HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で拡大

この手順の全体的な目標は、養子免疫療法で潜在的な使用のために、人工抗原提示細胞またはヒト抗原特異的CTLのex vivo増殖のためのA PCを使用することです。これは、まずHLA A two IGおよび抗ヒトCD 28モノクローナル抗体を磁気ダイナビーズに結合させてA A PCを作ることによって達成されます。手順の2番目のステップは、A APの品質管理とペプチドローディングを実行することです。手順の3番目のステップは、ヒト末梢血CDの8つの陽性T細胞を単離することです。手順の最終ステップは、CD 8個の陽性T細胞をA PCで1週間インキュベートすることです。

その後、CTLは、使用する前に収穫され、特性評価されるか、またはさらに1週間再刺激されて、その特異性と増殖の望ましいレベルを達成します。最終的には、A A PCの存在下で拡大したCTLが抗原特異性が高いことを示すteumまたは染色結果を得ることができます。今日は、HI IGベースのA A PCシステムと、このシステムを使用して、他の既存の方法と比較してCMV特異的ヒトCTL exvivoを効率的に拡大する方法を紹介します。

当社のA A PCテクノロジーには、いくつかの重要な利点があります。既製品で、数量に制限なく、たとえば、A PCをHRAAの2つのポジティブドナー全員に使用できるとしましょう。さて、始めましょう 約4億個のビーズの在庫から1ミリリットルのM 4 50エポキシビーズを滅菌済みのねじ込みガラスファイルに移します。

1ミリリットルのボイドバッファーを追加してビーズを一度洗浄し、次にガラスバイアルをダイインオールマグネットNBCバイアルに当てて、ビーズをバイアルの側面に接着します。吸引Resusによってスナットを取り外します。ボイドバッファーHLA A two IGダイマーと抗ヒトCD 28モノクローナル抗体の混合物にビーズを懸濁します。

次に、タンパク質とビーズの結合を促進するために、ガラスバイアルを回転子で摂氏4度で24時間回転させます。次に、チューブをMPCワンマグネットに入れ、ホウ酸塩バッファーをすべて取り外します。バッファーを取り除いた後、1ミリリットルのビーズ洗浄バッファーでビーズを2回洗浄します。

次に、ビーズを1ミリリットルのビーズ洗浄バッファーでインキュベートし、バイアルをさらに4°Cで回転させてさらに24時間回転させて、ビーズに残留するタンパク質結合部位をブロックします。次に、ガラスバイアルからバッファーを取り出し、1ミリリットルの新鮮なビーズ洗浄バッファーと交換します。100マイクロリットルのファックス洗浄バッファーをファックスチューブに移し、次に5番目のビーズに10の5倍を追加します。

氏4度で20分間染色した後、1マイクロリットルの抗ミューズIgG、1マイクロリットルの抗ミューズIgG、1マイクロリットルの抗ミューズIgG、1マイクロリットルの抗ミューズIgGでビーズを染色します。3ミリリットルのファックス洗浄バッファーを各染色サンプルに。次に、摂氏4度で300Gを5分間使用して、A PCをペレット

Reusは、A A PCを新鮮なファックスバッファーに懸濁し、フローサイトメーターで染色結果を直ちに読み取ります。前回と同様に、ビーズを滅菌PBSで2回洗浄します。次に、ビーズに10マイクロリットルのCMVペプチドをロードします。

ヘモサイトメーターでビーズをカウントし、ビーズの日付と濃度でラベルを付けます。ミリリットルあたりのビーズとして。A PCをペプチドと少なくとも3日間、摂氏4度でインキュベートし、HLA Aからの約100ミリリットルの新鮮な末梢血を、2つの陽性ドナーであるHLA Aから300Gの100Gのナトリウムヘパリンバキュテナーチューブに遠心

室温で、上部のプラズマ層を吸引して慎重に除去します。収集した血漿を滅菌PBSに交換し、血液を滅菌T75培養フラスコに移します。15ミリリットルのフィアルパックと4本の50ミリリットルの円錐管ですべての血液が収集されたら、ピペッティングで血液とPBSをよく混合します。

各チューブのフィアルの上に30〜35ミリリットルの血球をゆっくりと重ねます。fialと血液細胞の間の界面を区別し、室温で500 GSで血液とfial勾配を20分間遠心分離し、ブレークオフと加速をできるだけ低くして、スピンが上部の血漿層から吸引した後、層間の明確な界面を維持し、血清学的ピペットを使用してPBMC層を慎重に吸引します。すべてのPBMCが30ミリリットルのPBSで細胞に収穫されたら、PBMCを新しい50ミリリットルの円錐管に移し、それらを遠心分離します。

次に、スーパーナットを捨ててペレットを洗います。30ミリリットルのPBSでもう一度、残留したfiコールを除去し、次にMilton Human CD 8陽性T細胞単離キットを使用してCD8陽性T細胞集団を濃縮する。メーカーのプロトコルに従って、CDの陽性T細胞を8個カウントし、ファックス分析で純度を確認します。

8ミリリットルのT細胞増殖因子2×培地と8ミリリットルの完全RPMI培地に100万CTLを懸濁し、6つのAとPCミックスの10倍を添加します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり160マイクロリットルの細胞を96ウェルU底組織培養プレートにプレートします。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素中で7日間インキュベートします。

4日目に、T細胞増殖のウェルあたり80マイクロリットルを細胞に供給します。ファクター2×培地。7日目に細胞を採取し、すべてのビーズがバイアルの壁に付着したときに、細胞を磁石に当てて古いA A PCを取り出します。

細胞を採取して別の50ミリリットルの円錐管に移し、細胞数を数えます。A A PCの抗原特異性は、メーカーのプロトコールに従って四量体染色することにより決定します。採取した細胞を同じ条件下で新しいA A PCで再生し、抗原特異性に増加する細胞数を生成します。

これは、A A PCによって1週間の培養後に生成されたCMV特異的CTLの代表的な四量体染色結果です。A-A-P-C-C-M-V特異性によって生成されたCMV特異的CTLの代表的な細胞内サイトカイン染色結果は、四量体染色によって61%でした。この方法は、T細胞の機能調節に最適な培養条件や要件をどのように特定できるかなど、T細胞分野の重要な質問に答えるために使用できます。

Lowly法は、ウイルス性疾患の治療に関する洞察を提供しました。また、がんなど他の分野にも応用できます。