Name: 特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶ 微生物ソーストラッキングの費用対効果の高い手法。定量PCRを用いてヒト、豚、牛由来のDNAウイルス（アデノウイルス、ポリオーマウイルス）を定量し、水質汚染源を特定する方法を解説します。

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この研究の一部は、欧州連合（EU）の研究枠組み7資金プロジェクトは、（契約番号513648）VIROBATHE、VIROCLIME（契約番号は243923で、スペイン政府は&quot;保健省ドEducación Y Ciencia&quot;（プロジェクトAGL2008-05275-C01/ALI）によってサポートされていました）と水のカタロニア庁、AgènciaカタラーナドゥAigua（ACA）、Departamentド制御I Millora DELS Ecosistemes水泳で。開発研究の間マルタルシニョールはカタロニア政府&quot;AGAUR&quot;（FI - DGR）の仲間だった。

1。水試料中に存在するウイルス粒子の濃度<ol><li>水試料の収集とコンディショニング<ol><li> 2の最小値を収集するプロセス制御などの平らな底部及びつの余分なサンプルをプラスチック容器内の試料あたり10 Lの複製。この最後のサンプルは、ウイルス粒子の既知量をスパイクし、コントロールとして使用されます。 注：これは、添加サンプルのための特別な別の材料を（瓶、チューブ、など）を使用することが推奨されます。 </li><li> conductimeterのキャリブレーションを確認し、必要に応じて再キャリブレーション。つの余分なプラスチック製の10リットルの容器で、以前に十分な導電率に調整した水道水を（1.6下記参照）を使用してネガティブコントロールを用意します。 </li><li>添加サンプルの場合：サンプルにコントロールウイルスの標準量（水10Lあたり約10 5ゲノムコピー）を追加します。回避飛散やエアロゾルを攪拌して混ぜる。ポジティブコントロールは、アデノウイルスsの珍しい株で構成されています可能性がHAdV - 35またはMS2のようなバクテリオファージとしてUCH。 </li><li>サンプルは、浮遊物質（砂または他の材料）の高い量を提示した場合、15分間堆積物にしましょう​​。新しい容器に水を移す。 </li><li> 1 N HClの添加によって3.5（± 0.1）に水試料のpHを調整します。このステップでは、ウイルスの濃度が重要であるので、pHを適切に調整されていることを確認してください。 HClを添加しながら激しく撹拌しながらで十分に水を混ぜる。 （注：pH値は3.5追加1 M水酸化ナトリウムより低い場合）。 </li><li>導電性を調整します。サンプルは、1500μS/ cm以上の導電性を持っている場合、この手順は不要です。伝導率が1500μS/ cmの凝集物質の形成（フロック）が保証されていないよりも低い場合は人工的な海の塩（シグマ）を添加することによって1500μS/ cmの導電率を調整する。海の塩を加えながら撹拌することにより、積極的に混ぜる。 </li><li>エアコンの前と後のサンプルのpHを記録するだけでなく、使用される塩酸のsはボリューム。導電率は、pHを調整した後、記録されるべきである。常に新鮮なHCl溶液でpHメーターとconductimeter電極を消毒、10％ナトリウムtiosulphate液で塩素を除去すると、最後に蒸留水ですすいでください。 </li></ol></li><li>あらかじめ凝集1パーセントスキムミルクの準備（PSM） <ol><li> pHメーターとconductimeterのキャリブレーションを確認し、必要に応じて再キャリブレーション。 </li><li> 1リットルの人工海水に10グラム脱脂粉乳（ディフコ）を溶解することによって事前に凝集したスキムミルク溶液（1％PSM、w / v）の準備（脱塩素水道水とオートクレーブ1Lに人工的な海の塩の33.3 gを溶解）し、慎重に1N HClで3.5にpHを調整する。フロックが表示されるはずです。 4で使用または保管される直前に溶液を調製℃で24時間インキュベートする。脱塩素のために水100mlあたり10％のtiosulphate溶液1mlを使用してください。 </li></ol></li><li>水試料中に存在するウイルス粒子の凝集<ol><li> 10 - Lの水サンプルを1％のPSMの100 mlを追加します。 </li><li>フロックに吸着するウイルスを可能にするために80〜10時間のサンプルをかき混ぜる。 80から10時間後に攪拌をオフにするタイマーを使用</li><li>攪拌を停止し、80〜10時間撹拌重力によるフロック沈降をしましょう</li></ol></li><li>フロックを収集し、再溶解する。遠心分離<ol><li>ペリスタルティックポンプとプラスチック製のチューブに接続されているプラ​​スチック製のピペットを用いて上清を取り除く。添加サンプルのために上清は、ボトルと内部手続きに従って消毒に収集する必要があります。すべてのケースではペレットを集めるように注意してください。 </li><li>遠心ボトルにフロックと堆積物（約500 ml）を収集する。 </li><li> PSMのpHを3.5の添加により鉢のバランスをとる。 </li><li> 4時30分、8,000 xgで高速遠心機でポットを遠心℃にとすぐに遠心分離機が停止するように、慎重に遠心から遠心ポットを削除します。 </li><li>非常にグラムently捨て、上清を捨てる。感染性物質のための適切な措置に従ってください。 </li><li>各遠心ボトルにペレットを溶解するリン酸緩衝液7 mlを追加します。 </li><li>フロックが溶解された後、測定し、10 mlの全体積に到達するためのリン酸緩衝液を加える。 </li><li>ボルテックスによるウイルス濃縮物をホモジナイズし、さらなる分析に必要になるまで-80℃で凍結する必要があるきれいなマイクロチューブに10 mlを配布する。 </li></ol></li></ol> 2。核酸抽出<ol><li>製造元の指示に従って別途準備ウイルスRNAミニキットでの核酸抽出を行います。このキットは、自動化されたプラットフォーム（などQiacubeなど、キアゲン）の使用が可能になります。 </li></ol> 3。ヒトアデノウイルスの定量的PCR（HAdV）、JCのpolyomaviruses（JCPyV）、ブタアデノウイルス（PAdV）とウシpolyomaviruses（BPyV） <ol><li>サンプル中のゲノムコピーの定量化<ol><li>準備のTaqMan環境PCRマスターミックス2倍に（Applied Biosystems社）を使用して、クリーンな別々の領域で定量PCRミックス。反応は、光学接着剤のカバーで覆われた96ウェル光学反応プレートで行われます。マスターミックスの濃度は、プライマーおよびプローブは、表1で説明されています。 </li><li>一度ミックスはよく（3.2参照）、コントロールを含めてそれぞれに、アリコート15μlを準備している。ターゲットの追加後に一つの反応の合計量は、（15μlのミックス+10μlのサンプルまたは標準）25μlのようになります。 </li><li>別のエリア内のサンプル（10μL）からの核酸抽出を追加。直接実行し、重複して各サンプルの精製水で10倍希釈。接着剤カバーの一部のサンプルを含むウェルをカバーする、次のステップのためにカバーの他の部分を保持します。 </li><li>三連で10 0〜10 6GC/10μlからのDNAの標準懸濁液（10μlの）の希釈液を追加し、排他的に標準に使用するマイクロピペットを用いて標準のDNA。プラスミドDNAを破壊し、それぞれの使用後にマイクロピペットをきれいにするためのUV照射を装備した領域での規格を追加することをお勧めします。