特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法
2011年12月3日
研究では、MSTのツールとして提案したヒト/ブタ/ウシDNAウイルス、アデノウイルスとpolyomaviruses、特定の定量化のために定量PCRを用いて水中の硝酸塩による尿/糞便汚染または汚染源の同定のための費用対効果の高い方法を説明します。
特定のヒトおよび動物ウイルスを使用した微生物源追跡のための費用対効果の高い方法。この研究では、微生物源追跡ツールとして提案されているヒトブタ、ウシ、DNAウイルス、アデノウイルス、およびポリオーマウイルスの特異的定量のための定量的PCRを使用して、糞便尿汚染または水中の硝酸塩による汚染の原因を特定するための費用対効果の高い方法について説明しています。私たちは、脱脂乳を用いた有機凝集法による有機凝集法による沈殿物からのウイルス核酸の抽出と、定量的PCRを用いたヒトウシまたはブタDNIウイルスの定量による10リットルの水サンプルからのウイルス濃度のプロトコルを開発しました。
ビタミンの微生物汚染が重大な健康リスクを表すことはよく知られており、汚染源を知る必要があります。私たちは、微生物源追跡ツールとして非常に普及しているDNAウイルスの使用を提案しています。選択されたウイルスは、アデノウイルスとポリオーマウイルスです。
これらのウイルスは、年間を通じて、すべての地理的領域で永続的に排泄されています。以前の研究で研究されました。私たちは、水中のウイルスの頑健で低コストな濃縮法を開発し、プリンアデノウイルスやウシポリオーマウイルスの定量のためのQPCRアッセイの開発に取り組んでいます。
さらに、QPCRで試験されたヒトアデノウイルス、NGCポリオーマウイルス、水サンプルの採取、水中のヒト汚染のマーカーとしても使用します。この研究では、水サンプルあたり 10 リットルの 4 回の反復を、底が平らなプラスチック容器に収集し、プロセス制御として 1 つの追加サンプルを収集します。この最後のサンプルには、コントロールとして使用される既知量のウイルス粒子が播種されます。
ネガティブコントロールは、1つの追加のプラスチック10リットル容器に条件水道水を使用して実験室で準備されます。サンプルに大量の懸濁物質、砂、その他の物質が見られる場合は、15分間沈殿させ、水を新しい容器に移します。有機凝集によるウイルス濃縮。
低または中程度の汚染水サンプル中のウイルスを検出するには、少なくとも数リットルの水からウイルスをはるかに少ない体積に濃縮する必要があります。濃縮手順には、10リットルの水サンプルの酸性化、スキムミルク重力を使用した凝集、群れの沈降、および10ミリリットルのリン酸緩衝液での沈殿物の収集が含まれ、プロセスを開始し、人工海水中にスキムミルクを配置する溶液は、1リットルの人工海水に10グラムのスキムミルク粉乳を溶解し、pHを3.5に慎重に調整することによって調製されます。塩酸を使用すると、群れが見えるはずです。
使用する直前に溶液を準備するか、摂氏4度で24時間保存します。水サンプルを攪拌し、サンプル中の導電率を測定します。1.5ミリシーメンス未満の場合は、海塩が追加されます。
塩酸を添加して、水サンプルのpHを3.5に調整します。コンディショニング前後のサンプルのpH、および使用した塩酸の量を記録します。導電率も記録する必要があります。
pHを調整した後、10リットルの水サンプルに100ミリリットルのプレフフロードスキムミルク、1%を加え、ウイルスが群れに吸収されるようにサンプルを8〜10時間攪拌します。プロセス制御として使用するスパイクサンプルの場合、制御ウイルスの標準容量(たとえば、1 ミリリットル)をサンプルに追加します。攪拌を止め、群れの沈殿物を重力で8〜10時間放置します。
16時間後、通常は翌日に、堆積物を収集できるようになります。これを行うには、蠕動ポンプを使用して上清を取り除きます。群れと一緒に沈殿物、約500ミリリットルを遠心分離機のボトルに集めます。
pref flodのスキムミルクpH 3.5を加えて鍋のバランスをとり、高速遠心分離機、8、000 Gs 30分で摂氏4度で鍋を遠心分離します。遠心分離機が停止したらすぐに、遠心分離機から遠心分離ポットを慎重に取り外します。上澄みを非常に穏やかに注ぎ取り、捨てます。
各遠心分離ボトルのペレットを最終容量の10ミリリットルのリン酸に溶解し、核酸を抽出し、ウイルスを定量します。ウイルス濃縮物はウイルス核酸の抽出に使用され、特定のアデノウイルスとポリオーマ 目的のウイルスは A-Q-P-C-R によって定量されます。key amp viral RNA mini kitを使用して核酸抽出を行います。
140に存在するウイルスの溶解。マイクロリットルのウイルス濃縮物は手動で行われ、総核酸は80マイクロリットルまで抽出されます。このキットは、Key cubeなどの自動化されたプラットフォームの使用を可能にします。
次のステップは、ウイルスゲノムの定量化です。tac manプローブ、ヒトアデノウイルス、JCポリオーマウイルス、およびウシポリオーマウイルスを用いた定量PCRを用いてサンプル中のコピーを、同じ96ウェルプレートで定量することができます。すべてのアデノウイルスが同じ増幅サイクルを使用するため、ブタアデノウイルスは、標的ウイルスの定量のために独立したプレートで別々に試験する必要があります。
定量的PCRミックスを清潔な別の領域で調製します。混合物が調製されたら、コントロールを含めて各ウェルに15マイクロリットルを割り当てます。別の領域にサンプル10マイクロリットルから核酸抽出物を追加し、直接実行し、各サンプルの精製水で10倍希釈して、ターゲットの追加後の1つの反応の総量は25マイクロリットル、混合物の15プラスサンプルの10または標準のカバーは、接着剤カバーの一部でサンプルを含むウェルを覆います。
次の手順のために、カバーの他の部分を保持してください。DNA標準懸濁液のAB希釈。10から0から10から6のゲノムコピーまでの10マイクロリットルは、3倍にしてマイクロリットルを装い、標準DNAカバー専用のマイクロpbitを使用します。
以前に切断された接着剤カバー付きの標準を含むウェル。この図は、標準懸濁液サンプルとコントロールの分布を示しています。96ウェルプレートで。
適切なシステムでQPCRを実行し、振幅金を10分間活性化した後、適切なパラメーターを選択します。摂氏95度で、反応が完了すると40サイクルの増幅が行われます。データと結果は、使用した機器のユーザーマニュアルに記載されているとおりに保存します。
