液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

この手順の全体的な目的は、振幅変調（タッピングモードとしても知られる）で動作する市販のAFMを用いて、液体中で可能な限り最高の分解能でイメージングを行うことです。この手法は、高分解能を得るための最適なパラメータの組み合わせを用いることで、液体中における標準的なAFM操作の限界を押し上げるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ほとんどの市販のAFMで使用でき、特別な設備を必要としないことです。

本手法は、AFMに関する基礎知識を有しており、本技術をより高度に活用したいと考えている研究者および技術者を対象としています。本手法は特定の試料に限定されるものではなく、物理学、生物学、化学、材料科学、およびサービス科学などの幅広い分野の試料に適用可能です。一般的に、本技術に不慣れな方は、特定の試料に対して最適なパラメータを見つけ出すまでに忍耐が必要となるため、習得に苦労することがあります。

器具および基板を保持するディスクを、超純水でバスソニケーションします。続いてイソプロパノールで10分間、さらに超純水で10分間、それぞれ洗浄します。高解像度を目指す場合、わずかな汚染であっても致命的な結果を招く可能性があります。

常に手袋を着用し、サンプル、カンチレバー、またはAFMセルに接触するあらゆる表面や器具が十分に洗浄されていることを確認してください。超音波処理後、各器具とサンプルディスクを窒素気流下で乾燥させます。単一の吸着金属イオンをイメージングするために、マイカの支持体としてスチールディスクを使用してください。

超純水、イソプロパノール、そして超純水の順に浸した低リントのシングルプライティッシュで拭き取り、超音波洗浄で汚れが落ちない表面を物理的に洗浄します。その後、表面を最大30分間自然乾燥させます。次に、試薬を十分に混合して少量のエポキシ接着剤を調製し、洗浄済みのスチール試料ディスク上にエポキシを約10 µL滴下します。

マイカ基板をエポキシ樹脂の上に置き、基板に圧力をかけてスチールディスクに固定します。メーカーの仕様に従い、高温で数時間エポキシ樹脂を硬化させます。その後、幅2.5 centimeterの粘着テープを基板にしっかりと押し当てて表面全体を覆い、最上層を滑らかに剥がします。

マイカの表面が目視で鏡面のように滑らかになるまで、この工程を2〜3回繰り返します。カンチレバーチップをイソプロパノール、次に超純水のバスにそれぞれ60分間浸漬させます。その後、安定した水和部位の形成を促進するために、チップに最大5分間UV光を照射します。

過剰な露光時間を長くしすぎると、チップが損傷したり、曲率半径が増大したりする可能性があります。カンチレバーをAFMのカンチレバーホルダーに挿入し、表面を事前に濡らすために、イメージング液 25 µLをカンチレバーとチップにピペットで滴下します。これにより、サンプルに接近させる際に気泡が発生しにくくなります。

サンプルディスクと基板をサンプルステージ上に溶着させ、サンプルにイメージング液を1滴加えます。次に、カンチレバーホルダーをAFMに接続します。カンチレバーとサンプルを近接させ、カンチレバーチップ上の液体とサンプル上の液体の間にキャピラリーブリッジを形成させます。

AFMソフトウェアを使用して、測定レーザーをカンチレバーのチップ先端付近に合わせます。次に、熱スペクトルのメインピークからカンチレバーの共振周波数を求めます。カンチレバーのたわしが校正されている場合、共振ピークを単振動子モデルでフィッティングすることで、カンチレバーのばね定数が得られます。

次に、熱スペクトルで特定した共振周波数に近い周波数範囲で外部駆動させ、振幅応答を確認してカンチレバーを調整します。自由振動の振幅が約5 nmになるように駆動振幅を調整してください。これは、ほとんどのAFMにおいて通常0.2-0.8 Vに相当します。

次に、振幅のセットポイントを自由振幅の約80%に調整します。続いて、フィードバックゲインを比較的高めに設定します。不安定な挙動やリンギングが発生しないことを確認した後、初期走査速度を約1 Hzに、走査サイズを10 nmに設定します。

