Name: ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 学ぶVirochipパンバイラルマイクロアレイアッセイを用いて臨床サンプルから既知および未知のウイルスを検出する方法。核酸抽出からハイブリダイゼーションまでの診断微生物学技術を習得できます。

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我々はVirochipプロトコルの初期の開発と最適化のためにデイヴィッド王、アナUrisman、エイミーキスラー、ケールフィッシャー、パトリック唐、そしてアレキサンダーGreningerに感謝。この作品は、NIH K08助成金とアボットディスカバリー賞（CCまで）とハワードヒューズ医学研究所（JLDまで）によってサポートされています。

Virochipアッセイの手順は、臨床サンプルから（1）核酸の抽出、抽出したRNAの（2）逆転写および第2鎖cDNA合成、ランダムプライミングcDNAの（3）PCR増幅、（3）Cy3の蛍光色素の取り込みを含む、（4）Virochipマイクロアレイの標識物質のハイブリダイゼーション、及び（5）スキャンおよび分析（図1）。以下に示すプロトコルは、インフルエンザ様疾患を持つ子どもから鼻腔スワブサンプルのVirochipアッセイの使いかたを説明します。 プライマー配列プライマー5' - GTTTCCCAGTCACGATA -（N 9）-3' プライマーB 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - 3' 1。核酸抽出<ol><li>これらのサンプルは潜在的に感染であるため、臨床検体からの核酸の抽出は、バイオセーフティレベル2（BSL - 2）以上の条件の下で実行する必要があります。 </li><li>鼻腔スワブサンプルは、ウイルス保持媒体で転送されます。 1.5mlのエッペンドルフマイクロ遠心チューブに試料のアリコート200μLの。 </li><li> オプション：0.22μmフィルター（ウイルス粒子のために精製するために）を通過サンプル</li><li> オプション：製造業者の指示に従って、ターボDNアーゼキット（Ambion社）を用いてDNaseで前処理サンプル（ホストのゲノムDNAを分解すると、保護された、capsidに包まれたウイルス核酸のために精製するために） </li><li> Zymo ZRウイルスRNA抽出キットまたは、製造元の指示に従ってキアゲンUltrasensウイルスキットを使用してサンプルを抽出する。 </li></ol> 2。逆転写および第2鎖cDNA合成（"ラウンドA"） <ol><li> RNAを抽出した4ユニットに1 uLの40μL/ pmolのプライマーを追加。 65〜熱が° Cクラー（例：ジーンアンプPCRシステム9700）とその後の5分間室温温度× 5分で冷ます。 </li><li> 2μL5X RTバッファー、1μL12.5mmのdNTPを、1μL水、0.5μL0.1M DTT、および0.5μLSSIII RT（Invitrogen社）で構成されたマスターミックスの5μLを追加。 42℃でインキュベート℃× 60分。 </li><li>プログラム可能なサーマルサイクラーで、94〜熱10℃まで冷却C × 2分（中止に逆転写酵素反応）、° C、パルス遠心分離し、1μL5Xシークエナーゼのバッファで構成される5μLシークエナーゼミックスを追加し、3.8μL水、および0.15μLシーケナーゼ（USB社）。第2鎖合成の場合は、° C〜37 ° Cから8分、8分を保持し、94への熱は、° C × 2分（シークエナーゼを不活性化する）と10 ° C（保持）へのクールな上の10から立ち上がる。 </li><li> 省略可能 ：RD cDNAサンプルは-20℃で、この時点で保存することができます。 </li></ol> 3。ランダムプライミングcDNAのPCR増幅（"ラウンドB"） <ol><li> 5μL10X PCRバッファー、1μL12.5mmのdNTPを 、1μLは100pmol /μLプライマーB、1μLKlenTaq LA（Sigma社）、および37μLの水から成るマスターミックス45μLにRdの5μlのサンプルを追加。 </li><li>次のようにPCRプロトコール実行：94 ° C、2分→（94の25サイクル° C、30秒/ 50℃、45秒/ 72℃、1分）→72℃、5分→10℃（ホールド） </li><li> 1.5％アガロース電気泳動ゲル上のRD Bのサンプルを確認してください。約200から塗抹標本 - 1000 BPは可視でなければなりません（図2A） </li></ol> 4。 Cy3の蛍光色素の取り込み<ol><li> オプション ：別のサンプルは、Cy5の蛍光色素で標識し、同じマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。 </li><li> AA - dNTPを組み込むには、5μlの10 × PCRバッファー、1μlの12.5mmのAA - dNTPを （Invitrogen社製）、1μlのは100pmol / ULプライマーB、1から成るマスターミックスの45 ULに路Bのサンプルを5 ULを追加する1μlのKlenTaq LA（Si​​gma社）、および37 uLの水。 PCRプロトコールを以下のように実行する：94 ° C、2分→（94の15サイクル° C、30秒/ 50℃、45秒/ 72℃、1分）→72℃、5分→10℃（ホールド） </li><li>メーカーの指示ごとにクリーンとコンセントレータ- 5キット（Zymo研究）DNAと路Cのサンプルを清掃してください。 10μLで溶出します。 </li><li>路Cのサンプルに1M炭酸水素1 UL（Sigma社）および1μlのCy5と（GE Healthcare）を追加します。 </li><li>暗所でインキュベート× 1時間。 </li><li>メーカーの指示に従ってDNAクリーンとコンセントレータ- 5キット（Zymo研究）とCy3標識サンプルを清掃してください。 12μLで溶出します。 </li></ol> 5。 Virochipマイクロアレイへのハイブリダイゼーション<ol><li> オプション：（サンプルの正規化のための）光度計分光光度計に組み込まれたcDNA濃度と色素の量をチェックするために1.5μLを使用してください</li><li> PCRストリップチューブに25μLの全体積（アジレント）に1μL25Xフラグメンテーションバッファ、5μL5Xブロッキング緩衝液、Cy3標識サンプルの9.5μL（または正規化する量）、及び水を加える</li><li> 2X GEXのハイブリダイゼーションバッファー（アジレント）の25μLを追加。気泡を除去するために一時的にスピンダウン。 </li><li>ガスケットスライド上にサンプル40μLをロードする。 </li><li>場所アジレント印刷さVirochipの配列（Californi大学、サンフランシスコ/アジレント）（ダウン"アジレント"マーク側）ガスケットのスライドの上とは、しっかりとネジを締めます。 </li><li> 65で一晩ハイブリダイズ℃のオーブン、10 rpmで速度設定。 </li><li> 37℃に配列、予熱バッファ2（アジレント）を洗浄するバッファ1（アジレント）のガスケットのスライド/配列サンドイッチ水中を離れてください。バッファ1 × 1分を洗ってください。予熱されたバッファ2 × 1分で洗浄する。徐々に（直接配列のアクティブな側面に触れないように注意しながら余分な水分を逃がすためにキムワイプを使用）気泡に注意しながら、バッファ2からスライドを削除する</li><li>スライドホルダーにス​​ライドを配置し、アレイスキャナーに挿入。 </li></ol> 6。 Virochipスキャンと分析<ol><li>スキャンCy3標識測定器の標準のスキャンプロトコル（図2B）によるとは5μmまたは2μm以下で配列。 </li><li> E -予測11、目視検査、クラスター分析、または自動化されたVirochip解析プログラムによってVirochipマイクロアレイを解析する。これらの3つの方法のそれぞれによって、インフルエンザウイルスは、容易に鼻腔スワブサンプル（インフルエンザ様疾患を持つ子から）（図2C）で検出される</li></ol> 7。代表的な結果： プロトコルが正しく行われている場合、スミアは、RD Bのステップ（図2A）の後にアガロースゲル電気泳動で見られるべきである。 Agilentのプラットフォーム上でVirochipマイクロアレイは、（図2B）視覚的に分析することは困難になりますが、ウイルスが存在しているなら、それは容易に目視検査、クラスター分析、および/またはE - Predictは（図1C）で識別する必要があります。アッセイの陽性コントロールとして、サンプルは、既知のウイルス（MS2バクテリオファージなどのタバコモザイクウイルス）からの核酸の測定された量で添加することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 Virochipマイクロアレイの処理と分析の概略図。臨床サンプルから核酸を抽出は無作為に、増幅蛍光色素で標識し、Virochipマイクロアレイにハイブリダイズさせる。マイクロアレイは、2μmの解像度でスキャンし、E -予測を含め、計算ツールのさまざまな方法を使って分析されます。 <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 Virochipアッセイの手順は、ランダムPCR、200の塗抹標本による増幅後- 。1000bpのゲル電気泳動によって可視化することができます（）（B）8アレイ/スライドガラスの三Virochipマイクロアレイアウトは、小さな地域で、示されている。右下の隅に挿入で吹き、最大1マイクロアレイの。臨床検体中のインフルエンザウイルスの存在を明らかにE -予測。使用して（C）自動化されたマイクロアレイウイルス分析高い類似度スコア（S = 0.55）ため、この非常に重要な予測を作る、ゼロに近いp値に対応しています。

