Name: HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で拡大 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶHLA A2-Igベース人工抗原提示細胞を用いたヒト抗原特異的細胞傷害性T細胞の効率的な生体外拡張法。この方法は、がんや感染症の細胞治療への応用が期待される画期的な免疫療法技術です。

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我々は、有用な議論のためにアーロンSelyaに感謝します。この作品は、JS、ジョンズホプキンスマラリア研究所からのパイロット助成金やMOへの防衛助成PC 040972の部にNIHの助成金AI29575、CA108835、AI077097によってサポートされていました

1。作り、HLA - A2 - IgをベースaAPC <ol><li>滅菌ホウ酸緩衝液を準備する<ol><li> 0.1Mを作るために水にホウ酸を溶かす。 pHを7.0に調整する。 </li><li> 4で0.22μm滅菌フィルターや店舗をフィルタ℃に</li></ol></li><li>滅菌ビーズ洗浄バッファーを準備します。 <ol><li> 956ミリリットルPBS W / Oマグネシウムやカルシウムを取る。 </li><li> 30ミリリットルのヒトAB血清を追加。 </li><li> EDTA 2mMの最終濃度を追加。 </li><li> 0.1gsodiumアジを追加。 </li><li> 4で0.22μmの滅菌フィルターや店舗をフィルタ℃に</li></ol></li><li> 、在庫から約4億ビーズ（ビーズは、血球計数器でカウントすることができます）インビトロジェンM - 450エポキシビーズを1mlを取り、滅菌、スクリュートップガラスバイアルに入れ。 </li><li>ビーズは、バイアルの側面に付着しながら、DYNAL磁石MPC - 1に対するバイアルを入れ、吸引して上清を取り除く。ホウ酸緩衝液を1mlで一回ビーズを洗浄する。 </li><li> 1ミリリットルホウ酸緩衝液およびHLA - A2 - Igの二量体と抗ヒトCD28モノクローナル抗体（クローン9.3）の20μgの20μgの混合物でビーズを再懸濁します。 </li><li>ビーズ共役への蛋白質：ローテーター上のガラスバイアルを入れ、4℃で回転℃で24時間。 </li><li> MPC - 1マグネットにチューブを置き、すべてのホウ酸緩衝液を取り除く。 </li><li> 1ミリリットルビーズ洗浄バッファーで2回ビーズを洗浄してください。 </li><li> 1ミリリットルビーズ洗浄バッファーでビーズをインキュベートし、4℃で回転させる℃で24時間。ビーズ洗浄バッファーは、ヒトAB血清が含まれているので、それは、ビーズ上のすべての残留タンパク質結合部位をブロックします。 </li><li>ガラス瓶から上清を除去する、1mlの新鮮なビーズの洗浄緩衝液で置き換えてください。 </li></ol> 2。 aAPCとペプチド負荷、ストレージの品質管理<ol><li> FACSチューブに洗浄液100μlのFACSへ〜5 × 10 5ビーズを追加し、抗マウスIgG1 - PE（HLA - A2 - IgのFc部分を認識）および抗マウスIgG2a - FITC（認識1μlの1μlのと染色抗CD28モノクローナル抗体のFc部分）。洗浄バッファーFACSで20分間染色した後、再び洗浄し、フローサイトメーター（図4）によってすぐに染色の結果をお読みください。 </li><li>ビーズ上にペプチド負荷：1ミリリットル滅菌PBSでガラスバイアルに二回ビーズを洗浄する。 1ミリリットル滅菌PBSで再懸濁しは、CMVペプチド​​（1mg/ml）の10μlを加える</li><li>血球計算盤によるビーズをカウントし、日付と濃度とのバイアルにラベルを付けます。 </li><li> aAPCは、HLA - A2 -グロブリン二量体の上にペプチド結合の十分な時間を確保するために、4℃で少なくとも3日後にペプチドインキュベーション使用するための準備が整いました。ビーズは4℃で保存され、少なくとも6ヶ月は継続することができます。 </li></ol> 3。人間のCTLの分離<ol><li> 10 BDのヘパリンナトリウムバキュテイナ管に健康的なHLA - A2陽性ドナーからの新鮮な末梢血の〜100ミリリットルを収集する。 21ゲージ針または溶血を防ぐために、大きい方を使用してください。 </li><li>室温で10分間300xgで遠心分離</li><li>慎重に吸引して上部のプラズマレイヤーを削除します。プラズマは、培地のためのサプリメントとして使用することができます。 </li><li>滅菌PBSで収集した血漿を交換し、滅菌T75培養フラスコまたは50ミリリットルコニカルチューブに血液を移す。上下にピペッティングによりよくPBSで血を混ぜる。 </li><li>一度、すべての血液が収集され、4つの追加50ミリリットルコニカルチューブを準備し、をFicoll - Paqueプラスの15ミリリットルを追加します。 </li><li>ゆっくりオーバーレイ各チューブのフィコールの上に血液細胞の30〜35ミリリットル。フィコールと血液細胞との間のインターフェースが異なるしてください。 </li><li>室温で20分間500xgで遠心分離します。ブレーキ"オフ"と層の間に明確なインタフェースを維持するために可能な限り低加速を回します。 </li><li> seriologicalピペットを使用して、慎重にPBMC層を吸引し、新鮮な50ミリリットルコニカルチューブにPBMCを収集する。すべてのPBMCを10分間400xgでPBSとスピンの30ミリリットルを追加収穫されている場合。上清を捨て、すべての残留フィコールを削除するには、30ミリリットルのPBSでもう一度洗浄する。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってミルテニーヒトCD8 + T Cellアイソレーションキットを使用することによりCD8 + T細胞の分離に進みます。細胞-このキットは非常に（通常&gt; 95％）CD8を枯渇させることによりCD8 +細胞のために豊かに。 </li><li> CD8 + T細胞を数える。予想される純度は95％以上でなければなりません。この使用2 × 10 5細胞を確認し、CD4/3/8 FACS解析を実行する。残りのCTLは、どちらの抗原特異的aAPC刺激に対してすぐに使用することも、将来使用するために凍結することができます。 </li></ol> （4） 体外 aAPCベースの培養系で <ol><li>培地を準備<ol><li>完全RPMI培地に加え、プラズマ、8％のT細胞増殖因子自家5％のドナー：TF（ラボ4で作られたT細胞増殖因子、）2X培地用。 </li><li></ol></li><li>再懸 ​​濁し、完全RPMI培地中のTF 2X培地を加えた8ミリリットルの8ミリリットルで100万CTLは、1を追加× 10 6 aAPCを、よく混ぜる。 </li><li> 96ウェルU底の組織培養プレート上にプレートの細胞へのマルチチャンネルピペッターを使用してください。 （ウェルあたり160μlを） </li><li> 37培養細胞° C、7日間、5％CO 2 incubater。 80μlの/ウェルTF 2X培地で4日目に細胞を養う。 </li><li>細胞は7日目に収穫する準備が整いました。収穫後は、磁石から細胞を配置し、古いaAPCを取り外します。 </li><li>抗原特異性は、製造業者のプロトコルに従ってテトラマー染色により決定することができる。表現型の染色と細胞内サイトカイン染色は、私たちの以前の研究の3に従って実行されます。 </li><li>収穫された細胞は、同じ条件の下で再びaAPCと色を保ち続けることができます。細胞数や抗原特異性は、反復刺激後に増加すると予想される。 </li></ol> 5。代表的な結果： HLA A2 - Igおよび抗CD28接合後のaAPCの例を図4に示されています。成功したタンパク質コンジュゲーションは、対応する抗体染色の明確なシフトによって明らかである。末梢血中のCMV特異的CTLの頻度がaAPCを介した刺激の単週後に、通常は0.5から1パーセントですが、特異度は55に到達することができます - 93％（図2および3）。抗原特異的CTLの拡張は、さまざまなドナーの間で非常に可変することができますが、結果は同じドナー内で再現可能です。外挿によって、CMV特異的細胞の拡大は、前駆体のレベルを直接ex vivoで （データは示さず）に比べて倍の数千になることができます。細胞内サイトカイン染色（図3）これらの拡張されたCTLは、長期細胞培養と有意な増殖の後、多官能性ではなく、疲れていることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。同種HSCTにおける養子免疫療法のためのヒトCTLのaAPCベースのex vivoでの展開の代表的なフローチャート<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 文化の一週間後にaAPCによって生成されたCMV特異的CTLの図2。代表テトラマー染色の結果<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。aAPCによって生成されたCMV特異的CTLの代表的な細胞内サイトカイン染色の結果（CMV特異性は61％であった） <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4 M - 450エポキシビーズの代表的な染色の結果抗マウスIgG1 - PEと抗マウスIgG2の- FITCで染色したタンパク質コンジュゲーション後の

