Name: ダニのRNA干渉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶダニにおけるRNA干渉法で、二重鎖RNAを注入して遺伝子発現を抑制する技術。体重や産卵量などの生物学的パラメータとリアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現を評価し、ダニの生理機能や病原体伝播制御への応用を探索する。

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我々は、有意義な議論と技術支援のために我々の研究室のメンバーに感謝。このビデオプレゼンテーションは、研究と獣医病理学科のための副学部長、獣医健康科学センター、オクラホマ州立大学によってサポートされていました。研究がMinisterioデCiencia電子Innovación、スペイン（プロジェクトBFU2008-01244/BMC）、JFにCSIC学内プロジェクトPA1002451によって資金を供給された、ウォルターR. SitlingtonはKMK、CVHS 2009 RAC助成金、OAESに食用動物の研究のための椅子を寄附アニマルヘルスファンドと米国農務省、国立研究イニシアチブ競争グラント、第2007〜04613。

1。 dsRNAの世代。 <ol><li> dsRNAのin vitroでの転写および合成のためのT7プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成する（例えば、 カクマダニ属のためにsubolesinオリゴヌクレオチドプライマーD8AAT75を使用アベマキ ： 5' - TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT - 3'とD8DVT73：5' - TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG - 3'）。 </li><li> RT - PCRは、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーとダニのトータルRNA 1-10 ngの10 pmolのを使用して標的遺伝子を増幅する。 </li><li> PCR産物を精製する。 </li><li>精製したPCR産物の8μLを用いてdsRNAを合成する。 </li><li>スペクトロメトリーによりdsRNAを定量化する。 </li></ol> 2。 dsRNAを持つマダニの注射。 2.1。注射のためのティックの準備。 <ol><li>最初に、ダニを保持するためにチューブトップを細かくメッシュワイヤースクリーンを通してソリューションをデカント、50mLの使い捨て遠心管に各ソリューションでそれらを振盪することによってソリューションの一連のティックを洗う。洗濯ダニのためのソリューションのシーケンスは、水道水、3％過酸化水素、蒸留水の2回洗浄、70％エタノールおよび蒸留水でさらに2回洗浄です。 </li><li>ペーパータオルの上でダニをブロット乾燥。 </li><li>実験に応じて、20〜50のグループにティックをカウント、実験群の数としっかりフィットふたとラベルを1.25オンスのプラスチック製のコップで各グループからダニを置きます。 </li></ol> 2.2。射出チームティック。 RNAiのチームは3人で構成されています：（1）赤歯科用ワックスのシートに貼り付けられた二重粘着テープ上の各目盛りを置いた一人、後にダニを監視目盛りと（3）一人を注入する（2）一人注射は、それらを有効にダニにCO 2を吹き込みと実験群の番号のラベルが付いてカップに住んでいるダニをカウントします。すべてのチームメンバーは、使い捨ての手袋を着用しなければならない。 2.3。注射のためのダニの配置。 <ol><li>デュモン細かい鉗子を使用してダニをキャプチャし、赤歯科ワックスの3"× 6"シートに貼付ダブル粘着テープの上に腹側を上に置きます。チックは密接に5ティックのグループで一緒に配置されている。 </li><li>さらに、それらを抑制するために、全5ダニの口器にわたってマスキングテープの小片を置きますが、注射のプロセスがダニインジェクタ（図1）によって観察できるように公開されたボディのほとんどを残すこと。 </li></ol> 2.4。ダニの注射。 <ol><li>ダニは、外骨格の腹側表面の右下腹部に注入されます。 </li><li>最初に、ピアス½"、29ゲージの針（図2a）を装備Monojectのインスリン注射器を使用して外骨格に穴。 </li><li> 45 °傾斜したポイントで1インチ、33ゲージの針を使用してカスタムメイドのハミルトンシリンジを用いて- （μLあたり5 × 10 11分子が5 × 10 10）（図2b）のdsRNAのソリューションの0.2から0.5μLで、すぐにチックを注入する。針は、dsRNAの配置と保持を保証するためにもダニの空洞内に配置する必要があります。いくつかの流体は、注射部位（図2c）から脱出する可能性があります。ケアは、以上の血リンパの損失を引き起こすとダニの死を引き起こす可能性ダニを、注入しないように注意してください。 </li><li>各実験群で注射を完了した後にハミルトンシリンジを清掃してください。別の実験群のために使用する前に。 3％の過酸化水素を含むビーカーから最初の注射器をいっぱいにし、廃棄物の容器に追放し、15回繰り返す。滅菌水の入ったビーカーからシリンジを記入し、廃棄物の容器に追放し、15回繰り返す。曲がった場合、プランジャーがスムーズに移動し、ダニの注入に必要な優しいタッチに反応しない、ので、ハミルトンシリンジのプランジャーを曲げないように注意してください。 </li></ol> 2.5。注入後のダニの治療。 <ol><li>細かい鉗子ですぐにダブル粘着テープから注入された目盛りをピックアップし、プラスチックの回収容器（約6"× 6"とダニの脱出を防ぐためにマスキングテープで囲ま）に置きます。ティックは、注射後しばらく非アクティブになりますが、すぐに皿の周りにクロールを開始する必要があります。 </li><li>息がすぐにダニを有効にするための回収容器にそれらを配置した後にダニにCO 2を 。ダニは、クロールとアクティブされると、注射の傷は急速に治癒するが、これはほとんど生き残っていくだろう。 </li><li>各実験群の数に応じて目盛りを数えて、しっかりと取り付けられた蓋のラベルが付いたプラスチック製のコップの中に置いてください。交換用の目盛りは、いずれかが次の実験群を注入する前に死亡したことを置き換えるために注入されるべきである。 </li></ol> 2.6。持株ティック。 <ol><li> ° Cと95％の相対時間22〜25で12時間暗光周期：湿度チャンバ内でダニを置きます（12時間光umidity）と1日間保持する。 </li><li>ダニ送り細胞、実験群に1つずつ配置ダニは、羊に接着し、それらをuninjected雄または雌ダニの数と同じ数（注入されていない方の性別）を供給することができます。たらふく女性チックそのフィードは、給餌の10日後に羊から削除されるか、コントロールの女性がホストを降ろしているときにそれらを収集し、秤量する。 </li><li>カートンでダニを置き、そして産卵の完了まで、湿度チャンバ内に保持する。重み付けして、グループ内のすべてのダニによって生成された卵塊を産卵を評価する。 </li></ol> 2.7。 RNAiの後のダニの表現型の解析。 <ol><li>生き残ったダニの数を決定することによって、餌の後に表現型をチェック評価し、体重、産卵と卵の肥沃度をチェックします。しかし、他の分析は、標的遺伝子と研究の目的に応じて実施することができる。 </li></ol> 3。 RT - PCRによる遺伝子サイレンシングを確認する分析。 <ol><li>授乳後のコントロールを注入し、dsRNAを注入されたグループから個々のダニから唾液腺や内臓を細かく分析。 </li><li>個々の組織サンプルからトータルRNAを抽出する。 </li><li>リアルタイムRT - PCRによって個々の組織における標的遺伝子の転写産物を分析し、ダニの16Sに対してRNAレベルを正常化するには、genNorm法（Bio - Rad社iQ5のStandard Edition、バージョン2.0で実装されたddCT方式）を使用してrRNAの。 </li><li>唯一のアンプリコンが形成されていることを確認するために反応の終了時に、その解離曲線を実行するすべてのサンプルに対して同じ温度範囲で一貫してアンプリコンの変性。 </li><li>制御注入し、学生の`sのt -検定（P = 0.05）を用いて二本鎖RNAを注入されたティック間のmRNAレベル（正規化されたCt値）を比較する。 </li></ol> 4。代表的な結果： ここに記述されているプロトコルは、多くの異なるマダニの種でRNAi実験のための我々の研究室（表1）で使用されています。ティックに注入されたdsRNAの量は、ダニの大きさによって変化します。