ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

この手順では、既知および未知の両方のウイルスについて臨床検体を分析するための汎ウイルスマイクロアレイアッセイであるViro chipを使用します。まず、臨床検体から核酸を抽出します。次に、抽出したRNAをランダムプライマーを用いて逆転写します。

第2鎖CD NAの合成を行い、ランダムPCRを用いてCD NAライブラリを増幅させます。次に、増幅したcd NAを蛍光色素で標識し、ウイルスチップマイクロアレイにハイブリダイズさせます。最終ステップとして、マイクロアレイのスキャンおよび解析を行います。

最終的に、チップマイクロアレイの解析を通じて、ウイルスまたは複数のウイルスの有無を示す結果を得ることができます。肺炎などの一般的な臨床症候群は特定の病原体に特異的ではなく、またSARSコロナウイルスや2009年の新型H1N1インフルエンザウイルスのような新規ウイルス病原体の脅威が絶えず出現しているため、診断微生物学においてウイルスチップマイクロアレイのような広範な検出方法が必要とされています。この手法は、臨床現場における未診断の感染症のうち、どの程度の割合が未だ特定されていない新規ウイルスによって引き起こされているかという、診断微生物学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。数百から数千の潜在的な病原体を同時に検査できるため、この技術の意義は、病院における急性臨床疾患のより優れた診断へと展開されます。

この手法のアイデアを最初に得たのは2002年のことで、UCSFのJoseph DeRisi博士の研究室で先駆的に開発されたマイクロアレイという新技術を、ウイルスの検出に応用することに決定したときでした。初の現実的なテストケースは、2003年にSARSの原因となった新型コロナウイルスの特定にウイルスチップを使用したことでした。本手順の全工程を実演するため、私の研究室の技術者が、小児の鼻腔拭い液サンプルを用いてウイルスチップアッセイを行い、急性の呼吸器疾患の原因を診断する様子を実演します。鼻咽頭拭い液サンプルは、ウイルス輸送用液体培地を含む滅菌容器に採取され、-80 °Cのフリーザーで冷凍保存されます。

バイオセーフティキャビネット内で、サンプルが入ったチューブを解凍し、綿棒を培地中で軽く撹拌した後、綿棒をバイオハザード廃棄物容器に廃棄します。次に、サンプルの200 µLを1.5 mLチューブに分注します。ウイルス粒子を精製するため、サンプルを0.22 µmのスピンフィルターに通し、新しい1.5 mLチューブに回収します。

次に、メーカーの指示に従い、Ambien社のTurbo DNAキットを用いてホストゲノムDNAを分解し、カプセル化されて保護されたウイルス核酸を精製します。続いて、XMO ZRウイルスRNA抽出キットまたはQiagen社の超音波ウイルスキットを用い、メーカーの指示に従ってRNA抽出を行います。抽出したRNAの濃度をNanoDrop核酸分光光度計で測定します。

RNA濃度は10 ng/µL以上であることが望ましいですが、薄壁200 µLチューブを使用する場合、サンプルによって異なります。抽出したRNA 4 µLに、濃度40 pmol/µLのプライマーAを1 µL加えます。サーモサイクラーを用いてサンプルを65 °Cで5分間加熱し、その後、チューブを室温で5分間冷却させます。

次に、2 µLの5× RTバッファー、1 µLの12.5 mM dNTP、1 µLの水、0.5 µLの0.1 M DTT、および0.5 µLの逆転写酵素を含むマスターミックスを5 µL、サーモサイクラー内で添加します。チューブを42 °Cで60分間インキュベートします。その後、サンプルを94 °Cで2分間加熱します。

逆転写反応を停止させるために、10 °Cで2分間保持し、5秒間パルス遠心分離を行います。次に、5× QuEase バッファー 1 µL、水 3.8 µL、および QuEase 第2鎖合成用酵素 0.15 µL からなる QuEase ミックス 5 µL を添加します。サーモサイクラーを用いて、8分かけて10 °Cから37 °Cまで昇温させます。

37 °Cで8分間保持します。次に、94 °Cで2分間加熱して逆転写酵素を不活化し、その後10 °Cまで冷却します。必要に応じて、15 µLのcDNAを含むサンプルを-20 °Cで保存してください。

まず、CD NAサンプル5 µLを、10倍PCRバッファー5 µL、12.5 mM dNTP 1 µL、100 pmol/µL プライマーB 1 µL、CleanTaq LA 1 µL、および水37 µLからなるマスターミックス45 µLに加えます。次に、PCRプロトコルを次のように実行します。94 °Cで2分間加熱した後、94 °Cで30秒間、50 °Cで45秒間、72 °Cで1分間のサイクルを25回繰り返します。

次に、72 °Cで5分間の伸長反応を行い、PCR終了後に10 °Cで保持します。PCR産物を1.5%アガロース電気泳動ゲルで確認してください。約200から1000 bpのスマイヤーが視認されるはずです。

AAD DNTPを組み込むために、5 µLのウイルスPCR産物を、5 µLの10倍PCR緩衝液、1 µLの12.5 mM AAD NTP、1 µLの100 pM プライマーB、1 µLのClinTech LA、および37 µLの水からなる45 µLのマスターミックスに加えます。PCRプロトコルを次のように実行します：94 °Cで2分間、その後、94 °Cで30秒間および50 °Cで45秒間のサイクルを15回繰り返します。