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々はここで説明するaAPCシステムは、抗原の多様性に対する人間のCTLのex vivoでの拡大のための効率的なシステムです。特別なケアは、タンパク質共役および96ウェルプレート培養でaAPCとCTLの均一な分布の品質に関しては注意が必要です。我々は百万倍の4に抗原特異的CTLを展開した中に、8週間以上のためにCTLを拡大することができたこのアプローチを使用する。細胞株や他の無細胞プラットフォーム5活用した様々な人工APCシステムが行われているが、公表されたデータによると、すべてのシステムは、異なるアプリケーションをサポート拡張し、特異性に関して持つ独自のプロファイルを持っています。 CTLの質は量と同様に重要であるので重要なのは、、私たちのシステムによって生成されたCMV特異的CTLのpolyfunctionalityは、優れた抗ウイルス効果を付与することが期待されています。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>バキュテイナ管（ヘパリンを含む） </td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 367874 </td></tr><tr><td>ヒトCD8 + T Cellアイソレーションキット</td><td>国内でのみ有効</td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td>ダイナビーズM - 450エポキシ</td><td>インビトロジェン</td><td> 140.11 </td></tr><tr><td> DYNAL MPC - 1マグネット</td><td>インビトロジェン</td><td> 120 - 01D </td></tr><tr><td>をFicoll - Paqueプラス</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI培地1640 </td><td>ギブコ</td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA - A2 -グロブリン二量体X </td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC四量体（HLA - A2 - CMV）- PE </td><td>ベックマンコールター</td><td> T20099 </td></tr><tr><td>ファルコン明確な96穴マイクロプレート</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 353077 </td></tr><tr><td>ラット抗マウスIgG2a - FITC </td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 553390 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG1 - PE </td><td>インビトロジェン</td><td> P21129 </td></tr><tr><td>ヒト血清型AB </td><td>アトランタ生物学的製剤</td><td> S40110 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD8a - FITC </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F0772 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD8a - APC </td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 340684 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトIFNγ- FITC </td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 340449 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトTNFα- PE </td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla - igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトctlの>拡大