大きくダニの種は、より大きなボリュームを収容することができます。ネガティブコントロールの目盛りは、無関係のdsRNAを注入する必要があります。このようなsubolesin 14-19,22-25,27-32,34とβ-アクチン20,21のようないくつかのdsRNAはポジティブコントロールとして使用することができる。それは混合のdsRNAソリューションを避けるために、治療の間に注射器を洗浄することが重要であることに注意してください。プロトコルが適切に行われた場合、5％未満の死亡率は、24時間後に注射の手順から入手してください。ダニの遺伝子のノックダウン後の典型的な表現型は防御抗原をチェックするための画面にするためにdsRNAのプールを注入ダニのパネルと図3に示します。 <table border="1"><tbody><tr><td> 種ティック </td><td> dsRNAは、注入 </td><td> 参考文献 </td></tr><tr><td> scapularisマダニ属 </td><td> cDNAライブラリー、subolesin、アクチン、ヌクレオチダーゼ、NF - KB、akirin </td><td> 21、22、29、30 </td></tr><tr><td> カクマダニ属アベマキ </td><td> subolesin、GST、ユビキチン、vATPase、セレンMとW2A、造血幹細胞/前駆細胞アクチン、タンパク質のような26Sプロテアソームサブユニット、ferritin1、varisin、akirin </td><td> 15、19、22、24、26、30から32 </td></tr><tr><td> カクマダニ属marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> キララamericanum </td><td> cDNAライブラリー、subolesin、akirin </td><td> 17、22、30 </td></tr><tr><td> キララhebraeum </td><td> subolesin、voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalusのsanguineus </td><td> Rs86、subolesin </td><td> 22、23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> GST、ユビキチン、セレン、Bm86、Bm91、subolesin、GI、GIII、EF1a、鞭毛状の糸タンパク質、フォンウィルブランド ファクタ</td><td> 16、18、25、27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalusのannulatus </td><td>ユビキチン、subolesin、EF1a、GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> 表1：RNAiのプロトコルが使用されている種にチェックを入れます。 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1赤歯科用ワックスのシートに付着ダブル粘着テープの目盛りの配置、上腹側、。ダニは、マスキングテープの小片がインジェクタが注入中にダニの体を観察しながら、さらにダニを確保するために口器上に配置され、その後、5グループに配置されます。 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。注入手順はインスリンSYとダニの外骨格の右下の象限にピアス（）が含まれています注射部位を作成するために29ゲージの針を備えたringe、（c）のほとんどがダニの血リンパ/いくつかの漏洩につながる33ゲージの針でハミルトンシリンジを使用して、このサイトでのdsRNAの（b）の即時注入流体。 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。RNAiのはキララamericanumのダニ防御抗原をスクリーニングするために使用されたダニ6つのグループのパネル。ポジティブsubolesin RNAiを制御し、負の無関係なdsRNAをコントロールと比較した場合、ティック単位での表現型の変化を見ることができます。この実験では各グループのダニの死亡率、重量、および産卵に対するRNAiの効果が統計的に解析した。