AFM制御ソフトウェアを使用して、チップを表面に接近させます。イメージングを開始せずに、セットポイント値をわずかに変更して、チップが表面に到達したかどうかを確認します。チップが表面にある場合、ZPAゾーンの伸長への影響は無視できるはずです。

チップが表面に到達したら、ZPAゾーンを戻し、カンチレバーを再調律します。チップとサンプルの相互作用により、共振周波数はおそらく低い値にシフトしています。次に、セットポイントを新たに調律した自由振幅の約80%に変更し、カンチレバーを作動させて、振幅変調モードで表面を10 nm × 10 nmの範囲でスキャンし、イメージングパラメータが適切であることを確認します。

トレースとリトレースのプロファイルが重なっているか確認します。重なっていない場合は、セットポイントをさらに下げ、ゲインを上げてみてください。画像にノイズが入る場合は、ゲインを下げます。

可能であれば、試料の1〜5 µm²という広い領域でこの操作を繰り返します。軟らかい試料や生物学的試料の場合、これによりチップが汚染される可能性があります。スキャンサイズを、関心のある構造を可視化するのに適した値まで小さくしてください。

これは20×20ナノメートルまで小さくすることが可能です。次に、フィードバックループによってZPAゾーンが自動的に後退し、チップが表面から離れるまで、カンチレバーの駆動振幅を下げます。カンチレバーが表面から離れている間に、カンチレバーの振幅がピークツーピークで1～2ナノメートルになるよう、駆動振幅を調整します。

セットポイントを段階的に小さく下げていき、ZPA領域が再び表面に向かって拡大し、元の画像が復元されるまで調整します。セットポイントの振幅は、新しい自由振幅の75%から95%の間に維持してください。その後、振幅が低くなれば、大きなノイズを導入することなくより高いゲインを使用できるため、ゲインを再調整します。

高解像度を得るために、フリー振幅、セットポイント、およびゲインの最適な組み合わせを見つけるようシステムを最適化してください。最適なシステム条件は、試料、液体の濡れ性、および使用するカンチレバーに依存します。親溶媒性界面には、ばね定数が 0.5 から 2 N/m のカンチレバーを使用してください。

この手法を用いて、幅広い種類のサンプルからサブナノメートル分解能の画像が得られました。ここに示すソフトサンプルには、脂質二重層、halobacterium salinarum由来のパープルメンブレン、両親媒性二分子の自己組織化単分子層、およびウシ水晶体膜由来のアクアポリン結晶が含まれます。いずれの例においても、注目すべき特徴が強調されています。

振動振幅を小さくし、設定値を高くすることで、チップが試料に及ぼす力を最小限に抑えることができます。これにより、脂質二重層の脆弱な自己組織化構造、天然バイオメンブレン内のタンパク質、および親水性・親油性分子を、溶液中で損傷させることなくイメージングすることが可能になります。方解石、チタン酸ストロンチウム、炭化ケイ素などの硬い結晶材料や、マイカ表面に吸着した単一金属イオンもこの手法でイメージング可能です。なぜなら、いずれの場合においても、実際にイメージングされているのは結晶自体ではなく界面液体であるためです。この手法を習得すれば、正しく実施する限り、ほぼ毎回、液体中で分子レベルまたは原子レベルの分解能を得ることができます。

この手順を実施する際は、イメージングの対象が界面液体であることに留意することが重要です。そのため、ソフトなイメージング条件を用いる必要があります。チップ、試料、または液体の汚染が、高解像度を達成できない主な原因となることが一般的です。

不確実な点がある場合は、液体が接触するすべての表面を洗浄し、イメージング溶液を再利用することが多くの場合有効です。また、外部ノイズは高解像度を得る上で不利に働きます。換気ダクトから離れた、振動の少ない床の上に設置することが望ましいです。

このビデオを視聴することで、高解像度AFMを実現するためのイメージングパラメータの最適化方法を十分に理解できるはずです。もちろん、あらゆる最先端技術と同様に、サンプルの最適なイメージング方法を決定するには数回の試行が必要な場合があるため、忍耐強く取り組むことが重要です。