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

最適なエフェクター機能を持つCTLは、様々な細胞内感染症や癌に対する保護を媒介に重要な役割を果たしている。しかし、個人が抑制免疫微小環境を示すことがあると、活性化CTLとは対照的に、彼らの自家抗原提示細胞が耐性化する傾向にあることまたは抗原特異的CTLをanergize。結果として、まだ実験段階にもかかわらず、CTLベースの養子免疫療法は、がんやウイルス感染など、様々な疾患に対する有望な治療になるために進化してきました。初期の実験では、ex vivoで拡張されたCMV（サイトメガロウイルス）特異的CTLは、免疫不全の同種骨髄移植患者におけるCMV感染症の治療のために使用されている。それはこれらの患者の生命を脅かすCMVのウイルス血症、拡張されたCTLを受けている患者のどれもがCMVに関連する病気を開発するのが一般的ですが、抗CMV免疫の養子転送CTL 1で確立されている暗示。有望な結果はまた、悪性黒色腫が観察されており、がん2の他のタイプに延長することができる。 人間のCTLを刺激し、拡大し、ex vivoでの多くの方法がありますが、現在のアプローチは、コストと技術的な限界によって制限されます。例えば、現在のゴールドスタンダードは、自家DCの使用に基づいています。これにより、各患者は、白血球のかなりの数を寄付することが必要とも非常に高価で面倒です。また、DC拡張CTLのin vitroでの特性の詳細は、これらが唯一の次善のエフェクター機能3を持っていることを明らかにした。 ここでは、養子免疫療法（図1）のためのヒトCMV特異的CTLのex vivoでの拡大のための高効率aAPCベースのシステムを提示する。 aAPCは、ヒトHLA - A2 - Igの二量体と抗CD28mAb 4セルサイズの磁気ビーズを結合させることによって行われた。 aAPCが行われると、彼らは興味のある様々なペプチドでロードされ、月間は継続することができます。このレポートでは、aAPCはCMV、pp65を（NLVPMVATV）から支配的なペプチドを負荷した。一週間のためのaAPCと健康なドナーからのヒトCD8 + CTLを精製培養した後、CMV特異的CTLは、98％（図2）に特異性で劇的に増加し、10,000人以上の倍に増幅することができる。より多くのCMV特異的CTLが必要な場合は、さらなる拡張が容易にaAPCで反復刺激することによって達成することができます。表現型および機能的特徴は、これらの拡張された細胞は、エフェクター、メモリー表現型を持つと（図3）TNFαとIFNγの両方を大量に作る示しています。

抗原特異的T細胞の誘導と拡大のための新しいDCの独立した方法が記載されている。 HLA A2 - Igはベースの人工的な抗原提示細胞（aAPC）が効率的に多様な抗原特異性のCTLを拡大するHLA - A2制限されたペプチドがロードされます。この技術は、CTLベースの養子免疫療法のための大きな可能性を秘めている。

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

最適なエフェクター機能を備えたCTLは、さまざまな細胞内感染症やがんに対する防御を媒介する上で重要な役割を果たしています。しかし、個体によっては...