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<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

他の方法がダニ14 33にRNAiに記載されているが、dsRNAの注射は、ここで説明する最も広く食物を与えられていない（表1）と供給チック16,25,34の両方で使用されています。 RNAiは、ダニの遺伝子機能の研究、ダニ媒介病原体のインタフェースの特性評価とスクリーニングとダニ防御抗原14,35の特性評価のための有用なツールであることが示されている。特に、RNAiは、チック35の機能解析のための最も有効なツールとなっています。 方法論的に、RNAiは、おそらく多数の個人の遺伝子のノックダウンを可能にすることがより効率的な方法に進化していきます。ダニでdsRNA誘発性RNAiのメカニズムは、この種の35,36でこの遺伝学的ア ​​プローチの理解と活用に貢献する洗練されるべきである。マダニにおけるRNAiのオフターゲット効果の程度は、完全に14,27を対処する必要がある重要な問題です。最後に、RNAiはほとんどの可能性ダニの遺伝子制御とシステム生物学の研究に総合的な貢献を提供し、ダニ - 病原体のインタフェースとダニの蔓延とダニ媒介性病原体の伝播を制御するためのワクチン開発に影響を及ぼす可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Access RT-PCRシステム</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Purelink PCR精製キット</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Megascript RNAiキット</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>赤色歯科用ワックス</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックカップ（1.25 oz）および蓋</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>インスリン用注射器</td><td>Monoject</td><td></td><td>&amp;#189;&quot;、29ゲージの針を装着</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCR検出システム</td><td>Bio-Rad</td><td>複数</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt; を参照してください</td></tr></tbody></table>

ダニのrna干渉

RNA Interference in Ticks

ダニは、野生と家畜と人間の真正の吸血性外部寄生虫であり、ヒトの疾患1、畜牛業界世界中で2を影響を与える最も重要なベクトルのベクトルとしての蚊への2番目の世界的であると考えられている。チックはサブクラスダニ目、注文Parasitiformes、亜Ixodidaに分類され、北極から熱帯地域3に世界的に分布している。ダニの蔓延を制御するための努力にもかかわらず、これらの外部寄生虫は、人間と動物の健康に深刻な問題が4,5のまま。 RNA干渉（RNAi）6遺伝子機能や代謝経路への影響を判断するために、遺伝子発現の混乱を含む核酸系逆遺伝学的ア ​​プローチです。低分子干渉RNA（siRNA）は二本鎖RNA（dsRNA）とdsRNAのトリガ7月9日と同じ配列を含む細胞質mRNAの強力な配列特異的分解の結果によって開始されるRNAi経路のエフェクター分子である。 dsRNAをによって開始された転写後遺伝子サイレンシングのメカニズムがすべての真核生物で発見されたことはこれまで研究し、RNAiは、急速に機能ゲノミクス研究やその他のアプリケーション10のツールとしてさまざまな生物で開発されています。 RNAiは、遺伝子操作のための代替アプローチが利用できなかったり、信頼できない5,11であるダニや他の生物の中で最も広く使用されている遺伝子サイレンシング技術となっている。ダニの遺伝的特性は、RNAiの12,13の最近の応用まで限定されている。 RNAiは利用可能であることを短い時間で、それはダニの遺伝子機能を研究するための貴重なツール、ダニ媒介病原体のインタフェースの特性評価とスクリーニングとダニ防御抗原14の特性であることが証明されました。ここで、食物を与えられていないダニへのdsRNAの注入によるRNAiの方法が記載されている。それはこの実験的なアプローチから得られた知識は、基本的な生物学的システムの理解とダニの蔓延を制御し、ダニ媒介性病原体15-19伝送を予防するワクチンの開発に著しく寄与する可能性があります。

食物を与えられていないダニへのdsRNAの注射により、RNA干渉（RNAi）のための方法が記載されている。 RNAiは、遺伝子操作の他のメソッドの使用が制限されているダニの中で最も広く使用されている遺伝子サイレンシング技術です。

ダニのRNA干渉

ダニは、野生動物、家畜、およびヒトに寄生する絶対的な吸血性外部寄生虫であり、蚊に次いで世界的に重要な媒介動物であると考えられています...

