ダニのRNA干渉
2011年1月20日
食物を与えられていないダニへのdsRNAの注射により、RNA干渉（RNAi）のための方法が記載されている。 RNAiは、遺伝子操作の他のメソッドの使用が制限されているダニの中で最も広く使用されている遺伝子サイレンシング技術です。
この手順の全体的な目標は、注射によるダニのRNA干渉の技術を実証することです。これは、最初に目的の遺伝子の二本鎖RNAを合成することによって達成されます。その後、RNAをダニに注入し、その後、ダニを湿度チャンバーに24時間保持します。
この保持期間の後、ダニはついにダニなどの羊などの動物を食べることが許可されます。体重、脱皮、卵子の位置などの摂食パラメータ、および標的遺伝子または目的の遺伝子の発現がリアルタイムR-T-P-C-Rによって決定されます。最終的には、ダニの生物学的パラメータの評価とリアルタイムR-T-P-C-Rによる遺伝子発現により、標的遺伝子のサイレンシングがダニの生物学に及ぼす影響を実証する結果を得ることができます。
私たちのグループは、マダニの病原体界面での分子イベントを特徴付けようとしているマダニと協力して、この基本情報を使用して、マダニの蔓延と病原体のヒトや動物への感染を制御する方法を開発しています。RNA干渉は、ダニの遺伝子操作に利用できる唯一の方法であるため、この研究に不可欠なツールとして浮上しています。多くのダニ遺伝子の機能は不明です。
RNA干渉により、交配、繁殖、摂食、消化、唾液腺機能、病原体の伝播に対するダニベクターの能力など、ダニ生物学の多くの側面におけるダニ遺伝子の役割と遺伝子発現を定義することができます。この手順を実演するのは、私たちの研究室のダニRNA干渉チーム、大学院生のエド・ルウィン博士、そしてバズビーと私です。二本鎖RNAを作製するには、まず、RNAのin vitro転写のために、T 7プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成します。
たとえば、derma center vari lesinです。ここに示すオリゴヌクレオチドプライマーD eight A A T 75、およびD eight DVT 73を使用します。各オリゴヌクレオチドプライマーの10ピコモルと1〜10ナノグラムのダニトータルRNAを使用して、R-T-P-C-Rによって標的遺伝子を増幅します。
次に、PCR産物を精製します。次に、8マイクロリットルまたは約100ナノグラムを使用して、二本鎖RNAを合成します。最初に注射用のダニを準備するには、次の一連の溶液、水道水3%過酸化水素蒸留水2回、70%エタノール、および蒸留水で2回の最終洗浄でダニを洗浄します。
50ミリリットルの使い捨て遠心分離チューブで各洗浄を振って行ってください。次に、細かいメッシュのワイヤースクリーンを介して溶液をデカントします。ダニをペーパータオルで乾かし、実験に応じてダニを20〜50のグループに分注します。
各グループを蓋がぴったりとフィットする1.25オンスのプラスチックカップに入れ、各カップに実験グループにラベルを付けます。次に、注入プロセスを実行する3人で構成されるRNAiチームを編成します。一人の人は、3 x 6インチの赤い歯科用ワックスのシートに貼り付けられた二重粘着テープに各ティックを配置します。
2人目はマダニを注射し、3人目は注射後にマダニを監視し、ダニに二酸化炭素を吸い込んでダニを活性化し、生きているマダニを数えて実験グループ番号がラベル付けされたカップに移します。すべてのチームメンバーは使い捨て手袋を着用する必要があります ダニ注射プロセスを開始するには、デュモンの細い鉗子を使用してダニを捕獲し、赤い歯科用ワックスのシートに貼り付けられた二重粘着テープに腹側を上にして置きます ダニを5つのグループに配置します。5つのダニすべての口の部分にマスキングテープの小さなストリップを置きます。
それらをさらに抑制するために、ダニ注入器が注入プロセスを観察できるように、体の大部分を露出させたままにします。ダニを注入するには、29 ゲージのハーフ インチ ニードルが取り付けられたモノ イジェクト インスリン シリンジを使用して、外骨格の腹面の右下象限に穴を開けます。次に、カスタムメイドのハミルトンシリンジと45度の斜角ポイントを備えた33ゲージの1インチ針を使用して、0.2〜0.5マイクロリットルの二本鎖RNA溶液をダニに直ちに注入し、針をダニのキャビティにしっかりと配置して、二本鎖RNAの配置と保持を確保します。
注射後に液体が放出されますが、注射用の針を深く配置することで、遺伝子サイレンシングを引き起こすのに十分な二本鎖RNAがダニ腔に沈着することが保証されます。ダニを注射すると、血リンパが失われ、ダニが死に至ります。ダニを注入した直後に、細い鉗子と一緒に二重粘着テープからダニを拾い上げ、プラスチック製の回収容器に入れます。
ダニは注射後、一時的に不活性のままになりますが、すぐに皿の周りを這い始めるはずです。ダニに二酸化炭素を吸い込んで活性化します。ダニが這って活動すると、注射創は急速に治癒し、おそらく生き残ります。
各実験グループのダニを数え、蓋がしっかりと取り付けられたラベル付きのプラスチックカップに各グループを入れます。次の実験グループを注入する前に、現在のグループで消滅するティックを置き換えます。次の実験グループを注入する前に、シリンジに新鮮な3%過酸化水素を充填して排出することにより、ハミルトンシリンジを洗浄します。.
15回、続いて滅菌水で15回洗浄します。ハミルトンシリンジのプランジャーを曲げないように注意してください、そうしないとプランジャーがスムーズに動かず、ダニ注射に必要な優しいタッチに反応しません。注射後、ダニを水と硫酸カリウムで満たされた容器のあるチャンバーに入れ、高湿度とそれらを1日間維持します。