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
<li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li>
<li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease%3A+identification+of+a+candidate+etiologic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで説明するようにVirochipプロトコルは複雑であり、細心と熟練した研究の技術者が必要です。 PCR、ラベリング、ハイブリダイゼーションのための適切な試薬の濃度と条件が非常に​​重要です。 Virochipプロトコルは、簡単にそのような核酸の抽出のためのトリゾール（Invitrogen社）などの組織抽出法を用いて患部組織の分析に対応するように変更することができます。プローブは、適用範囲の所望のスペクトルと幅広さを得るために、必要に応じて追加または削除することができます。例えば、細菌および真菌などの非ウイルス標的の検出のためのプローブは、&quot;オンザフライ&quot;に設計して追加することができます。現在開発中のVirochipアッセイのいくつかのアプリケーションでは、臨床検査、アウトブレイク調査、薬やワクチンの純度のスクリーニング、および新たなウイルスの病原体の発見の広いスペクトルのウイルス診断が含まれています。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/材料の名称</th><th>試薬/材料の名称</th></tr><tr><td>プリメーラ</td><td> 5&#39; - GTTTCCCAGTCACGATA -（N9）-3&#39; </td></tr><tr><td>プライマーB </td><td> 5&#39; - GTTTCCCAGTCACGATA - 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RTマスターミックス（5μL） </td><td> 2μL5X RTバッファー</td></tr><tr><td> 1μL12.5mmのdNTPを（Invitrogen社） </td></tr><tr><td> 1μLの水</td></tr><tr><td> 0.5μL0.1M DTT </td></tr><tr><td> 0.5μLSSIII RT（Invitrogen社） </td></tr><tr><td rowspan="3">シークエナーゼミックス（5μL） </td><td> 1μL5Xシークエナーゼバッファ</td></tr><tr><td> 3.8μLの水</td></tr><tr><td> 0.15μLシークエナーゼ（USB株式会社） </td></tr><tr><td rowspan="5"> RD B PCRマスターミックス（45μL） </td><td> 5μL10X PCRバッファー</td></tr><tr><td> 1μL12.5mmのdNTPを（Invitrogen社） </td></tr><tr><td> 1μLを100μL/ pmolのプライマーB </td></tr><tr><td> 1μLKlenTaq LA（シグマ） </td></tr><tr><td> 37μL水</td></tr><tr><td rowspan="5"> RD C PCRマスターミックス（45μL） </td><td> 5μlの10 × PCRバッファー</td></tr><tr><td> 1μL12.5mmのdNTPを（Invitrogen社） </td></tr><tr><td> 1μLを100μL/ pmolのプライマーB </td></tr><tr><td> 1μLKlenTaq LA（シグマ） </td></tr><tr><td> 37μL水</td></tr><tr><td rowspan="4">ハイブリダイゼーション緩衝液（25μL） </td><td> 1μL25Xフラグメンテーションバッファ（アジレント） </td></tr><tr><td> 5μL5Xブロッキング緩衝液（アジレント） </td></tr><tr><td> Cy3標識サンプルの9.5μL（または正常化する量） </td></tr><tr><td> 25μLの全体積に水を追加します。 </td></tr><tr><td>アジレントVirochipマイクロアレイ</td><td>ライセンス申請中の、チウ研究所、UCSFから入手可能</td></tr></tbody></table>

