ダニのRNA干渉

この手順の全体的な目標は、注射によるダニのRNA干渉の技術を実証することです。これは、最初に目的の遺伝子の二本鎖RNAを合成することによって達成されます。その後、RNAをダニに注入し、その後、ダニを湿度チャンバーに24時間保持します。

この保持期間の後、ダニはついにダニなどの羊などの動物を食べることが許可されます。体重、脱皮、卵子の位置などの摂食パラメータ、および標的遺伝子または目的の遺伝子の発現がリアルタイムR-T-P-C-Rによって決定されます。最終的には、ダニの生物学的パラメータの評価とリアルタイムR-T-P-C-Rによる遺伝子発現により、標的遺伝子のサイレンシングがダニの生物学に及ぼす影響を実証する結果を得ることができます。

私たちのグループは、マダニの病原体界面での分子イベントを特徴付けようとしているマダニと協力して、この基本情報を使用して、マダニの蔓延と病原体のヒトや動物への感染を制御する方法を開発しています。RNA干渉は、ダニの遺伝子操作に利用できる唯一の方法であるため、この研究に不可欠なツールとして浮上しています。多くのダニ遺伝子の機能は不明です。

RNA干渉により、交配、繁殖、摂食、消化、唾液腺機能、病原体の伝播に対するダニベクターの能力など、ダニ生物学の多くの側面におけるダニ遺伝子の役割と遺伝子発現を定義することができます。この手順を実演するのは、私たちの研究室のダニRNA干渉チーム、大学院生のエド・ルウィン博士、そしてバズビーと私です。二本鎖RNAを作製するには、まず、RNAのin vitro転写のために、T 7プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成します。

たとえば、derma center vari lesinです。ここに示すオリゴヌクレオチドプライマーD eight A A T 75、およびD eight DVT 73を使用します。各オリゴヌクレオチドプライマーの10ピコモルと1〜10ナノグラムのダニトータルRNAを使用して、R-T-P-C-Rによって標的遺伝子を増幅します。

次に、PCR産物を精製します。次に、8マイクロリットルまたは約100ナノグラムを使用して、二本鎖RNAを合成します。最初に注射用のダニを準備するには、次の一連の溶液、水道水3%過酸化水素蒸留水2回、70%エタノール、および蒸留水で2回の最終洗浄でダニを洗浄します。

50ミリリットルの使い捨て遠心分離チューブで各洗浄を振って行ってください。次に、細かいメッシュのワイヤースクリーンを介して溶液をデカントします。ダニをペーパータオルで乾かし、実験に応じてダニを20〜50のグループに分注します。

各グループを蓋がぴったりとフィットする1.25オンスのプラスチックカップに入れ、各カップに実験グループにラベルを付けます。次に、注入プロセスを実行する3人で構成されるRNAiチームを編成します。一人の人は、3 x 6インチの赤い歯科用ワックスのシートに貼り付けられた二重粘着テープに各ティックを配置します。

2人目はマダニを注射し、3人目は注射後にマダニを監視し、ダニに二酸化炭素を吸い込んでダニを活性化し、生きているマダニを数えて実験グループ番号がラベル付けされたカップに移します。すべてのチームメンバーは使い捨て手袋を着用する必要があります ダニ注射プロセスを開始するには、デュモンの細い鉗子を使用してダニを捕獲し、赤い歯科用ワックスのシートに貼り付けられた二重粘着テープに腹側を上にして置きます ダニを5つのグループに配置します。5つのダニすべての口の部分にマスキングテープの小さなストリップを置きます。

それらをさらに抑制するために、ダニ注入器が注入プロセスを観察できるように、体の大部分を露出させたままにします。ダニを注入するには、29 ゲージのハーフ インチ ニードルが取り付けられたモノ イジェクト インスリン シリンジを使用して、外骨格の腹面の右下象限に穴を開けます。次に、カスタムメイドのハミルトンシリンジと45度の斜角ポイントを備えた33ゲージの1インチ針を使用して、0.2〜0.5マイクロリットルの二本鎖RNA溶液をダニに直ちに注入し、針をダニのキャビティにしっかりと配置して、二本鎖RNAの配置と保持を確保します。

