特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法

ヒトおよび動物特有のウイルスを用いた、費用対効果の高い微生物源追跡法。本研究では、微生物源追跡ツールとして提案されているヒト、ブタ、ウシのDNAウイルス、アデノウイルス、およびポリオマウイルスの特異的定量のための定量PCRを用い、水中の糞便、尿、または硝酸塩による汚染源を特定するための費用対効果の高い方法について記述します。我々は、有機凝集による10 literの水サンプルからのウイルス濃縮、沈殿物からの脱脂粉乳を用いたウイルス核酸の抽出、および定量PCRを用いたヒト、ウシ、またはブタのDNAウイルスの定量化に関するプロトコルを開発しました。

ビタミンの微生物汚染が重大な健康リスクとなることはよく知られており、その汚染源を特定する必要があります。我々は、普及率の高いDNAウイルスを微生物源追跡ツールとして利用することを提案しました。選択したウイルスは、アデノウイルスおよびポリオマウイルスです。

これらのウイルスは、一年を通じて、またあらゆる地域で持続的に排出されています。これらは先行研究で調査されてきました。我々は、水中のウイルスを濃縮するための堅牢で低コストな手法を開発し、さらに、ピューリンアデノウイルスおよびウシポリオマウイルスの定量のためのqPCRアッセイの開発に取り組んできました。

さらに、水中のヒト汚染のマーカーとして、qPCRで検査したヒトアデノウイルスおよびNGCポリオマウイルスも使用します。水サンプルの採取について、本研究では、水サンプルあたり10 literを4回繰り返し採取し、平底のプラスチック容器に回収します。また、プロセス管理用として追加で1サンプルを採取します。この最後のサンプルには、コントロールとして使用する既知量のウイルス粒子を添加します。

別の10リットルのプラスチック容器に水道水を用意し、実験室で陰性対照を調製します。サンプルに懸濁物質や砂などの不純物が多く含まれている場合は、15分間静置して沈殿させた後、水を新しい容器に移してください。有機凝集によるウイルスの濃縮を行います。

低汚染または中汚染の水試料からウイルスを検出するには、少なくとも数リットルの水からウイルスをはるかに小さい容量に濃縮する必要があります。濃縮手順には、10リットルの水試料の酸性化、脱脂粉乳を用いた凝集、凝集塊の重力沈降、およびリン酸緩衝液10ミリリットルへの沈殿物の回収が含まれます。プロセスの開始にあたり、人工海水中の脱脂粉乳溶液を調製するため、1リットルの人工海水に10グラムの脱脂粉乳粉末を溶解させ、塩酸を用いてpHを3.5に慎重に調整します。これにより、凝集塊が目視で確認できるはずです。

溶液は使用直前に調製するか、4 °Cで24時間保存してください。水サンプルを攪拌し、サンプル内の導電率を測定します。導電率が1.5 millisiemens未満である場合は、海塩を添加します。

塩酸を添加して、水サンプルのpHを3.5に調整します。調整前後のサンプルのpHと、使用した塩酸の量を記録してください。また、導電率も記録する必要があります。

pH調整後、10 Lの水試料に1%の脱脂粉乳100 mLを加え、ウイルスが凝集塊に吸着するように8〜10時間攪拌します。工程管理用として用いるスパイク試料には、例えば1 mLなどの標準量のコントロールウイルスを試料に添加します。攪拌を停止し、凝集塊を8〜10時間自然沈降させます。

16時間後（通常は翌日）に、堆積物を回収することができます。回収するには、ペリスタルティックポンプを使用して上澄み液を除去します。凝集物を含む堆積物を約500 milliliters回収し、遠心分離ボトルに入れます。

pH 3.5の脱脂スキムミルクを加えてチューブの重量を均等にし、高速遠心機を用いて4°C、8,000 Gsで30分間遠心分離します。遠心分離が停止したらすぐに、チューブを注意深く取り出します。上清を非常にゆっくりと注ぎ出して廃棄してください。

各遠心ボトル内のペレットを、最終容量が10 milliliterになるようにリン酸緩衝液で溶解し、ウイルスの核酸抽出および定量を行います。ウイルス濃縮液を用いてウイルス核酸の抽出を行い、目的の特定のアデノウイルスおよびポリオマウイルスをA-Q-P-C-Rにより定量します。key amp viral RNA mini kitを用いて核酸抽出を実施してください。

140 µLのウイルス濃縮液に含まれるウイルスの溶解を手動で行い、全核酸を80 µLに抽出します。本キットは、Keycubeなどの自動化プラットフォームでの使用が可能です。

次のステップは、Taqmanプローブを用いた定量PCRによるウイルスゲノムコピー数の定量です。ヒトアデノウイルス、JCポリオーマウイルス、およびウシポリオーマウイルスは、同一の96ウェルプレートで定量することが可能です。これらはすべて同じ増幅サイクルを使用するため、標的ウイルスの定量において、ブタアデノウイルスは別の独立したプレートで個別に検査する必要があります。

清潔な別のエリアで定量PCRミックスを調製します。ミックスの調製後、コントロールを含む各ウェルに15 µLずつ分注します。別のエリアで、サンプルから抽出した核酸を10 µLずつ添加します。各サンプルについて、原液および精製水による10倍希釈液をデュプリケートで実行します。ターゲット添加後の1反応あたりの全量は、ミックス15 µLとサンプルまたは標準物質10 µLの合計25 µLとなります。サンプルが入ったウェルを粘着カバーの一部で覆います。

カバーの残りの部分は次のステップのために保持しておきます。DNA標準懸濁液の希釈を行います。10 copiesから10⁶ genome copiesまでの10 µLを、標準DNA専用のマイクロピペットを用いて、各3連（triplicate）で分注します。

あらかじめ粘着カバーを切り抜いた、標準物質を含むウェル。この図は、96ウェルプレートにおける標準懸濁液サンプルおよびコントロールの配置を示している。

適切なシステムを用いてQPCRを実施し、Amplitude Goldを10分間活性化した後、適切なパラメータを選択します。反応完了後、95 °Cで40サイクルの増幅を行います。データと結果は、使用した機器のユーザーマニュアルに従って保存してください。

DNA量は、必要に応じて希釈倍率で補正した後に得られたデータの中央値として定義します。豚アデノウイルスの定量で得られた増幅プロットおよび標準曲線は、相関係数0.999を示しました。本手順における許容される勾配値の範囲は、-3.1から-3.6までです。

汚染源を特定するため、高濃度の硝酸塩が検出された地域の地下水サンプルを用いて、既知のヒトおよび動物ウイルスを検査した。分析した4つの反復試料では、豚アデノウイルスの平均値が1リットルあたり10⁻²ゲノムコピーの7.74倍という陽性結果を示した。これはサンプリング地点周辺における豚スラリーの存在に関連していると考えられ、地下水における豚の糞便汚染の存在を証明するものである。なお、検査したすべてのサンプルにおいて、ヒトによる汚染は認められなかった。

ウイルス学的データは、ネステッドPCRおよびシーケンシング解析によって確認された。結論。本研究では、地下水サンプルの分析結果を提示し、ヒトまたはウシ由来の汚染がない状態で、ブタ由来の汚染が存在することを示した。また、本手順は海水浴場、海水、および河川水の分析にも適用された。

ここでは、これらのツールを地下水中の汚染源の特定に適用する手順を提示します。環境中における汚染源を検出するための開発手法の適用可能性を示す例として、高濃度の硝酸塩を含む事例を紹介します。