特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法

ヒトおよび動物特有のウイルスを用いた、費用対効果の高い微生物源追跡法について。本研究では、定量PCRを用いて、微生物源追跡ツールとして提案されているヒト、ブタ、ウシのDNAウイルス、アデノウイルス、およびポリオマウイルスを特異的に定量し、水中の糞便・尿汚染または硝酸塩汚染の源を特定する費用対効果の高い手法について述べる。我々は、脱脂粉乳を用いた有機凝集法により10 literの水試料からウイルスを濃縮し、沈殿物からウイルスの核酸を抽出して、定量PCRによりヒト、ウシ、またはブタのDNAウイルスを定量するプロトコルを開発した。

ビタミンへの微生物汚染が重大な健康リスクとなることはよく知られており、汚染源を特定する必要があります。我々は、非常に普及しているDNAウイルスを微生物源追跡ツールとして利用することを提案しました。選択されたウイルスは、アデノウイルスおよびポリオマウイルスです。

これらのウイルスは、年間を通じてあらゆる地域で持続的に排出されています。先行研究において検討されており、我々は水中のウイルスに対する堅牢で低コストな濃縮法を開発し、さらに豚アデノウイルスおよびウシポリオーマウイルスの定量のためのqPCRアッセイの開発に取り組んできました。

さらに、水中のヒト由来汚染の指標として、qPCRで検出したヒトアデノウイルスおよびNGCポリオマウイルスも使用します。水サンプルの採取について、本研究では、1つの水サンプルにつき10 Lのサンプルを平底のプラスチック容器で4回繰り返し採取し、さらにプロセスコントロールとして追加で1サンプルを採取します。この最後のサンプルには、コントロールとして使用する既知量のウイルス粒子を添加します。

別の10リットルのプラスチック容器に水道水を用意し、実験室で陰性対照を作成します。サンプルに多量の浮遊物質、砂、その他の物質が含まれている場合は、15分間静置して沈殿させた後、水を新しい容器に移します。有機凝集法によるウイルスの濃縮を行います。

低濃度または中程度の汚染水試料中のウイルスを検出するには、少なくとも数リットルの水からウイルスをはるかに小さな容量に濃縮する必要があります。濃縮手順には、10リットルの水試料の酸性化、脱脂粉乳を用いた凝集、フロックの重力沈降、および10ミリリットルのリン酸緩衝液への沈殿物の回収が含まれます。プロセスの開始にあたり、人工海水中の脱脂粉乳溶液を調製します。具体的には、1リットルの人工海水に10グラムの脱脂粉乳粉末を溶解させ、塩酸を用いてpHを3.5に注意深く調整します。これにより、フロックが視認できる状態になります。

溶液は使用直前に調製するか、4 °Cで24時間保存してください。水サンプルを撹拌し、サンプル内の導電率を測定します。導電率が1.5 millisiemens未満である場合は、海塩を添加します。

塩酸を添加して、水サンプルのpHを3.5に調整します。調整前後のサンプルのpHと、使用した塩酸の量を記録してください。また、導電率についても記録する必要があります。

pHを調整した後、10 Lの水サンプルに1%の脱脂粉乳液100 mLを加え、ウイルスが凝集塊に吸着するように8〜10時間撹拌します。プロセスコントロールとして使用するスパイクサンプルには、コントロールウイルスを標準量（例：1 mL）添加します。撹拌を停止し、凝集塊を8〜10時間自然沈降させます。

16時間後（通常は翌日）、沈殿物を回収できるようになります。回収するには、ペリスタポンプを用いて上澄み液を除去します。凝集した沈殿物を、約500 milliliters分、遠心分離ボトルに回収します。

pH 3.5の脱脂粉乳を加えてチューブの容量を等しくし、高速遠心機を用いて4°C、8,000 Gsで30分間遠心分離します。遠心分離が停止したらすぐに、チューブを注意深く取り出します。上清を非常に穏やかにデカントして廃棄してください。

各遠心ボトル内のペレットを、最終容量が10 milliliterになるまでリン酸緩衝液で溶解し、ウイルスの核酸抽出および定量を行います。ウイルス濃縮液を用いてウイルス核酸の抽出を行い、標的となる特定のアデノウイルスおよびポリオマウイルスをA-Q-P-C-Rで定量します。KeyAmp Viral RNA Mini Kitを用いて核酸抽出を実施してください。

140 µLのウイルス濃縮液に含まれるウイルスの溶解を手動で行い、全核酸を80 µLに抽出します。本キットは、Keycubeなどの自動化プラットフォームでの使用が可能です。

次のステップは、TaqManプローブを用いた定量PCRによるウイルスゲノムコピー数の定量です。ヒトアデノウイルス、JCポリオーマウイルス、およびウシポリオーマウイルスは、同一の96ウェルプレートで定量することが可能です。これらはすべて同じ増幅サイクルを使用するため、標的ウイルスの定量において、ブタアデノウイルスは別の独立したプレートで個別に検査する必要があります。

清潔な別のエリアで定量PCRミックスを調製します。ミックスが調製できたら、コントロールを含む各ウェルに15 µLずつ分注します。別のエリアで、各サンプルから抽出した核酸を10 µLずつ添加します。各サンプルについて、原液および精製水による10倍希釈液をデュプリケートで実行します。ターゲット添加後の1反応あたりの合計容量は、ミックス15 µLとサンプルまたは標準物質10 µLを合わせて25 µLとなります。サンプルが入ったウェルを粘着カバーの一部で覆います。

カバーの残りの部分は、次のステップのために保持しておきます。DNA標準懸濁液の希釈を行います。10 copiesから10⁶ genome copiesまで、10 µLずつ3連（triplicate）で分注し、標準DNA専用のマイクロピペットを使用してください。

あらかじめ粘着カバーを切り抜いた、標準試料を含むウェル。この図は、96ウェルプレートにおける標準懸濁液サンプルおよびコントロールの配置を示している。

適切なシステムを用いてQPCRを実施し、Amplitude Goldを10分間活性化した後、適切なパラメータを選択します。反応完了後、95 °Cで40サイクルの増幅を行います。データおよび結果は、使用した装置のユーザーマニュアルに従って保存してください。

DNA量は、必要に応じて希釈倍率で補正した後のデータの中央値として定義します。豚アデノウイルスの定量で得られた増幅プロットおよび標準曲線は、相関係数0.999を示しました。本手順における許容される傾きの値は、-3.1から-3.6の範囲です。

汚染源を特定するため、高濃度の硝酸塩が検出された地域の地下水サンプルを用いて、既知のヒトおよび動物ウイルスを検査した。分析した4つの反復試行では、ブタアデノウイルスの平均値が1リットルあたり10⁻²ゲノムコピーで陽性となり、これはサンプリング地点周辺におけるブタスラリーの存在に関連していると考えられ、地下水にブタの糞便汚染が存在することが証明された。検査したいずれのサンプルからも、ヒトによる汚染は検出されなかった。

ウイルス学的データは、ネステッドPCRおよびシーケンシング解析によって確認されました。結論。本研究では、地下水サンプルの分析結果を提示し、ヒトまたはウシ由来の汚染がない状態で、豚由来の汚染が存在することを示しました。本手法は、海水浴場水、海水、および河川水の分析にも適用されました。

ここでは、これらのツールを地下水の汚染源特定に適用する手順を説明します。環境中の汚染源を検出するための開発手法の適用例として、高濃度の硝酸塩を示す事例を提示します。