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（virochip）を使用して、

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

多くの感染症のウイルスの原因の診断は、ウイルスの本来の配列の多様性だけでなく、従来の方法で検出できないSARSコロナウイルスと2009年のパンデミックH1N1インフルエンザウイルス、などの新しいウイルス性病原体、の継続的な進展に伴い、困難です。これらの課題に対処するために、我々が以前に開発され、汎ウイルスのマイクロアレイプラットフォームを検証して保存された配列の相同性1のベースですべての既知のウイルスだけでなく、小説のバリエーションを検出する能力とVirochipと呼ばれる。 Virochipを使用して、我々は、同等または従来の臨床試験2-5に優れた感度を持つ入院患者、原因不明の重症疾患の場合を含む呼吸器感染症、関連付けられているウイルスの完全なスペクトルを同定した。 Virochipは、SARSコロナウイルス6,7、小説ライノウイルスのクレード5、XMRV（前立腺癌にリンクされているレトロウイルス）8、鳥bornavirus（オウムの消耗性疾患の原因）9、を含む、新規のウイルスを識別するために使用されています呼吸器と下痢10の子供のと小説cardiovirus。 Virochipの現在のバージョンは、アジレントのマイクロアレイプラットフォームに移植され、2009年12月のようにGenBankの以上〜1,500ウイルス由来〜36000のプローブで構成されている。ここでは、サンプル核酸の抽出、ランダムプライマーを用いたPCR増幅、蛍光色素の取り込み、及びマイクロアレイのハイブリダイゼーション、スキャニング、及び分析を含む、（〜24時間のターンアラウンドタイム）を最初から最後までVirochipアッセイの処理に必要なステップを示しています。

Virochipは同時に保存された配列の相同性に基づいてすべての既知のウイルスだけでなく、新たなウイルスを検出するように設計されたパンウ​​イルスマイクロアレイです。ここでは、既知および未知のウイルスの存在のために臨床サンプルを解析するVirochipアッセイを実行する方法を示しています。

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

多くの感染症におけるウイルス起因の診断は、ウイルスが本質的に持つ配列の多様性に加え、絶え間ない出現...