プレカット接着剤のカバーと基準を含むウェルをカバーしています。 注：ゲノムコピーの定量化に使用される標準的な懸濁液を調製するためには、標的DNA領域はプラスミドと直鎖状にクローン化されるべきである。以下のアドレスでは、定量PCRに使用するプラスミドDNAのテンプレートを使用して標準曲線を作成する方法についての詳細な手順を見つける： <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li>適切なパラメータを（接着剤カバーと各ウェルの総容積の使用、などを考慮して）選択して適切なシステムに定量PCRを行います。 95℃で10分間のAmpliTaq Goldの次の活性化° C、増幅の40サイクル、次のように実行されています：95 ° Cで1​​5秒と1 60 minでHAdV、JCPyVとBPyVのためのC、および95℃、55℃20℃と60℃PAdVのためのCで20歳代で15秒。 </li><li>使用される機器の取扱説明書で説明されているように反応は、ストアのデータと結果を完了したら。 DNA量は、必要に応じて希釈率を修正した後、得られたデータの中央値として定義されます。 </li></ol></li><li>コントロール<ol><li>ポジティブとネガティブコントロールを使用してください。アッセイは、ミックスが蛍光を生成しないことを証明するために複数の非テンプレートコントロール（NTC）を含める必要があります。研究試料中に存在する阻害剤に起因する潜在的な酵素阻害を評価するために、正のプロセス制御を実行することをお勧めします。 </li><li>標準DNAのおよびプロセス制御から2つの異なる希釈液のqPCRアッセイの結果を記録。アッセイの感度および効率に関係する品質管理（QC）プログラムのために管理図を準備するために、結果を使用してください。 </li></ol></li><li>の確認結果は<ol><li>肯定的な結果は、さらに1,5,6,7,9,12を検出した菌株の塩基配列に関する追加データを生成する、アンプリコンのネスト- PCRと塩基配列を用いて確認することができます。 </li></ol></li></ol>説明した手順に従って、人間と動物のウイルスは、入浴の海、海水や河川水2,3で検出し、定量化されています。代表的な例として、硝酸塩の高いレベルを提示する分野から地下水試料は、汚染の発生源を定義するために評価した。十リットルの水のサンプルは、スペイン北東部の農村部における4つの井戸から採取された。五は、プロセス制御として使用されるヒトアデノウイルス2で播種した各ウェルと1つの複製に収集された複製。サンプルを図1に表されたプロトコルに従って処理した。 4人は（値7.7平均PAdVための肯定的な結果を示した研究4つのサイトのいずれかで分析した複製サンプリングサイトを周辺地域における豚スラリーの存在に関連されると地下水の硝酸塩（表2）のソースとして糞便ブタの汚染をサポートする4 × 2 GC / L）。 4。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1水中ウイルスの検出および定量するための手順。 <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="表1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表1"> qPCRアッセイ用のプライマーとプローブの表は、1。集中。 <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="表3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表3"> 表2。検出と地下水試料中の動物やヒトアデノウイルスとpolyomavirusesの定量化。 のn個の数は、分析複製 正の％の割合では、複製 （ - ）検出された非