注射後に液体が放出されますが、注射用の針を深く配置することで、遺伝子サイレンシングを引き起こすのに十分な二本鎖RNAがダニ腔に沈着することが保証されます。ダニを注射すると、血リンパが失われ、ダニが死に至ります。ダニを注入した直後に、細い鉗子と一緒に二重粘着テープからダニを拾い上げ、プラスチック製の回収容器に入れます。

ダニは注射後、一時的に不活性のままになりますが、すぐに皿の周りを這い始めるはずです。ダニに二酸化炭素を吸い込んで活性化します。ダニが這って活動すると、注射創は急速に治癒し、おそらく生き残ります。

各実験グループのダニを数え、蓋がしっかりと取り付けられたラベル付きのプラスチックカップに各グループを入れます。次の実験グループを注入する前に、現在のグループで消滅するティックを置き換えます。次の実験グループを注入する前に、シリンジに新鮮な3%過酸化水素を充填して排出することにより、ハミルトンシリンジを洗浄します。.

15回、続いて滅菌水で15回洗浄します。ハミルトンシリンジのプランジャーを曲げないように注意してください、そうしないとプランジャーがスムーズに動かず、ダニ注射に必要な優しいタッチに反応しません。注射後、ダニを水と硫酸カリウムで満たされた容器のあるチャンバーに入れ、高湿度とそれらを1日間維持します。

次に、個々のマダニを羊に接着したダニ摂食細胞に配置し、注射されなかった性別に関係なく、同数の非注射されたオスまたはメスのダニを摂食できるようにします。約10日間摂食を完了した後、または対照の雌が脱落した後、宿主は卵子の位置が完了するまで湿度チャンバーでダニの各グループをインキュベートした後、摂食細胞から雌のダニを収集して振る。グループ内のすべてのダニによって生成される卵子の質量を量ることにより、グループごとに卵子の位置を評価し、摂食後のダニの表現型を評価します。

生き残ったダニの数を決定し、ダニの体重、卵子の位置、卵子の受精率を計算します。対象遺伝子と研究の目的によっては、R-T-P-C-Rによる遺伝子サイレンシングを確認するために他の分析が行われる場合があります。摂食後、コントロール注入群および二本鎖RNA注入群の個々のダニから唾液腺および腸を解剖し、次いで個々の組織サンプルから全RNAを抽出する。

個々の組織における標的遺伝子転写産物をリアルタイムR-T-P-C-Rで解析し、ダニ16のリボソームRNAに対するRNAレベルを正常化します。遺伝子ノルム法を使用して、反応の最後に解離曲線を実行し、アンプリコンが1つだけ形成され、アンプリコンがすべてのサンプルで同じ温度範囲で一貫して変性することを確認し、注入したコントロールと二本鎖のmRNAレベルの正規化されたCT値を比較します。RNAは、学生のT検定を使用してダニを注入しました。

ここで説明するプロトコルは、私たちの研究室で多くの異なるエキゾダニ種のRNAiに使用されています。ダニに注入される二本鎖RNAの量は、マダニのサイズによって異なります。ダニ種が大きいほど、より大きなボリュームに対応できます。

参考文献は、プロトコルの添付の書面による部分に記載されています。プロトコルが正しく行われていれば、24時間後の注射手順から得られる死亡率は5%未満であるはずです。マダニの遺伝子ノックダウン後の典型的な表現型をここに示し、ダニのパネルに二本鎖RNAのプールを注入し、マダニ保護抗原をスクリーニングするために使用しました。

光学顕微鏡で検査されるダニでは、ダニ組織の細胞変性が観察されることがあります。表現型の変化は、機能の喪失を伴うこともあります。例えば、SUBINのRNAIは、RNA干渉やダニに続いて、メスとうまく交配できない不妊のオスをもたらします。

遺伝子サイレンシングが遺伝子およびタンパク質の発現やダニの生物学に及ぼす影響を決定するために、リアルタイムR-T-P-C-R、光電子顕微鏡、共焦点顕微鏡など、他の方法も使用できます。ゲノミクスまたはプロテオミクス。RNA干渉は、ダニ細胞培養でも行うことができ、ダニ細胞の病原体相互作用の研究のためのin vitro法を提供します。