この手順の全体的な目的は、注射によるマダニのRNA干渉技術を実証することです。まず、標的となる遺伝子の二本鎖RNAを合成します。その後、そのRNAをマダニに注射し、マダニを保湿チャンバー内で24時間保持します。この保持期間の後、マダニを羊などの動物に吸血させます。体重、脱皮および卵の位置などの吸血パラメータ、ならびにリアルタイム R-T-P-C-R による標的遺伝子または目的遺伝子の発現を測定します。最終的に、マダニの生物学的パラメータの評価およびリアルタイム R-T-P-C-R による遺伝子発現の解析を通じて、標的遺伝子のサイレンシングがマダニの生物学に及ぼす影響を示す結果を得ることができます。私たちの研究グループでは、ダニと病原体の接点における分子事象の解明に取り組んでおり、この基礎的な情報を利用して、ダニの寄生およびヒトや動物への病原体伝播を制御する方法の開発を目指しています。RNA干渉は、ダニの遺伝子操作が可能な唯一の手法であるため、この研究において不可欠なツールとなっています。多くのダニ遺伝子の機能はまだ解明されていません。RNA干渉を用いることで、交尾、生殖、吸血、消化、唾液腺機能、および病原体伝播におけるダニのベクター能力など、ダニの生物学的側面の多くにおけるダニ遺伝子の役割や遺伝子発現を定義することが可能になります。本手順のデモンストレーションは、当研究室のダニRNA干渉チームであるEd Lewin博士、大学院生、Busby、および私が行います。二本鎖RNAを生成するには、まずRNAのin vitro転写のためのT7プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成します。例えば、derma center vari lesinを用います。ここに示すオリゴヌクレオチドプライマーD eight A a T 75およびD eight DVT 73を使用してください。各オリゴヌクレオチドプライマー10 picomolesとダニのtotal RNA 1～10 nanogramsを用い、RT-PCRにより標的遺伝子を増幅させます。次に、PCR産物を精製します。その後、8 µLまたは約100 ngを用いて二本鎖RNAを合成します。注射に使用するマダニの準備として、まずマダニを以下の溶液で順次洗浄します：水道水、3%過酸化水素水、蒸留水（2回）、70%エタノール、そして最後に蒸留水で2回洗浄します。50 milliliterの使い捨て遠心チューブに入れ、振とうすることで各洗浄を行う。その後、溶液を細かいメッシュのワイヤースクリーンでろ過して除去する。ペーパータオルでダニの水分を吸い取り、実験内容に応じてダニを20から50匹ずつのグループに分注する。各グループを密閉蓋付きの1.25オンスのプラスチックカップに入れ、それぞれのカップに実験グループ名を記入します。次に、注射操作を行う3名で構成されるRNAiチームを編成します。1人目の担当者が、3×6インチの赤い歯科用ワックスシートに貼り付けた強力両面テープの上に、各マダニを配置します。2人目の担当者がダニに注射を行い、3人目の担当者が注射後のダニをモニターします。次に、ダニに二酸化炭素を吹きかけて活性化させ、生存しているダニを数え、実験群番号が記載されたカップに移動させます。チームメンバー全員が使い捨て手袋を着用する必要があります。ダニへの注射工程を開始するには、デュモン微細ピンセットを用いてダニを捕獲し、赤色の歯科用ワックスのシートに貼り付けた強力両面テープの上に、腹側を上にして固定します。ダニを5匹ずつグループにして密接に配置してください。5匹すべてのダニの口器の上に、マスキングテープの小さな断片を貼ります。さらに固定するため、注入者が注入プロセスを確認できるよう、体の大部分を露出させたままにします。ダニに注入するために、29ゲージの0.5インチ針を装着したインスリン用単回投与シリンジを用いて、外骨格の腹面右下領域に穴を開けます。次に、カスタムメイドのハミルトンシリンジと、45度の刃先を持つ33ゲージの1インチ針を用いて、0.2～0.5 µLの二本鎖RNA溶液を直ちにダニに注入します。二本鎖RNAが確実に配置され、保持されるように、針をダニの体腔の深くまで挿入してください。注入後に液体が放出されますが、針を深く挿入して注入することで、遺伝子サイレンシングを引き起こすのに十分な量の二本鎖RNAがダニの体腔内に蓄積されます。