ素。

感染のリスクを最小限に抑えるために、ウィリアムがワイプを開いたとき、彼は指で触れていない部分で動物を掃除していることに注意してください。そのため、その領域がきれいであることを最大化します。次に、腹部の表面に細菌が分布するのを避けるために、彼は1回だけ拭きます。

なるほど、よかった。さて、少し掃除をして、手術用手袋をはめます。では、マウスを開いて子宮の角を取り出し、それを少し皮膚をつまむことから始めます。

彼女が完全に下にあることを確認するために、ここでもう一回つま先をつまんでみさせてください、そしてそれは良いことです。そこで、皮膚をつまんで、そこに小さな波紋をあげて突き出るようにして、切り取りやすくします。そしてまた、血管を避けるために、動物の正中線に沿って切開を行いたいと考えています。

私は通常、そのように皮膚を切って分離し、筋肉を露出させます。そして、それが終わると、筋肉の正中線を簡単に見ることができます。それは非常に明確です。

私はそこにいくつかの筋肉をつかむつもりです切り取り、そしてそれは良いサイズの切開です。これ以上大きくはしたくないです。そして、このフリーラーを使って筋肉と皮膚を持ち上げ、横に引っ張り、ここで非常に優しくプローブを行い、フリーサーを2つの胚の間、2つの胚の間に配置して、まったく損傷を与えることなく優しく引っ張ることができるようにします。

時には、他のものよりも簡単なこともあります。さあ行こう。だから、優しく引っ張って、一度通したら、あとはちょっと押し出すことができるんです。

胚を決してつまむことは決してないことが重要ですが、ただ彼らを導きたい、ただ彼らをつまむようなものです。そして、それらを取り出したら、常に非常に濡れたままにしておくようにしたいと思います。彼らが乾燥するのを許したくありません。

そして、見てみましょう、私はここで再び私のフリーラーを使用して、周りを探ります。さあ行こう。素晴らしい。

だから、私はいつもそれらすべてを持っていることを確認したいと思っています、なぜなら、卵巣をチェックしないと、そこに1つ残すのは簡単です。だから、いつもとても優しく引き抜くのですが、端にある卵巣を探して見ています。そして、それはこの動物の赤い組織の小さな塊のように見えます。

そして、それらをひっくり返して、戻ってきて反対側を確認すると、そこにそれらを見ることができます。だから、それらを水分補給してください、そして私たちは行く準備ができています。私が指摘したいのは、胚を非常に優しくつかみ、胚だけをつかむべきだということです。

血管がどこにあるかをつかまないでください、なぜなら、血管は非常に簡単に損傷を受ける可能性があり、動物は出血し、生存率は劇的に低下します。ですから、最初に判断したいのは、DNAを注入したい胚のどこに頭があるかということです。これは、動物を優しく回転させ、腹側、各腹側部分を見ることによって行います。

つまり、この特定の例では、頭が私の右側にあり、尾が私の左側にあることがわかります。正中線はこの位置にあり、ウィリアムは胚を適切な方法で上に配置して、ラットと同じように注入できるようにします。私はいつも頭を上にして、母親の右側を私の方に向けて配置します。

では、ここから始めましょう。さて、そこに左のフロアポールが見え、少しだけ動くと、そこに正中線が確実に見えます。デビッドにとって良い位置になるように、少しスピンアップしてみます。

さて、それでは左心室の注射に進みます。ここでは、左心室が完全にDNAで満たされていることがわかります。一部の死者が右心室に広がっており、ここでは第3脳室と第4脳室にも広がっていることがわかります。

これは、良好な注射の良い指標です。そこで、DNAを細胞にエレクトロインします。ここで重要な考慮事項は、どちらの電極がプラス側であるかを知ることです。

ここで青いハンドルが付いているものが正極であり、その側はDNAをエレクトロポレーションしたい側に入るべきであることを私たちは知っています。ですから、左心室にほとんどのDNAを注入したので、このように正極を左側に配置し、その後、5つのパルスを印加して終わりです。電極と子宮との間の接触が良好で、電気パルスの伝送が適切であるように、電極をPBSで完全に濡らしておくことが重要です。

