ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

この手順では、汎ウイルスマイクロアレイアッセイであるViroチップを使用して、既知および未知のウイルスの両方の臨床サンプルを分析します。まず、臨床サンプルから核酸を抽出します。次に、抽出されたRNAをランダムプライマーを用いて逆転写します。

第二鎖CDNA合成を行い、ランダムPCRでCDNAライブラリーを増幅します。次に、増幅されたcd NAを蛍光色素で標識し、ウイルスチップマイクロアレイにハイブリダイズします。最後のステップは、マイクロアレイをスキャンして分析することです。

最終的には、チップマイクロアレイの分析を通じて、ウイルスまたはいくつかのウイルスの存在または不在を示す結果を得ることができます。ウイルスchippマイクロアレイのような広域スペクトル検出方法は、肺炎のような一般的な臨床症候群は、個々の病原体に特異的ではなく、SARSコロナウイルスや2009年の新規H one N oneインフルエンザウイルスのような新規ウイルス病原体の継続的な新たな脅威のために、診断微生物学で必要とされています、この方法は、診断微生物学の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます、 例えば、臨床現場での診断されていない感染症のうち、まだ同定されていない新規ウイルスが何パーセント引き起こされているのかなどです。この手法の意味は、数百から数千の潜在的な病原体を同時に検査しているため、病院での急性臨床疾患のより良い診断にまで及びます。

この手法のアイデアが最初に浮かんだのは、2002年にUCSFのJoseph DeRisi博士の研究室で開拓されたマイクロアレイの新技術をウイルスの検出に適用することを決めたときでした。私たちの最初の実世界のテストケースは、2003年にSARSの原因となる新しいコロナウイルスを特定するためにウイルスチップを使用して、最初から最後までの手順を実証します。これは、私の研究室の技術者が、子供の鼻腔スワブサンプルにウイルスチップアッセイを使用して急性呼吸器疾患の原因を診断する方法を実証します。鼻咽頭スワブのサンプルは、ウイルス輸送、液体培地が入った滅菌容器に収集され、マイナス80°Cの冷凍庫で冷凍保存されます。

バイオセーフティフードで、サンプルを含むチューブを解凍し、メディア内で綿棒を短時間攪拌してから、綿棒をバイオハザードウエストビンに廃棄します。次に、サンプルの200マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに分注します。サンプルを0.22ミクロンのスピンフィルターに通してウイルス粒子を精製し、新しい1.5ミリリットルのチューブに入れます。

次に、メーカーの指示に従ってAmbienのTurbo DNAキットを使用して、宿主ゲノムDNAを分解し、保護されたカプセル化されたウイルス核酸を精製します。これに続いて、製造元の指示に従って、XMO ZRウイルスRNA抽出キットまたはQiagen Ultrasoundのウイルスキットを使用してRNAを抽出します。抽出したRNAの濃度をNanoDrop核酸分光光度計で測定します。

RNA濃度は、好ましくは1マイクロリットル当たり少なくとも10ナノグラムであるが、薄肉の200マイクロリットルチューブを使用してサンプルごとに異なる。抽出したRNA4マイクロリットルに、1マイクロリットルあたり40PICAモルの濃度で1マイクロリットルのプライマーAを添加します。サーモサイクラーでサンプルを摂氏65度に5分間加熱し、次にチューブを室温まで5分間冷却します。

次に、RTバッファーを5倍に2マイクロリットル、12.5ミリモルに1マイクロリットル、DNTPに1マイクロリットル、水0.5マイクロリットル、DTT0.1モル、0.5マイクロリットルに上付き3枚、逆転写酵素を3個含有したマスターミックスを5マイクロリットル加え、サーモサイクラーで逆転写酵素を添加する。チューブを摂氏42度で60分間インキュベートします。次に、サンプルを摂氏94度に2分間加熱します。

逆転写酵素反応を中止するには、摂氏10度に2分間呼び出し、5秒間パルス遠心分離機にかけます。次に、1マイクロリットルの5倍のクィーゼバッファー、3.8マイクロリットルの水、および0.15マイクロリットルのクィーゼからなる5マイクロリットルのクィーゼ混合物を第2鎖合成に加える。サーモサイクラーを摂氏10度から摂氏37度まで8分間かけて上げます。

摂氏37度で8分間保持します。次に、摂氏94度に2分間加熱してクイーズを不活性化し、この時点で摂氏10度に呼び出します。必要に応じて、15マイクロリットルのCDNAを含むサンプルを摂氏マイナス20度で保存します。

まず、5マイクロリットルの10回PCRバッファー、1マイクロリットルの12.5ミリモル、DNTP1マイクロリットルの100ポモ/マイクロリットルのプライマー、Bの1マイクロリットルのクリーンテックLAおよび37マイクロリットルの水からなるマスターミックスの45マイクロリットルに、5マイクロリットルのCD NAサンプルを添加する。次に、次のようにPCRプロトコルを実行します。摂氏94度で2分間、続いて摂氏94度で30秒間25サイクル。50°Cで45秒、72°Cで1分間。

次に、摂氏72度の膝をついて5分間歩み、PCR後に摂氏10度でホールドします。PCR産物と1.5%AOSE電気泳動ゲルを確認してください。約200〜1000塩基対の塗抹標本を視覚化する必要があります。

AAD DNTPを組み込むには、5マイクロリットルの10倍PCRバッファー、1マイクロリットルの12.5ミリモル、A-A-D-N-T-Pの1マイクロリットル100pのマルチマイクロリットルプライマー、B1マイクロリットルのClinTech LAおよび37マイクロリットルの水からなるマスターミックスの45マイクロリットルに5マイクロリットルのウイルスPCR産物を添加します。94°Cで2分間、94°Cで30秒間15サイクルのPCRプロトコルを実行します。摂氏50度で45秒間。