この手順では、既知および未知の両方のウイルスについて臨床検体を分析するための汎ウイルスマイクロアレイアッセイであるViro chipを使用します。まず、臨床検体から核酸を抽出します。次に、抽出したRNAをランダムプライマーを用いて逆転写します。第2鎖CD NAの合成を行い、ランダムPCRを用いてCD NAライブラリを増幅させます。次に、増幅したcd NAを蛍光色素で標識し、ウイルスチップマイクロアレイにハイブリダイズさせます。最終ステップとして、マイクロアレイのスキャンおよび解析を行います。最終的に、チップマイクロアレイの解析を通じて、ウイルスまたは複数のウイルスの有無を示す結果を得ることができます。肺炎などの一般的な臨床症候群は特定の病原体に特異的ではなく、またSARSコロナウイルスや2009年の新型H1N1インフルエンザウイルスのような新規ウイルス病原体の脅威が絶えず出現しているため、診断微生物学においてウイルスチップマイクロアレイのような広範な検出方法が必要とされています。この手法は、臨床現場における未診断の感染症のうち、どの程度の割合が未だ特定されていない新規ウイルスによって引き起こされているかという、診断微生物学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。数百から数千の潜在的な病原体を同時に検査できるため、この技術の意義は、病院における急性臨床疾患のより優れた診断へと展開されます。この手法のアイデアを最初に得たのは2002年のことで、UCSFのJoseph DeRisi博士の研究室で先駆的に開発されたマイクロアレイという新技術を、ウイルスの検出に応用することに決定したときでした。初の現実的なテストケースは、2003年にSARSの原因となった新型コロナウイルスの特定にウイルスチップを使用したことでした。本手順の全工程を実演するため、私の研究室の技術者が、小児の鼻腔拭い液サンプルを用いてウイルスチップアッセイを行い、急性の呼吸器疾患の原因を診断する様子を実演します。鼻咽頭拭い液サンプルは、ウイルス輸送用液体培地を含む滅菌容器に採取され、-80 °Cのフリーザーで冷凍保存されます。バイオセーフティキャビネット内で、サンプルが入ったチューブを解凍し、綿棒を培地中で軽く撹拌した後、綿棒をバイオハザード廃棄物容器に廃棄します。次に、サンプルの200 µLを1.5 mLチューブに分注します。ウイルス粒子を精製するため、サンプルを0.22 µmのスピンフィルターに通し、新しい1.5 mLチューブに回収します。次に、メーカーの指示に従い、Ambien社のTurbo DNAキットを用いてホストゲノムDNAを分解し、カプセル化されて保護されたウイルス核酸を精製します。続いて、XMO ZRウイルスRNA抽出キットまたはQiagen社の超音波ウイルスキットを用い、メーカーの指示に従ってRNA抽出を行います。抽出したRNAの濃度をNanoDrop核酸分光光度計で測定します。RNA濃度は10 ng/µL以上であることが望ましいですが、薄壁200 µLチューブを使用する場合、サンプルによって異なります。抽出したRNA 4 µLに、濃度40 pmol/µLのプライマーAを1 µL加えます。サーモサイクラーを用いてサンプルを65 °Cで5分間加熱し、その後、チューブを室温で5分間冷却させます。次に、2 µLの5× RTバッファー、1 µLの12.5 mM dNTP、1 µLの水、0.5 µLの0.1 M DTT、および0.5 µLの逆転写酵素を含むマスターミックスを5 µL、サーモサイクラー内で添加します。チューブを42 °Cで60分間インキュベートします。その後、サンプルを94 °Cで2分間加熱します。逆転写反応を停止させるために、10 °Cで2分間保持し、5秒間パルス遠心分離を行います。次に、5× QuEase バッファー 1 µL、水 3.8 µL、および QuEase 第2鎖合成用酵素 0.15 µL からなる QuEase ミックス 5 µL を添加します。サーモサイクラーを用いて、8分かけて10 °Cから37 °Cまで昇温させます。37 °Cで8分間保持します。次に、94 °Cで2分間加熱して逆転写酵素を不活化し、その後10 °Cまで冷却します。必要に応じて、15 µLのcDNAを含むサンプルを-20 °Cで保存してください。まず、CD NAサンプル5 µLを、10倍PCRバッファー5 µL、12.5 mM dNTP 1 µL、100 pmol/µL プライマーB 1 µL、CleanTaq LA 1 µL、および水37 µLからなるマスターミックス45 µLに加えます。次に、PCRプロトコルを次のように実行します。94 °Cで2分間加熱した後、94 °Cで30秒間、50 °Cで45秒間、72 °Cで1分間のサイクルを25回繰り返します。次に、72 °Cで5分間の伸長反応を行い、PCR終了後に10 °Cで保持します。PCR産物を1.5%アガロース電気泳動ゲルで確認してください。約200から1000 bpのスマイヤーが視認されるはずです。AAD DNTPを組み込むために、5 µLのウイルスPCR産物を、5 µLの10倍PCR緩衝液、1 µLの12.5 mM AAD NTP、1 µLの100 pM プライマーB、1 µLのClinTech LA、および37 µLの水からなる45 µLのマスターミックスに加えます。PCRプロトコルを次のように実行します：94 °Cで2分間、その後、94 °Cで30秒間および50 °Cで45秒間のサイクルを15回繰り返します。72 °Cで1分間、続いて72 °Cで5分間の伸長ステップを行い、10 °Cで保持します。その後、製造元の指示に従ってDNA Clean and Concentrator 3キットを用いて新しいPCR産物を精製し、10 µLの溶出バッファーで再懸濁します。