HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で拡大

この手順の全体的な目的は、人工抗原提示細胞（aAPC）を用いて、養子免疫療法への応用のためにヒト抗原特異的CTLをex vivoで増殖させることです。まず、HLA-A2 IgGおよび抗ヒトCD28モノクローナル抗体を磁性ダイナビーズに結合させることでaAPCを作製します。手順の第2段階では、aAPCの品質管理およびペプチドローディングを行います。第3段階では、ヒト末梢血からCD8陽性T細胞を単離します。手順の最終段階では、CD8陽性T細胞をaAPCとともに1週間インキュベートします。

その後、CTLを回収し、特性評価を行います。その後、そのまま使用するか、あるいは目的の特異性と増殖レベルに達するまで、さらに1週間再刺激します。最終的に、AAPCの存在下で増殖させたCTLが抗原特異性の向上を示したことを、タイター測定や染色結果によって確認できます。本日は、HI-IGベースのAAPCシステムと、既存の他の手法と比較して、CMV特異的なヒトCTLをex vivoで効率的に増殖させるための本システムの使用方法について解説します。

当社のA A PC技術には、いくつかの重要な利点があります。市販されており、数量に制限がなく、さらにA A PCはすべてのHRAA two陽性ドナーに使用できる点です。それでは、ストック（約400 million beads）からM four 50 epoxy beads 1 mLを、滅菌済みのスクリューキャップ付きガラスバイアルに移してください。

1 mLのboid bufferを加え、ビーズがバイアルの側壁に吸着している間にガラスバイアルをdyin all magnet NBC oneに固定して、ビーズを1回洗浄します。吸引により上清を除去します。boid buffer、HLA A two IG dimer、および抗ヒトCD 28モノクローナル抗体の混合液中でビーズを再懸濁します。

次に、タンパク質とビーズの結合を促進させるため、ガラスバイアルをローテーターを用いて4 °Cで24時間回転させます。続いて、チューブをMPC oneマグネットに設置し、ホウ酸バッファーをすべて除去します。バッファーの除去後、ビーズを1 mLのビーズ洗浄バッファーで2回洗浄します。

次に、ビーズを1 mLのビーズ洗浄バッファー中でインキュベートし、バイアルを4 °Cでさらに24時間回転させ、ビーズ上の残留タンパク質結合部位をブロッキングします。その後、ガラスバイアルからバッファーを除去し、1 mLの新鮮なビーズ洗浄バッファーに交換します。100 µLのfax洗浄バッファーをfaxチューブに移し、そこに5×10⁵個のビーズを加えます。

1 µLのanti muse IgG 1 PEおよび1 µLのanti muse IgG 2を用いてビーズを染色し、4 °Cで20分間静置します。各染色サンプルに3 mLのfax洗浄バッファーを加えます。その後、4 °C、300 ×gで5分間遠心分離し、A A PCをペレット化します。

A A PCを新鮮なfaxバッファーで再懸濁し、フローサイトメーターで直ちに染色結果を読み取ります。前述と同様に、ビーズを滅菌PBSで2回洗浄します。次に、10 µLのCMVペプチドをビーズに添加します。

ヘモサイトメーターでビーズを計数し、日付とビーズ濃度（beads/mL）をラベルに記載します。A A PCをペプチドとともに4°Cで少なくとも3日間インキュベートします。HLA A2陽性ドナーから採取した新鮮な末梢血約100 mLを10本のナトリウムヘパリン入りVacutainerチューブに入れ、300 ×gで10分間遠心分離します。

室温で、上層の血漿層を吸引して慎重に取り除きます。回収した血漿の代わりに滅菌PBSを加え、血液を滅菌済みT 75培養フラスコに移します。15 mLのファイヤルパックおよび4本の50 mLコニカルチューブにすべての血液を回収した後、ピペッティングにより血液とPBSを十分に混合します。

各チューブ内のフィコールの上に、血液細胞30～35 mLをゆっくりと重層させます。フィコールと血液細胞の界面を明確に保ったまま、血液とフィコールの密度勾配を、室温で500 g、20分間遠心分離します。この際、層間の界面を明確に維持するため、ブレーキをオフにし、加速は可能な限り低く設定してください。遠心後、最上層の血漿層を吸引除去し、次にセロロジカルピペットを用いてPBMC層を慎重に吸引します。PBMCを新しい50 mLコニカルチューブに移します。すべてのPBMCを回収し終えたら、細胞に30 mLのPBSを加え、遠心分離します。

次に、上清を除去し、ペレットを洗浄します。30 millilitersのPBSでさらにもう一度洗浄して残留成分を除去した後、Milton Human CD eight positive T-cell isolation kitを用いてCD eight陽性T細胞集団を濃縮します。製造元のプロトコルに従ってCD eight陽性T細胞をカウントし、fax分析によって純度を確認します。

100万個のCTLを8 mLのT細胞増殖因子（2倍濃度）含有培地と8 mLの完全RPMI培地の混合液に懸濁し、1 × 10⁶ A A PCミックスを添加します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルU底組織培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液を160 µLずつ分注します。細胞を37 °C、5% CO₂条件下で7日間インキュベートします。

4日目に、各ウェルにT細胞増殖因子2含有培地を80 µL添加して細胞を給餌します。7日目に細胞を回収し、磁石に近づけて古いA A PCを除去します。すべてのビーズがバイアルの壁面に付着したことを確認してください。

細胞を回収して別の50 milliliterコニカルチューブに移し、細胞数をカウントします。メーカーのプロトコルに従い、テトラマー染色によってA A PCの抗原特異性を判定します。回収した細胞を同じ条件下で新しいA A PCと再反応させ、抗原特異的な細胞数を増殖させます。

以下は、A A PCによって生成されたCMV特異的CTLを1週間培養した後の、代表的なテトラマー染色結果である。ここに示されているのは、A-A-P-C-C-M-Vによって生成されたCMV特異的CTLの代表的な細胞内サイトカイン染色結果であり、テトラマー染色による特異性は61%であった。本手法は、最適な培養条件の特定やT細胞機能調節の要件など、T細胞分野における重要な課題を解決するために利用できる。

Lowly法はウイルス性疾患の治療に関する知見を提供しました。また、本法は癌などの他の分野にも応用可能です。