<ol><li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li>
<li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li>
<li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li>
<li>de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li>
<li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li>
<li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li>
<li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Z.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li>
</ol>

二つの特許出願は、PAdVとBPyVの定量化のためのプロトコルの知的財産を保護するために2009年に提起された。

<html>再現性、信頼性の高い、簡単で、費用対効果：説明する手順では、ルーチン、環境および公衆衛生研究所のためのフィッティング方法のための条件を満たすでしょう。プロトコルはシンプルですが、それは注意深く従ってください。凝集のための攪拌時間を大幅に（たとえば5時間未満）減少する場合のように人工海水の塩の要求された濃度を加えることなく、試料中の低導電率が飛躍的にウイルスの回収を減らすことができます。 現在適用されているMSTのツールは、一般的に分子生物学的手法に基づいています。異なるグループによって開発された研究では、必要に応じて、現在使用されているパラメータのうち5.0（すなわち細菌の遺伝子が）どれものような特定がないことが示されている。したがって、これらのパラメータの組み合わせの使用は、水域8,11の糞便汚染の起源を効率的に追跡するための最良の近似値として提案されている。 近年jove_content&quot;&gt;、多くの場合、臨床症状がない場合の永続的な感染症を生成する選択したDNAウイルスの研究は、環境でソースの追跡糞便汚染のための方法とし...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>高速遠心（8,000 × g）で</td><td>バークマンコールター</td><td>アヴァンティJ - 20XP </td><td></td></tr><tr><td> pHメーター、温度計とconductimeter </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製のチューブ100〜200センチメートルの長さ</td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌は、使い捨てピペットを卒業</td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 10〜15 mLの滅菌プラスチックチューブ（エッペンドルフ、ファルコンズ、等） </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td>ポットを遠心（500mL中） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td>磁気撹拌器と磁石（ごとにサンプル） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td>マグネットスターラーの使用を許可するように平らな底を有するガラスまたはプラスチック製の容器</td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td>上清を除去するための蠕動ポンプ（またはウォータージェット真空ポンプ） </td><td>ワトソン - マーロウ</td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> 8-10時間後に攪拌をオフにするタイマー</td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸（1Nと0.1N） </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム（1N） </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td>人工海水の海塩</td><td>シグマ</td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク（SM） </td><td>ディフコ</td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液のpHを75 </td><td></td><td></td><td> pH7.5ので1:2 v / vの無菌のNa 2 HPO 4 0.2 MのとのNaH 2 PO 4 0,2 M </td></tr><tr><td>チオ硫酸</td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td>水中の10％溶液を作る</td></tr><tr><td>ウイルスRNA Mini Kitを別途準備</td><td>キアゲン</td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル光学反応プレート（500台） </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td>光学接着剤のカバー（100台） </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan環境PCRマスターミックス2倍</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

環境の微生物汚染は重大な健康上のリスクを表しています。古典的な細菌の糞便指標が重要な限界があることが示されている、ウイルスが汚染源に通知していない多くの不活性化プロセスと標準の糞便の指標に対してより耐性があります。費用対効果の高い水からのウイルスの濃度のための方法と分子アッセイの開発は、糞便汚染の指標として、微生物源の追跡（MST）ツールとしてウイルスの適用を容易にします。アデノウイルスとpolyomavirusesは、ヒトを含む特定の脊椎動物に感染するDNAウイルスであり、永続的に糞及び/または調査したすべての地理的領域における尿中に排泄される。以前の研究では、我々は人間の糞便汚染の指標として定量PCR（qPCR）により、ヒトアデノウイルスの定量化（HAdV）とJCのpolyomaviruses（JCPyV）を提案した。最近、我々は、PORの特定の定量化のためのqPCRアッセイを開発しました。試験管当たり1〜10ゲノムコピーの感度と汚染の動物糞便のマーカーとしてシネアデノウイルス（PAdV）とウシpolyomaviruses（BPyV）。本研究では、我々はこれらのツールを使用して水試料中の汚染源を特定するために従うべき手順を示します。代表的な成果の例として、硝酸塩の高いレベルを提示する地下水のウイルスの分析が示されています。 低または中程度に汚染された水域でのウイルスの検出は、はるかに少ない量に水の少なくとも数リットルからのウイルスの濃度、通常は直列の2つの濃度のステップが含まれている手順が必要です。この少々面倒な手順やウイルスの回収率で観察された変動は大幅に水の多数のサンプルの同時処理を妨げる。 我々は以前のstudieで開発したワンステップのプロトコルを適用した二段階の手続きによって生じるボトルネックを解消するためにsと水マトリックスの多様性に適用される。十リットルの水試料の酸性化、スキムミルクで凝集、凝集物質の重力沈降、沈殿と遠心分離のコレクション、10 mlのリン酸緩衝液中の沈殿物の再懸濁を：手順が含まれています。ウイルス濃縮液は、ウイルス核酸の抽出に使用され、関心のある特定のアデノウイルスとpolyomavirusesは、定量PCRにより定量化されています。サンプル数が多いが、同時にこの低コストの濃縮法を用いて解析することができます。 手順は、入浴の海、海水や河川水の分析に適用し、本研究では、我々は、地下水のサンプルを分析結果を提示されています。このハイスループット定量法は、信頼性の高い簡単な、そして費用対効果の高いです。

研究では、MSTのツールと​​して提案したヒト/ブタ/ウシDNAウイルス、アデノウイルスとpolyomaviruses、特定の定量化のために定量PCRを用いて水中の硝酸塩による尿/糞便汚染または汚染源の同定のための費用対効果の高い方法を説明します。

環境の微生物汚染は、重大な健康リスクとなります。従来の細菌性糞便指標は、顕著な...