この手順の全体的な目的は、人工抗原提示細胞（aAPC）を用いて、養子免疫療法への応用のためにヒト抗原特異的CTLをex vivoで増殖させることです。まず、HLA-A2 IgGおよび抗ヒトCD28モノクローナル抗体を磁性ダイナビーズに結合させることでaAPCを作製します。手順の第2段階では、aAPCの品質管理およびペプチドローディングを行います。第3段階では、ヒト末梢血からCD8陽性T細胞を単離します。手順の最終段階では、CD8陽性T細胞をaAPCとともに1週間インキュベートします。その後、CTLを回収し、特性評価を行います。その後、そのまま使用するか、あるいは目的の特異性と増殖レベルに達するまで、さらに1週間再刺激します。最終的に、AAPCの存在下で増殖させたCTLが抗原特異性の向上を示したことを、タイター測定や染色結果によって確認できます。本日は、HI-IGベースのAAPCシステムと、既存の他の手法と比較して、CMV特異的なヒトCTLをex vivoで効率的に増殖させるための本システムの使用方法について解説します。当社のA A PC技術には、いくつかの重要な利点があります。市販されており、数量に制限がなく、さらにA A PCはすべてのHRAA two陽性ドナーに使用できる点です。それでは、ストック（約400 million beads）からM four 50 epoxy beads 1 mLを、滅菌済みのスクリューキャップ付きガラスバイアルに移してください。1 mLのboid bufferを加え、ビーズがバイアルの側壁に吸着している間にガラスバイアルをdyin all magnet NBC oneに固定して、ビーズを1回洗浄します。吸引により上清を除去します。boid buffer、HLA A two IG dimer、および抗ヒトCD 28モノクローナル抗体の混合液中でビーズを再懸濁します。次に、タンパク質とビーズの結合を促進させるため、ガラスバイアルをローテーターを用いて4 °Cで24時間回転させます。続いて、チューブをMPC oneマグネットに設置し、ホウ酸バッファーをすべて除去します。バッファーの除去後、ビーズを1 mLのビーズ洗浄バッファーで2回洗浄します。次に、ビーズを1 mLのビーズ洗浄バッファー中でインキュベートし、バイアルを4 °Cでさらに24時間回転させ、ビーズ上の残留タンパク質結合部位をブロッキングします。その後、ガラスバイアルからバッファーを除去し、1 mLの新鮮なビーズ洗浄バッファーに交換します。100 µLのfax洗浄バッファーをfaxチューブに移し、そこに5×10⁵個のビーズを加えます。1 µLのanti muse IgG 1 PEおよび1 µLのanti muse IgG 2を用いてビーズを染色し、4 °Cで20分間静置します。各染色サンプルに3 mLのfax洗浄バッファーを加えます。その後、4 °C、300 ×gで5分間遠心分離し、A A PCをペレット化します。A A PCを新鮮なfaxバッファーで再懸濁し、フローサイトメーターで直ちに染色結果を読み取ります。前述と同様に、ビーズを滅菌PBSで2回洗浄します。次に、10 µLのCMVペプチドをビーズに添加します。ヘモサイトメーターでビーズを計数し、日付とビーズ濃度（beads/mL）をラベルに記載します。A A PCをペプチドとともに4°Cで少なくとも3日間インキュベートします。HLA A2陽性ドナーから採取した新鮮な末梢血約100 mLを10本のナトリウムヘパリン入りVacutainerチューブに入れ、300 ×gで10分間遠心分離します。室温で、上層の血漿層を吸引して慎重に取り除きます。回収した血漿の代わりに滅菌PBSを加え、血液を滅菌済みT 75培養フラスコに移します。15 mLのファイヤルパックおよび4本の50 mLコニカルチューブにすべての血液を回収した後、ピペッティングにより血液とPBSを十分に混合します。各チューブ内のフィコールの上に、血液細胞30～35 mLをゆっくりと重層させます。フィコールと血液細胞の界面を明確に保ったまま、血液とフィコールの密度勾配を、室温で500 g、20分間遠心分離します。この際、層間の界面を明確に維持するため、ブレーキをオフにし、加速は可能な限り低く設定してください。遠心後、最上層の血漿層を吸引除去し、次にセロロジカルピペットを用いてPBMC層を慎重に吸引します。PBMCを新しい50 mLコニカルチューブに移します。すべてのPBMCを回収し終えたら、細胞に30 mLのPBSを加え、遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを洗浄します。30 millilitersのPBSでさらにもう一度洗浄して残留成分を除去した後、Milton Human CD eight positive T-cell isolation kitを用いてCD eight陽性T細胞集団を濃縮します。製造元のプロトコルに従ってCD eight陽性T細胞をカウントし、fax分析によって純度を確認します。100万個のCTLを8 mLのT細胞増殖因子（2倍濃度）含有培地と8 mLの完全RPMI培地の混合液に懸濁し、1 × 10⁶ A A PCミックスを添加します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルU底組織培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液を160 µLずつ分注します。細胞を37 °C、5% CO₂条件下で7日間インキュベートします。4日目に、各ウェルにT細胞増殖因子2含有培地を80 µL添加して細胞を給餌します。7日目に細胞を回収し、磁石に近づけて古いA A PCを除去します。すべてのビーズがバイアルの壁面に付着したことを確認してください。細胞を回収して別の50 milliliterコニカルチューブに移し、細胞数をカウントします。メーカーのプロトコルに従い、テトラマー染色によってA A PCの抗原特異性を判定します。回収した細胞を同じ条件下で新しいA A PCと再反応させ、抗原特異的な細胞数を増殖させます。以下は、A A PCによって生成されたCMV特異的CTLを1週間培養した後の、代表的なテトラマー染色結果である。ここに示されているのは、A-A-P-C-C-M-Vによって生成されたCMV特異的CTLの代表的な細胞内サイトカイン染色結果であり、テトラマー染色による特異性は61%であった。本手法は、最適な培養条件の特定やT細胞機能調節の要件など、T細胞分野における重要な課題を解決するために利用できる。Lowly法はウイルス性疾患の治療に関する知見を提供しました。また、本法は癌などの他の分野にも応用可能です。

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Immunology and Infection

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