72 °Cで1分間、続いて72 °Cで5分間の伸長ステップを行い、10 °Cで保持します。その後、製造元の指示に従ってDNA Clean and Concentrator 3キットを用いて新しいPCR産物を精製し、10 µLの溶出バッファーで再懸濁します。10 µLのPCR産物に、1 Mの重炭酸塩1 µLとsi3 1 µLを加え、暗所で1時間インキュベートします。

次に、DNA Clean & Concentratorキットを用いてSラベル標本の洗浄を再度行い、12 µLの溶出バッファーで溶出します。NanoDrop分光光度計を用いてcDNA濃度と導入された色素量を調べるため、標本を1.5 µL使用します。PCRストリップチューブに、1 µLの25×断片化バッファー、5 µLの5×ブロッキングバッファー、およびS-I-3ラベル標本の最終濃度を10 pM/µLに標準化するために必要な量（または9.5 µL）と、全量を25 µLにするための水を加えます。その後、2×GXハイブリダイゼーションバッファーを25 µL加え、短時間遠心して気泡を除去します。

新しいガスケットスライドをハイブリダイゼーションチャンバーにセットします。ガスケットスライドに40 µLのサンプルをロードします。次に、Agilentの印がある面を下にして、Agilentプリントウイルスアレイをガスケットスライドの上に配置し、ネジをしっかりと締めて固定します。

ハイブリダイゼーションチャンバーを65 °Cのオーブンに入れ、10 rpmの低速回転させながら一晩ハイブリダイゼーションを行い、アレイを洗浄します。まず、加熱しながらバッファー2を37 °Cに予熱します。500 mLのプラスチック容器に、約250 mLのバッファー1を満たします。

ハイブリダイゼーションチャンバーからアレイを取り出し、アレイを浸してガスケットスライドから分離させます。アレイを清潔な容器に移し、バッファー1で1分間洗浄します。その後、別の500 milliliterプラスチック容器を使用して洗浄を行います。

あらかじめ加熱しておいたバッファー2で、アレイを1分間洗浄します。洗浄後、気泡が入らないように注意しながら、アレイをバッファー2からゆっくりと取り出します。

キムワイプを使用して余分な水分を吸い取ります。この際、アレイの活性面に直接触れないよう注意してください。最後に、スライドをAgilent側を上にしてスライドホルダーにセットし、アレイスキャナーに挿入します。本手順では、Agilent社製2ミクロンDNAマイクロアレースキャナーを使用しています。

装置の標準スキャンプロトコルに従い、ラベル化されたSI 3アレイを5 µmまたは2 µmでスキャンします。ウイルスチップマイクロアレイを、クラスター分析または自動ROチップ分析プログラムであるunpredicを用いて解析します。Viro Chippマイクロアレイを使用することで、インフルエンザ様疾患を持つ小児から採取した鼻腔ぬぐい液検体中から、2009年の新型インフルエンザH1N1ウイルスを容易に検出できます。

さらに、このウイルスチップは呼吸器ウイルスだけでなく、さまざまな組織や体液由来の広範なウイルスを特定できることを示しました。以下に、vichiを用いて全血および血清中でウイルスを検出した例を示します。これらは、全血または血清の血液サンプルから得られたviro chipマイクロアレイに対応する結果です。各サンプルについて4人の患者から採取されており、P値が最も低い上位2つのウイルス予測結果が表示されています。

例えば、水色で強調表示されたサンプルでは、そのサンプルの最上位の予測はデングウイルス1型です。2番目の予測はデングウイルス2型ですが、この全血サンプルに含まれていた実際のウイルスは、dictの結果と一致して、確かにデングウイルス1型であることが確認されました。Viro chipのもう一つの応用例は、新規病原体の探索です。

例としては、sars coronavirus X-M-R-V-Aの発見や、ヒトの前立腺癌および慢性疲労症候群に関連するOME retrovirus、そして小児の呼吸器感染症および下痢症に関連する新型ヒト心筋ウイルスであるHTCVの発見などが挙げられます。この手法に習熟すれば、適切に実施することで12時間以内に完了させることができます。本手順を試みる際は、本プロトコルに従い、必要なすべての機器および試薬が揃っていることを確認することが重要です。

特異的なウイルスPCR増幅やディープシーケンシングなどの他の手法を用いることで、異常なウイルスチップのハイブリダイゼーションパターンや、開発後に新種ウイルスの存在が示唆されたウイルスチップの結果を確認し、追跡調査することが可能です。この技術は、腫瘍学分野の研究者が新種ウイルスと癌との関連を探索すること、バイオディフェンスおよび臨床微生物学分野において迅速な病原体診断のための凝縮マイクロベースアッセイを開発すること、そしてウイルス学分野における新種ウイルスの特性評価およびそれらと疾患との関連を解明するための道を開きました。このビデオを視聴することで、臨床検体からの核酸抽出からマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび解析に至るまで、臨床検体中のウイルス病原体を検出するための広範囲サーベイランス試験であるウイルスチップマイクロアレイアッセイのすべての手順を適切に実施する方法を深く理解できるはずです。

臨床検体の取り扱いはバイオハザードとみなされるため、核酸抽出はバイオセーフティレベル2以上の認定を受けた研究室で実施する必要があることに注意してください。