10 µLのPCR産物に、1 Mの重炭酸塩1 µLとsi3 1 µLを加え、暗所で1時間インキュベートします。次に、DNA Clean &amp; Concentratorキットを用いてSラベル標本の洗浄を再度行い、12 µLの溶出バッファーで溶出します。NanoDrop分光光度計を用いてcDNA濃度と導入された色素量を調べるため、標本を1.5 µL使用します。PCRストリップチューブに、1 µLの25×断片化バッファー、5 µLの5×ブロッキングバッファー、およびS-I-3ラベル標本の最終濃度を10 pM/µLに標準化するために必要な量（または9.5 µL）と、全量を25 µLにするための水を加えます。その後、2×GXハイブリダイゼーションバッファーを25 µL加え、短時間遠心して気泡を除去します。新しいガスケットスライドをハイブリダイゼーションチャンバーにセットします。ガスケットスライドに40 µLのサンプルをロードします。次に、Agilentの印がある面を下にして、Agilentプリントウイルスアレイをガスケットスライドの上に配置し、ネジをしっかりと締めて固定します。ハイブリダイゼーションチャンバーを65 °Cのオーブンに入れ、10 rpmの低速回転させながら一晩ハイブリダイゼーションを行い、アレイを洗浄します。まず、加熱しながらバッファー2を37 °Cに予熱します。500 mLのプラスチック容器に、約250 mLのバッファー1を満たします。ハイブリダイゼーションチャンバーからアレイを取り出し、アレイを浸してガスケットスライドから分離させます。アレイを清潔な容器に移し、バッファー1で1分間洗浄します。その後、別の500 milliliterプラスチック容器を使用して洗浄を行います。あらかじめ加熱しておいたバッファー2で、アレイを1分間洗浄します。洗浄後、気泡が入らないように注意しながら、アレイをバッファー2からゆっくりと取り出します。キムワイプを使用して余分な水分を吸い取ります。この際、アレイの活性面に直接触れないよう注意してください。最後に、スライドをAgilent側を上にしてスライドホルダーにセットし、アレイスキャナーに挿入します。本手順では、Agilent社製2ミクロンDNAマイクロアレースキャナーを使用しています。装置の標準スキャンプロトコルに従い、ラベル化されたSI 3アレイを5 µmまたは2 µmでスキャンします。ウイルスチップマイクロアレイを、クラスター分析または自動ROチップ分析プログラムであるunpredicを用いて解析します。Viro Chippマイクロアレイを使用することで、インフルエンザ様疾患を持つ小児から採取した鼻腔ぬぐい液検体中から、2009年の新型インフルエンザH1N1ウイルスを容易に検出できます。さらに、このウイルスチップは呼吸器ウイルスだけでなく、さまざまな組織や体液由来の広範なウイルスを特定できることを示しました。以下に、vichiを用いて全血および血清中でウイルスを検出した例を示します。これらは、全血または血清の血液サンプルから得られたviro chipマイクロアレイに対応する結果です。各サンプルについて4人の患者から採取されており、P値が最も低い上位2つのウイルス予測結果が表示されています。例えば、水色で強調表示されたサンプルでは、そのサンプルの最上位の予測はデングウイルス1型です。2番目の予測はデングウイルス2型ですが、この全血サンプルに含まれていた実際のウイルスは、dictの結果と一致して、確かにデングウイルス1型であることが確認されました。Viro chipのもう一つの応用例は、新規病原体の探索です。例としては、sars coronavirus X-M-R-V-Aの発見や、ヒトの前立腺癌および慢性疲労症候群に関連するOME retrovirus、そして小児の呼吸器感染症および下痢症に関連する新型ヒト心筋ウイルスであるHTCVの発見などが挙げられます。この手法に習熟すれば、適切に実施することで12時間以内に完了させることができます。本手順を試みる際は、本プロトコルに従い、必要なすべての機器および試薬が揃っていることを確認することが重要です。特異的なウイルスPCR増幅やディープシーケンシングなどの他の手法を用いることで、異常なウイルスチップのハイブリダイゼーションパターンや、開発後に新種ウイルスの存在が示唆されたウイルスチップの結果を確認し、追跡調査することが可能です。この技術は、腫瘍学分野の研究者が新種ウイルスと癌との関連を探索すること、バイオディフェンスおよび臨床微生物学分野において迅速な病原体診断のための凝縮マイクロベースアッセイを開発すること、そしてウイルス学分野における新種ウイルスの特性評価およびそれらと疾患との関連を解明するための道を開きました。このビデオを視聴することで、臨床検体からの核酸抽出からマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび解析に至るまで、臨床検体中のウイルス病原体を検出するための広範囲サーベイランス試験であるウイルスチップマイクロアレイアッセイのすべての手順を適切に実施する方法を深く理解できるはずです。臨床検体の取り扱いはバイオハザードとみなされるため、核酸抽出はバイオセーフティレベル2以上の認定を受けた研究室で実施する必要があることに注意してください。

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

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学ぶVirochipパンバイラルマイクロアレイアッセイを用いて臨床サンプルから既知および未知のウイルスを検出する方法。核酸抽出からハイブリダイゼーションまでの診断微生物学技術を習得できます。

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