次に、個々のマダニを羊に接着したダニ摂食細胞に配置し、注射されなかった性別に関係なく、同数の非注射されたオスまたはメスのダニを摂食できるようにします。約10日間摂食を完了した後、または対照の雌が脱落した後、宿主は卵子の位置が完了するまで湿度チャンバーでダニの各グループをインキュベートした後、摂食細胞から雌のダニを収集して振る。グループ内のすべてのダニによって生成される卵子の質量を量ることにより、グループごとに卵子の位置を評価し、摂食後のダニの表現型を評価します。
生き残ったダニの数を決定し、ダニの体重、卵子の位置、卵子の受精率を計算します。対象遺伝子と研究の目的によっては、R-T-P-C-Rによる遺伝子サイレンシングを確認するために他の分析が行われる場合があります。摂食後、コントロール注入群および二本鎖RNA注入群の個々のダニから唾液腺および腸を解剖し、次いで個々の組織サンプルから全RNAを抽出する。
個々の組織における標的遺伝子転写産物をリアルタイムR-T-P-C-Rで解析し、ダニ16のリボソームRNAに対するRNAレベルを正常化します。遺伝子ノルム法を使用して、反応の最後に解離曲線を実行し、アンプリコンが1つだけ形成され、アンプリコンがすべてのサンプルで同じ温度範囲で一貫して変性することを確認し、注入したコントロールと二本鎖のmRNAレベルの正規化されたCT値を比較します。RNAは、学生のT検定を使用してダニを注入しました。
ここで説明するプロトコルは、私たちの研究室で多くの異なるエキゾダニ種のRNAiに使用されています。ダニに注入される二本鎖RNAの量は、マダニのサイズによって異なります。ダニ種が大きいほど、より大きなボリュームに対応できます。
参考文献は、プロトコルの添付の書面による部分に記載されています。プロトコルが正しく行われていれば、24時間後の注射手順から得られる死亡率は5%未満であるはずです。マダニの遺伝子ノックダウン後の典型的な表現型をここに示し、ダニのパネルに二本鎖RNAのプールを注入し、マダニ保護抗原をスクリーニングするために使用しました。
光学顕微鏡で検査されるダニでは、ダニ組織の細胞変性が観察されることがあります。表現型の変化は、機能の喪失を伴うこともあります。例えば、SUBINのRNAIは、RNA干渉やダニに続いて、メスとうまく交配できない不妊のオスをもたらします。
遺伝子サイレンシングが遺伝子およびタンパク質の発現やダニの生物学に及ぼす影響を決定するために、リアルタイムR-T-P-C-R、光電子顕微鏡、共焦点顕微鏡など、他の方法も使用できます。ゲノミクスまたはプロテオミクス。RNA干渉は、ダニ細胞培養でも行うことができ、ダニ細胞の病原体相互作用の研究のためのin vitro法を提供します。
概要
この記事では、二本鎖RNA（dsRNA）を注射する手法を通じて、ダニにおけるRNA干渉（RNAi）の方法について説明します。RNAiは、ダニの生物学と特定の遺伝子が果たす役割を研究するために使用される重要な遺伝子サイレンシング技術です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝学
- ダニの生物学
背景
- RNA干渉は遺伝子サイレンシングに広く使用される技術です。
- ダニの遺伝子操作の選択肢は限られています。
- ダニの遺伝子機能を理解することは、ダニ媒介疾患を制御するために不可欠です。
- この方法により、研究者はダニの生物学と遺伝子発現を探ることができます。
研究の目的
- ダニにおけるRNAi技術を実証すること。
- 遺伝子サイレンシングがダニの生物学に与える影響を評価すること。
- ダニ-病原体インターフェースにおける分子的事象を特徴づけること。
使用された方法
- 標的遺伝子の二本鎖RNAを合成する。
- 未餌食のダニにdsRNAを注射し、湿度チャンバーで保持する。
- ダニが宿主動物に寄生することを許可する。
- リアルタイムRT-PCRを使用して生物学的パラメータと遺伝子発現を評価する。
主な結果
- 生物学的評価を通じて成功した遺伝子サイレンシングの証明。
- 体重や産卵などのダニのパラメータの評価。
- ダニの生物学における特定の遺伝子が果たす役割についての洞察。
- ダニ制御と病原体伝播予防のための潜在的応用。
結論
- RNA干渉はダニ研究にとって価値あるツールです。
- この方法はダニの遺伝子機能の理解を深めます。
- 結果は、ダニ個体群と疾患の管理戦略に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
RNA interference (RNAi) in ticks enables functional genomics in a vector species with limited genetic tools, directly supporting target validation and mechanistic de-risking for vector-borne disease interventions. This approach provides predictive confidence in gene function assignments, informing early discovery and translational research for anti-tick strategies. The method's quantitative outputs and reproducibility position it as a critical capability for portfolio triage and advancement decisions in vector biology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in ticks through targeted gene silencing.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in feeding, reproduction, and vector competency.
