次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

この方法は、ベクターマイクロバイオームが病原体のダイナミクスにどのような役割を果たしているのか、ベクターマイクロバイオームはどのように形成され、変化するのかなど、ベクター媒介性疾患生態学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、高い複製、高い分解能、同定が可能であり、さまざまな生態学的および環境条件下でベクターマイクロバイオームを正確に特性評価できることです。マイクロバイオームシーケンシングのセットアップ手順は習得が難しく、利用可能な製品や手法は多数ありますが、これらの手順を学習するための利用可能なリソースが少ないため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

この手順は、テキスト プロトコルで説明されているように、ティック コレクションから開始します。ダニから表面の汚染物質を除去するには、500マイクロリットルの過酸化水素を追加し、15秒間ボルテックスします。この洗浄を70%エタノールで繰り返し、次に再蒸留水で洗浄します。

ダニを新しいPCRチューブに入れ、風乾させます。このチューブでは、ダニを人間と乳棒で粉砕することにより、ダニ組織を機械的に破壊します。市販のDNA抽出キットに記載されている指示に従って、個々のダニからDNAを精製します。

最終容量100マイクロリットルまで溶出します。抽出ステップでネガティブコントロールを作成することは、疑わしい汚染物質を真のベクター微生物から後で区別するために重要です。抽出ステップ中およびその後のPCRステップで滅菌技術を使用することも、16Sシーケンシングで一般的な汚染の影響を最小限に抑えるために必要です。

アンプリコンPCRを、1マイクロモルの各プライマー5マイクロリットルと12.5マイクロリットルの市販PCRミックスを含む27.5マイクロリットルの反応液にセットアップします。また、個々のダニから5ナノグラム/マイクロリットルの濃度で抽出された5マイクロリットルのDNAも含まれる。チューブをサーモサイクラーに移動し、テキストプロトコルに記載されているプログラムを実行します。

PCRが完了したら、1.5%アガロースゲルにサンプルあたり4〜6マイクロリットルをロードして、PCR産物を視覚化します。増幅を確認するために、460塩基対のバンドを探します。サンプルごとに新しいPCRチューブを使用して、PCR産物を二重蒸留水と組み合わせ、合計60マイクロリットルを得ます。

DNA濃度が低いサンプルの場合は、アンプリコンPCRをトリプリケートで実施して増幅バイアスを減らし、サンプルをプールして濃縮します。常磁性ビーズを室温に戻して、使用前によくボルテックスしてください。48マイクロリットルの常磁性ビーズを60マイクロリットルのサンプルに加え、5分間インキュベートします。

溶液が透明になるまで、チューブを磁気ラックに5分間置きます。次に、上清を取り除きます。マグネティックラックにチューブを取り付けて、新たに調製した80%エタノールを500マイクロリットル加えます。

すべてのチューブにエタノールを追加した直後に、液体をピペットで取り出し、ビーズを取り除かないでください。エタノールの添加と除去をもう一度繰り返します。サンプルを風乾して余分なエタノールを除去するには、磁気ラック上のチューブを5分間開いたままにするか、ビーズに小さな亀裂が見えるまで放置します。

次に、20 マイクロリットルの TE バッファーを添加し、サンプルを磁石から室温でインキュベートします。5〜10分後、チューブを磁石に戻します。ビーズと液体が分離したら、上清を新しいチューブに移して、洗浄したPCR産物を得ます。

市販のライブラリインデックスキットからフォワードプライマーまたはリバースプライマー、あるいはその両方を選択することにより、各サンプルに独自のプライマーの組み合わせを割り当てます。デュアルプライマーまたはインデックスをサンプルに付着させるには、各プライマー2.5マイクロリットル、市販のPCRマスターミックス12.5マイクロリットル、ダブル蒸留水5マイクロリットル、および洗浄したアンプリコン製品2.5マイクロリットルを含むPCR反応液を調製します。チューブを、テキストプロトコルに詳述されているようにプログラムされたサーモサイクラーに移動します。

PCRが完了したら、1.5%アガロースゲルにサンプルあたり4〜6マイクロリットルをロードして、PCR産物を視覚化します。550塩基対のバンドを探して増幅を確認してから、前と同じようにクリーンアップ手順を実行します。精製された各バーコード製品の正確な定量を行うには、各サンプルと標準試料に対してqPCRを三重に実行し、各サンプルを3つ以上の希釈レベルで分析します。

6マイクロリットルのqPCRマスターミックス、2マイクロリットルの二重蒸留水、および2マイクロリットルのサンプルまたは標準を含む10マイクロリットルのqPCR反応を調製します。qPCRプレートをテキストプロトコルに記載されているようにプログラムされたリアルタイムPCR装置に移し、実行を実行します。定量後、すべての個々のライブラリを1つのチューブに等量加えて、結合されたライブラリを作成します。

結合したライブラリとシーケンシングコントロールを希釈して変性させた後、結合した混合物をシーケンシングフローセルにロードします。最適な光学系を得るために、ロード前にフローセルを徹底的に洗浄します。次に、フローセルをシーケンサーにロードし、アンプリコン配列解析を行います。

ここには、シーケンス数の正規化のための希薄化曲線が示されています。これらの曲線は、サンプルあたり2000配列まで希薄化するだけで、観察された操作上の分類単位の完全な多様性を捕捉するのに十分であることを示しています。配列リードの希薄化および品質フィルタリング後、アルファおよびベータダイバーシティ出力が実行される。

ここに示されているのは、処理に基づいてダニのマイクロバイオーム組成がどのように異なるかを示す、自動的に生成された原理座標分析プロットです。さらに、各サンプル内に存在する微生物の可視化は、ここでは門レベルで示されており、すべてのサンプルに対して自動的に作成されます。この手順を試行する際には、配列データの解釈に重大な影響を与える可能性のある微生物汚染の影響を最小限に抑えるために、無菌技術を維持することを忘れないようにすることが重要です。

この手順に続いて、組織学的染色などの他の方法を実行して、観察された微生物がベクター内のどこにあるかなどの追加の質問に答えることができますか?この方法の開発後、分子生態学の分野の研究者がベクター内の微生物相互作用の役割を探求し、これが病原体の伝播にどのように影響するかを調査する道を開きました。