なお、過剰に注入すると血リンパの喪失を招き、ダニが死に至るため、注意が必要です。ダニに注入した後、直ちに微細ピンセットで両面テープから剥がし、プラスチック製のリカバリー容器に移してください。注入後、マダニは一時的に不活性状態になりますが、すぐにディッシュ内を這い回り始めます。二酸化炭素を吹きかけてマダニを活性化させてください。マダニが活発に動き出せば、注入部位の傷は速やかに治癒し、生存する可能性が高くなります。各実験群のダニの数を数え、密閉蓋付きのラベル付きプラスチックカップに各群を入れます。次の実験群に注入する前に、現在の群で死亡したダニを補充してください。ハミルトンシリンジに新鮮な3% hydrogen peroxideを満たして排出させ、次の実験群に注入する前にシリンジを洗浄してください。滅菌水を用いて15回洗浄し、続いてさらに15回洗浄します。ハミルトンシリンジのプランジャーを曲げないように注意してください。曲がってしまうとプランジャーがスムーズに動作しなくなり、ダニへの注射に必要な繊細な操作ができなくなります。注射後、ダニを水と硫酸カリウムを満たした容器が入ったチャンバーに入れ、高湿度状態で1日間維持します。次に、個々のマダニを羊に接着させた吸血セルに入れ、注入を行わなかった方の性の未注入マダニ（オスまたはメス）と同数ずつ合わせて吸血させます。約10日間の吸血完了後、または対照群のメスが宿主から脱落した時点で、吸血セルからメスのマダニを回収し、計量します。各グループのマダニを湿度チャンバー内で孵化させ、産卵が完了するまで培養します。グループごとの産卵量を評価するため、グループ内の全マダニによって産生された卵塊の重量を測定し、吸血後のマダニの表現型を評価します。生存したマダニの数を測定し、マダニの体重、卵の位置、および卵の受精率を算出します。ターゲットとなる遺伝子や研究目的によっては、R-T-P-C-Rを用いて遺伝子サイレンシングを確認するために、その他の解析を行う場合があります。吸血後、コントロール注入群および二本鎖RNA注入群の個々のマダニから唾液腺と腸を解剖し、個々の組織サンプルから全RNAを抽出します。リアルタイムR-T-P-C-Rを用いて個別の組織における標的遺伝子の転写物を分析し、RNAレベルをマダニの16 s ribosomal RNAで標準化します。gene norm法を用い、反応終了時に解離曲線を解析して、単一のアンプリコンのみが形成されていること、およびすべてのサンプルでアンプリコンが常に同一の温度範囲で変性することを確認します。その後、t検定を用いて、対照群を注射したマダニと二本鎖RNAを注射したマダニの間で、mRNAレベルの標準化されたCT値を比較します。ここに記載するプロトコルは、当研究室において多くの異なる外寄生性マダニ種へのRNAiに利用されてきました。マダニに注入する二本鎖RNAの量は、マダニのサイズによって異なります。大型のマダニ種では、より多くの量を注入することが可能です。参考文献は、本プロトコルの付随する文書に記載されています。プロトコルが正しく実施された場合、注入操作後24時間における死亡率は5%未満であるはずです。ここに、ダニにおける遺伝子ノックダウン後の典型的な表現型を示します。このパネルのダニには、ダニ保護抗原のスクリーニングに使用された二本鎖RNAのプールが注入されています。光学顕微鏡で観察したダニにおいて、ダニ組織内の細胞変性が認められることがあります。表現型の変化は、機能喪失を伴う場合があります。例えば、SUBINのRNAiを行うと、メスと正常に交尾できない不妊のオスが生じます。RNA干渉およびダニに関する検討の結果です。リアルタイムR-T-P-C-R、透過電子顕微鏡または共焦点顕微鏡、ゲノミクス、プロテオミクスなど、遺伝子サイレンシングが遺伝子およびタンパク質の発現、ならびにマダニの生物学的特性に及ぼす影響を判定するために他の手法を用いることができます。また、RNA干渉はマダニの細胞培養においても実施可能であり、マダニ細胞と病原体との相互作用を研究するためのin vitro手法を提供します。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術

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ダニのRNA干渉

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