摂氏72度で1分間、72度で5分間ひざまずき、摂氏10度で保持します。次に、新しいPCR産物をDNAクリーンおよびコンセントレータ3キットでメーカーの指示に従って洗浄し、10マイクロリットルの溶出緩衝液に添加します。1マイクロリットルの1モル重炭酸塩と1マイクロリットルsi 3を10マイクロリットルのPCR産物に加え、暗所で1時間インキュベートします。

次に、再度、DNAクリーンおよび濃縮器5キットでS標識サンプルを洗浄し、12マイクロリットルの溶出緩衝液で溶出します。1マイクロリットルのサンプルを使用して、1マイクロリットル、25倍のフラグメンテーションバッファー、5マイクロリットル、5倍のブロッキングバッファー、9.5マイクロリットル、またはSI3標識サンプルと水の総体積25マイクロリットルの1マイクロリットルあたり10ピークまたはモルの正規化された最終濃度に必要な量のPCRストリップチューブ内のCDNA濃度と色素の量を確認します。次に、25マイクロリットルの2倍のGXハイブリダイゼーションバッファーを追加し、短時間スピンダウンして気泡を除去します。

新しいガスケットスライドをハイブリダイゼーションチャンバーに入れます。40マイクロリットルのサンプルをガスケットスライドにロードします。次に、Agilentとマークされた面をガスケットスライドの上に下にしてAgilentで印刷されたウイルスアレイを置き、ネジをしっかりと固定します。

ハイブリダイゼーションチャンバーを摂氏65度のオーブンに置き、毎分10回転の低速回転を使用して一晩ハイブリダイズし、アレイを洗浄します。まず、加熱しながらバッファーを摂氏2〜37度に予熱します。500ミリリットルのプラスチック容器に約250ミリリットルの緩衝液を入れます。1。

アレイをハイブリダイゼーションチャンバーから取り外し、アレイを水没させてガスケットスライドから分離します。アレイを清潔な容器に移し、バッファー1個で1分間洗浄します。次に、別の500ミリリットルのプラスチック容器を使用します。

アレイを予熱したバッファーで2分間洗浄します。洗浄後、アレイをバッファーからゆっくりと取り出します。2つ目は、泡を避けるように注意することです。

キムワイプを使用して余分な水分を逃がし、アレイのアクティブ側に直接触れないように注意します。最後に、スライドをスライドホルダーAgilent側を上にして置き、アレイスキャナーに挿入します。この手順では、Agilentの2ミクロンDNAマイクロアレイスキャナーを使用します。

SI 3標識アレイを、装置の標準スキャンプロトコルに従って5ミクロンまたは2ミクロンでスキャンします。クラスター解析または自動ROチップ解析プログラムによるウイルスチップマイクロアレイの解析は、予測に反します。Viro Chipp microarray 2009を使用すると、新型インフルエンザH one Nワンウイルスは、インフルエンザ様疾患の子供から採取した鼻腔スワブサンプルから容易に検出されます。

さらに、ウイルスチップは呼吸器系ウイルスだけでなく、さまざまな組織や体液から幅広いウイルスを識別できることを示しました。ここに示すように、vichiを使用した全血および血清中のウイルス検出の例をいくつか紹介します。これらは、各サンプルの4人の患者から採取した全血または血清のいずれかの血液サンプルからのウイルスチップマイクロレイに対応する前の呼び出しであり、上位2つのウイルス予測が表示され、上位のウイルス予測は最も低いP値を持っています。

たとえば、水色でハイライト表示されているサンプルでは、そのサンプルの上位の予測値はデング熱ウイルス 1 型です。2位の予測はデング熱ウイルス2型ですが、その全血サンプルに含まれる実際のウイルスは、判定結果と一致して、実際にデングウイルス1型であることが確認されました。viroチップの別の用途は、新しい病原体の発見です。

いくつかの例には、SARSコロナウイルスX-M-R-V-A、人間の前立腺癌と慢性疲労症候群に関連するOMEレトロウイルス、およびHTCV、子供の呼吸器および下痢感染に関連する新規ヒト心臓ウイルスの発見が含まれます。この手法は、適切に実行すれば12時間で実行できます。この手順を試行する際は、この手順に従って必要なすべての機器と試薬の可用性を確保することを忘れないでください。

特異的ウイルスPCR増幅およびディープシーケンシングのような他の方法は、異常なウイルスチップハイブリダイゼーションパターンまたは新規ウイルスの存在を示唆するウイルスチップ結果を確認し、追跡するために実施することができる。この技術により、腫瘍学の分野の研究者は、バイオディフェンスや臨床微生物学の分野では迅速な病原体診断のための凝縮マイクロベースのアッセイを開発し、ウイルス学の分野では新規ウイルスの特性評価と疾患との関連について、新規ウイルスとがんとの関連を探求する道が開かれました。このビデオを見れば、核酸抽出から臨床サンプルからマイクロレイハイブリダイゼーションおよび分析に至るまで、臨床サンプル中のウイルス病原体を検出するための広域スペクトル監視テストであるウイルスチップマイクロレイアッセイのすべてのステップを実行する方法を十分に理解できるはずです。

臨床サンプルの取り扱いはバイオハザードと見なされ、核酸抽出はバイオセーフティレベル2以上の評価を受けたラボで実施する必要があることを忘れないでください。