DNAの量は、必要に応じて希釈係数を修正した後に得られたデータの中央値として定義されます。ブタアデノウイルスの定量で得られた増幅プロットと標準曲線は、0.999 の相関係数を示しました。許容可能な傾き値は、手順に従うとマイナス 3.1 からマイナス 3.6 の範囲になります。
記載されているヒトおよび動物のウイルスは、汚染源を特定するために、高レベルの硝酸塩が存在する地域の地下水サンプルでテストされています。分析された4回の反復は、ブタアデノウイルスの平均値、1リットルあたり10〜2ゲノムコピーあたり7.74の肯定的な結果を示し、これはサンプリングサイトの周辺領域におけるブタスラリーの存在に関連しており、地下水中の糞便ブタ汚染の存在を証明するでしょう。試験したサンプルのいずれにも人体への汚染は存在しませんでした。
ウイルス学的データは、ネステッドPCRおよびシーケンシング分析によって確認されました。結論。本研究では、地下水試料を分析した結果を発表し、ヒトやウシの汚染がない場合にブタ由来の汚染を提示した。この手順は、入浴水、海水、河川水の分析にも適用されています。
ここでは、これらのツールを地下水中の汚染源の特定に適用するための手順を示し、開発された環境汚染源を検出する方法の適用可能性の例として、高レベルの硝酸塩を示します。
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概要
この研究は、水中の糞便および尿の汚染源を特定するための費用対効果の高い方法を提示します。定量的PCRを利用し、この方法は微生物源追跡のためのツールとして、アデノウイルスおよびポリオマウイルスを含む特定のヒト、ブタ、ウシのDNAウイルスを定量化します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物源追跡
- 環境微生物学
- 水質評価
背景
- 微生物汚染は重大な健康リスクをもたらします。
- 汚染源の特定は公衆衛生にとって重要です。
- DNAウイルスは広範囲に存在し、効果的な追跡ツールとして機能します。
- アデノウイルスとポリオマウイルスは、その関連性のために選択されています。
研究目的
- 水中の糞便汚染を追跡する方法を開発すること。
- 水サンプルから特定のDNAウイルスを定量化すること。
- 汚染源の理解を深めること。
使用した方法
- 10リットルの水サンプルからのウイルス濃縮。
- ウイルス核酸抽出のための脱脂乳を使用した有機絮凝。
- 定量的PCRを用いたヒト、ブタ、ウシのDNAウイルスの定量化。
- 選択されたウイルス指標を通じた汚染源の評価。
主要な結果
- 標的ウイルスの成功的な濃縮と定量化。
- 微生物源追跡のための方法の有効性の実証。
- アデノウイルスとポリオマウイルスを信頼できる指標として特定。
- 水汚染評価のための費用対効果の高いソリューションの提供。
結論
- 開発された方法は汚染源を特定するのに効果的です。
- DNAウイルスの利用は微生物源追跡の取り組みを強化できます。
- このアプローチは水質モニタリングを大幅に改善できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying contamination sources in water is critical for public health risk assessment and environmental monitoring. This method provides a cost-effective, high-throughput approach to microbial source tracking using species-specific DNA viruses as reliable indicators. It supports predictive confidence in contamination source attribution and enables scalable screening across diverse water matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through quantification of human adenoviruses, JC polyomaviruses, porcine adenoviruses, and bovine polyomaviruses as specific biomarkers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible protocol for viral concentration from 10-liter water samples using skimmed milk flocculation and gravity sedimentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral genome copy data via qPCR with TaqMan probes, enabling sensitive detection down to 1-10 genome copies per test tube for porcine and bovine markers.
- Operational Value: Facilitates high-throughput processing of multiple samples in parallel using 96-well plate formats and automated nucleic acid extraction platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking viral markers to contamination sources such as porcine slurries in groundwater, as demonstrated in nitrate-impacted samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity from environmental sampling to molecular quantification, with nested PCR and sequencing used for virological data confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into environmental microbiology workflows from sample concentration through nucleic acid extraction to quantitative viral measurement, enabling source attribution in water quality assessment pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding contamination origins by quantifying virus-specific biomarkers associated with human, porcine, or bovine fecal sources.
- Screening: Delivers assay readiness through a one-step concentration protocol that eliminates bottlenecks of traditional two-step methods, allowing simultaneous processing of large sample sets.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR standard curves and amplification plots, with acceptable slope values between -3.1 and -3.6 and correlation coefficients of 0.999 for porcine adenovirus quantification.
- Translational Research: Connects environmental detection to source identification through correlation of viral markers with known contamination sources, such as porcine slurry in high-nitrate groundwater.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for viral concentration and quantification applicable to bathing waters, seawater, river water, and groundwater across diverse geographical areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in source tracking by using persistent, geographically widespread DNA viruses excreted in feces and/or urine.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-step protocol involving acidification, skimmed milk flocculation, gravity sedimentation, and centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes at 4°C.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in environmental monitoring by providing cost-effective, high-sensitivity detection of contamination sources without requiring expensive infrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of remediation efforts by distinguishing between human, porcine, and bovine contamination sources in water samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental virology, nucleic acid extraction, and quantitative PCR assay design and execution.
- Needs access to centrifugation equipment capable of 8,000 × g, nucleic acid extraction kits (e.g., Key Amp Viral RNA Mini Kit), and qPCR systems with TaqMan probe compatibility.
- Demands standardization of pH adjustment to 3.5 using hydrochloric acid, skimmed milk flocculation (1% v/v), and gravity sedimentation timing (8–10 hours) across teams and sites.
- Involves adaptation considerations for varying water matrices, including pre-sedimentation for high-turbidity samples and conductivity adjustment with sea salts when below 1.5 mS/cm.
- Includes practical limitations such as the need for separate qPCR plates for porcine adenoviruses due to potential probe compatibility issues, even when using similar amplification cycles.