さて、探索が完了したので、先に進んで角を中に戻します。そして、その方法は、角を非常に優しく片側に動かし、ここに手を伸ばして筋肉と皮膚をつかみ、そちらに優しく、優しく戻すことです。さて、いいですね。

膀胱に注意してください。私は反対側をすることができます。そして、私たちが行うことは、彼女に少し揺さぶって、彼らを落ち着かせることです。

少しフリーで軽く平らにすることができます。そして、これからやろうとしていることは、3ミルの抗生物質、抗真菌剤を充填することです。縫合を始める前に、彼女が完全に抜けていることを確認するために、つま先をつまんでみましょう。

そして、それは良さそうです。ヘンリー・シャインを使います。その6、外科用縫合糸。

私はブロックステッチをするのが好きです。私は彼らがよりよく持ちこたえていると思います。そして、そこに針を通し、引っ張り、3回巻き付け、端をつかんで引っ張るだけで始めます。

1、2、3、余分な部分を切り取ります。だから、あなたはただ均等にスペースを空けて、きつく引っ張ってラインを下り続けたいのです。そして、切開が止まるところのすぐ先に行って、再び結ぶ必要があります。

そして、私は今、それに近づいています。ティッシュを後ろに引いたり、皮膚を少し後ろに引いたりします。そこには少し出血があります。

大丈夫なはずです。出血した場合に備えて、焼灼器を置いておきますが、それはたまに起こります。そして、それを止めるのによく効くのが焼灼剤です。

だから、大丈夫、私は切開を超えています。ここで終わります。引っ張ってループを作り、3回回転させてループをつかんで引き下げます。

3回回転させ、ループをつかみ、引っ張って通し、余分な部分をオフにします。鋭利物に針を入れます。そして、ホッチキスを使います。

この動物にはサイズ7のステープルを使用します。マウスには7匹使います。ネズミの場合は9つ。

皮膚をつかみ、少し引き上げて、クリッピングを開始します。クリップをもう一度つかみます。切開部を少し超えるまで、ずっと等間隔にしたいのですが、それは良いことです。

エリア全体のアルコールワイプでフォローアップします。そして、彼女が痛みを感じることを確認するために、ブプレノルフィンを注射するつもりです。そして、今後数日間、彼女が健康で、痛みを感じていないことを確認するために、引き続き監視していきます。

さて、ブプレノルフィンを注射したので、彼女が目覚めたときに快適に過ごせるように、彼女を元のケージに戻して、保育器に入れて、彼女が完全に目を覚まして乾かすまで20分ほどそこに留まらせます。子宮内での生体内、血漿のエレクトロポレーション、DNAの方法をお見せします。どんな分子でも注入できます。

それは格子縞のDかもしれませんし、麻薬かもしれません。成長因子は死にます。これらの分子を細胞に送達する必要があり、それらが受動的拡散を通過しない場合は、エレクトロポレーションが必要であり、そのためには分子を帯電させる必要があります。

しかし、基本的に可能性は無限大です。遺伝子を細胞に導入するための代替ベクターの一例。私たちのウイルス。

また、過去には、レトロウイルスを使用してglsをDNAで標識し、glsがどのように分裂してニューロンになるかを示し、ウイルスで細胞を標識したり、エレクトロポレーションを使用したり、薬物やその他の分子を注入して脳の発達に影響を与えたりした後、最終的に皮質に移動する方法を示しました。これはいくつかのテクニックで研究できます。そのうちの1つは、器官型スライス培養を行うTimeLapseを行うことです。

そして、顕微鏡を使用して細胞の運命を追跡します。ここでわかるように、時間は0.0です。まず、側脳室に非常に近い細胞のクラスターから始めます。

そして、時間が経つにつれて、細胞が心室ゾーンから皮質プレートに向かって移動し始めることがわかります。さらに、胚を固定し、免疫組織化学を行って、異なる分子の分布の違いを研究したり、これらの異なる細胞の運命を決定したりします。別の可能性は、電気生理学を行うことです。

ラベルセルを特定し、その電気的特性を研究します。さて、本日はお付き合いいただき、誠にありがとうございます。私たちのデモンストレーションを楽しみ、実験を成功させることを願っています。

ご不明な点がございましたら、お気軽にお問い合わせください。ご存知の通り、幸運を祈ります。