ヒトおよび動物特有のウイルスを用いた、費用対効果の高い微生物源追跡法。本研究では、微生物源追跡ツールとして提案されているヒト、ブタ、ウシのDNAウイルス、アデノウイルス、およびポリオマウイルスの特異的定量のための定量PCRを用い、水中の糞便、尿、または硝酸塩による汚染源を特定するための費用対効果の高い方法について記述します。我々は、有機凝集による10 literの水サンプルからのウイルス濃縮、沈殿物からの脱脂粉乳を用いたウイルス核酸の抽出、および定量PCRを用いたヒト、ウシ、またはブタのDNAウイルスの定量化に関するプロトコルを開発しました。ビタミンの微生物汚染が重大な健康リスクとなることはよく知られており、その汚染源を特定する必要があります。我々は、普及率の高いDNAウイルスを微生物源追跡ツールとして利用することを提案しました。選択したウイルスは、アデノウイルスおよびポリオマウイルスです。これらのウイルスは、一年を通じて、またあらゆる地域で持続的に排出されています。これらは先行研究で調査されてきました。我々は、水中のウイルスを濃縮するための堅牢で低コストな手法を開発し、さらに、ピューリンアデノウイルスおよびウシポリオマウイルスの定量のためのqPCRアッセイの開発に取り組んできました。さらに、水中のヒト汚染のマーカーとして、qPCRで検査したヒトアデノウイルスおよびNGCポリオマウイルスも使用します。水サンプルの採取について、本研究では、水サンプルあたり10 literを4回繰り返し採取し、平底のプラスチック容器に回収します。また、プロセス管理用として追加で1サンプルを採取します。この最後のサンプルには、コントロールとして使用する既知量のウイルス粒子を添加します。別の10リットルのプラスチック容器に水道水を用意し、実験室で陰性対照を調製します。サンプルに懸濁物質や砂などの不純物が多く含まれている場合は、15分間静置して沈殿させた後、水を新しい容器に移してください。有機凝集によるウイルスの濃縮を行います。低汚染または中汚染の水試料からウイルスを検出するには、少なくとも数リットルの水からウイルスをはるかに小さい容量に濃縮する必要があります。濃縮手順には、10リットルの水試料の酸性化、脱脂粉乳を用いた凝集、凝集塊の重力沈降、およびリン酸緩衝液10ミリリットルへの沈殿物の回収が含まれます。プロセスの開始にあたり、人工海水中の脱脂粉乳溶液を調製するため、1リットルの人工海水に10グラムの脱脂粉乳粉末を溶解させ、塩酸を用いてpHを3.5に慎重に調整します。これにより、凝集塊が目視で確認できるはずです。溶液は使用直前に調製するか、4 °Cで24時間保存してください。水サンプルを攪拌し、サンプル内の導電率を測定します。導電率が1.5 millisiemens未満である場合は、海塩を添加します。塩酸を添加して、水サンプルのpHを3.5に調整します。調整前後のサンプルのpHと、使用した塩酸の量を記録してください。また、導電率も記録する必要があります。pH調整後、10 Lの水試料に1%の脱脂粉乳100 mLを加え、ウイルスが凝集塊に吸着するように8〜10時間攪拌します。工程管理用として用いるスパイク試料には、例えば1 mLなどの標準量のコントロールウイルスを試料に添加します。攪拌を停止し、凝集塊を8〜10時間自然沈降させます。16時間後（通常は翌日）に、堆積物を回収することができます。回収するには、ペリスタルティックポンプを使用して上澄み液を除去します。凝集物を含む堆積物を約500 milliliters回収し、遠心分離ボトルに入れます。pH 3.5の脱脂スキムミルクを加えてチューブの重量を均等にし、高速遠心機を用いて4°C、8,000 Gsで30分間遠心分離します。遠心分離が停止したらすぐに、チューブを注意深く取り出します。上清を非常にゆっくりと注ぎ出して廃棄してください。各遠心ボトル内のペレットを、最終容量が10 milliliterになるようにリン酸緩衝液で溶解し、ウイルスの核酸抽出および定量を行います。