- Facilitates predictive confidence in target selection for anti-tick interventions.
- Provides a platform for functional screening of candidate protective antigens.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tick models for downstream phenotypic and molecular assays.
- Standardizes gene knockdown protocols to ensure reproducibility across experiments.
- Generates quantitative outputs such as gene expression (RT-PCR) and phenotypic measures (weight, oviposition).
- Enables reliable evaluation of gene function for compound or antigen screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with disease-relevant tick-pathogen interactions.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of anti-tick targets.
- Informs risk-adjusted advancement of vaccine or therapeutic candidates targeting tick biology.
- Provides mechanistic insights that reduce late-stage biological risk in vector control portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This RNAi method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for vector biology, supporting both hypothesis-driven research and translational candidate evaluation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by silencing specific tick genes and measuring biological outcomes.
- Screening: Delivers assay-ready tick models with reproducible gene knockdown for downstream phenotypic and molecular screens.
- Analytics: Provides quantitative gene expression and phenotypic data for robust statistical comparison between experimental groups.
- Translational Research: Bridges basic gene function studies with preclinical evaluation of anti-tick interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional genomics across diverse tick species and gene targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in tick biology.
- Operational Value: Standardizes gene silencing and phenotypic assessment protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of anti-tick targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and de-risking of vector control candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, tick handling, and quantitative RT-PCR analysis.
- Demands specialized instrumentation for microinjection and real-time PCR quantification.
- Necessitates cross-team standardization of injection, feeding, and phenotypic assessment protocols.
- Adaptation may be needed for different tick species or gene targets based on size and biology.
- Mortality rates and technical variability must be monitored to ensure data reliability.