ウイルス濃縮液を用いてウイルス核酸の抽出を行い、目的の特定のアデノウイルスおよびポリオマウイルスをA-Q-P-C-Rにより定量します。key amp viral RNA mini kitを用いて核酸抽出を実施してください。140 µLのウイルス濃縮液に含まれるウイルスの溶解を手動で行い、全核酸を80 µLに抽出します。本キットは、Keycubeなどの自動化プラットフォームでの使用が可能です。次のステップは、Taqmanプローブを用いた定量PCRによるウイルスゲノムコピー数の定量です。ヒトアデノウイルス、JCポリオーマウイルス、およびウシポリオーマウイルスは、同一の96ウェルプレートで定量することが可能です。これらはすべて同じ増幅サイクルを使用するため、標的ウイルスの定量において、ブタアデノウイルスは別の独立したプレートで個別に検査する必要があります。清潔な別のエリアで定量PCRミックスを調製します。ミックスの調製後、コントロールを含む各ウェルに15 µLずつ分注します。別のエリアで、サンプルから抽出した核酸を10 µLずつ添加します。各サンプルについて、原液および精製水による10倍希釈液をデュプリケートで実行します。ターゲット添加後の1反応あたりの全量は、ミックス15 µLとサンプルまたは標準物質10 µLの合計25 µLとなります。サンプルが入ったウェルを粘着カバーの一部で覆います。カバーの残りの部分は次のステップのために保持しておきます。DNA標準懸濁液の希釈を行います。10 copiesから10⁶ genome copiesまでの10 µLを、標準DNA専用のマイクロピペットを用いて、各3連（triplicate）で分注します。あらかじめ粘着カバーを切り抜いた、標準物質を含むウェル。この図は、96ウェルプレートにおける標準懸濁液サンプルおよびコントロールの配置を示している。適切なシステムを用いてQPCRを実施し、Amplitude Goldを10分間活性化した後、適切なパラメータを選択します。反応完了後、95 °Cで40サイクルの増幅を行います。データと結果は、使用した機器のユーザーマニュアルに従って保存してください。DNA量は、必要に応じて希釈倍率で補正した後に得られたデータの中央値として定義します。豚アデノウイルスの定量で得られた増幅プロットおよび標準曲線は、相関係数0.999を示しました。本手順における許容される勾配値の範囲は、-3.1から-3.6までです。汚染源を特定するため、高濃度の硝酸塩が検出された地域の地下水サンプルを用いて、既知のヒトおよび動物ウイルスを検査した。分析した4つの反復試料では、豚アデノウイルスの平均値が1リットルあたり10⁻²ゲノムコピーの7.74倍という陽性結果を示した。これはサンプリング地点周辺における豚スラリーの存在に関連していると考えられ、地下水における豚の糞便汚染の存在を証明するものである。なお、検査したすべてのサンプルにおいて、ヒトによる汚染は認められなかった。ウイルス学的データは、ネステッドPCRおよびシーケンシング解析によって確認された。結論。本研究では、地下水サンプルの分析結果を提示し、ヒトまたはウシ由来の汚染がない状態で、ブタ由来の汚染が存在することを示した。また、本手順は海水浴場、海水、および河川水の分析にも適用された。ここでは、これらのツールを地下水中の汚染源の特定に適用する手順を提示します。環境中における汚染源を検出するための開発手法の適用可能性を示す例として、高濃度の硝酸塩を含む事例を紹介します。

cost-effective-method-for-microbial-source-tracking-using-specific

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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