Name: 液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ液体中の振幅変調原子間力顕微鏡を用いたサブナノメートル分解能イメージング手法。商業用AFMで高解像度を実現するパラメータ最適化プロトコルを習得し、物理学・生物学・化学・材料科学など幅広いサンプルに適用可能です。

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工学物理科学研究会議からの資金（補助金1452230およびEP / M023915 / 1）、バイオテクノロジー・生物科学研究会議（BB / M024830 / 1を付与）および欧州理事会（FP7 CIG 631186）は深く感謝しています。

ツールと他の表面の1クリーニング注：高解像度を目指した場合、汚染の任意の形式は有害な結果を持つことができます。サンプル、基板やAFMチップを操作するために使用されるすべてのツールを徹底的に洗浄されていることを確認する必要があります。以下は、試料ステージ自体を含むサンプル、カンチレバー、またはAFM細胞と接触し得る任意の表面または器具（ 例えば、ピンセット）に適用されます。 <ol><li>再び10分間超純水に続いてイソプロパノール（純度99.7％）、続いて超純水中の楽器（18.2MΩ、&lt;5ppmの有機物）、、、それぞれのバスは、超音波処理します。可能な場合は、ヒュームの吸入を減らすためにヒュームフードの下でイソプロパノールを使用しています。 </li><li>窒素気流下で乾燥しました。 </li><li>フルイマージョンができない場合（ 例えば、カンチレバーホルダー/エレクトロニクス用）ultrapuに浸し、単層、低リント組織（軽組織ワイパー）で拭いて、物理的に清浄な表面順次、水、イソプロパノール、超純水を再。表面が（通常は15〜30分以内に）空気中で乾燥することができます。 </li></ol> 2.基板の準備注：基板が直接、通常、AFMスキャナおよびサンプルの両方と物理的に接触し、サンプルを支持する固体表面を指します。ほとんどのAFMは、磁気マウントを有し、鋼ディスクを使用することができるが、同一のプロトコルは、例えば、ガラススライドなどの基板に適しています。ここでは、マイカディスクが貼付されている鋼製のディスクを前提としています。この手順の目的は、画像形成に影響を与えることができ、汚染の可能性のある外部ソース限り制限することです。手袋を常に着用する必要があります。 <ol><li>バース・超音波処理続いてイソプロパノール超純水（18.2MΩ）の鉄鋼サンプルディスク、そして最後に超純水により再び、10分間それぞれ。 </li><li>窒素気流下でディスクを乾燥させます。 </li><li>十分に混合した試薬及び場所〜10で、エポキシ接着剤の少量を調製81;スチールディスク上リットル。 </li><li>基板に圧力を印加することによって、鋼ディスクに対して基板（白雲母、SiO 2の結晶、ガラス、 等）を貼り付けます。 （製造元の仕様を参照してください）エポキシは高温で数時間硬化させます。 </li><li>基板のエッジの周り、何のエポキシが直接空気に露出していないことを確認してください。これは、エポキシ樹脂の過剰量が使用される場合に発生し、汚染源となることができます。 <ol><li>マイカ基板の場合は、顔全体を覆うようにしっかりと、基板上に〜幅2.5cmの粘着テープを押して、スムーズに剥がします。穏やかに粘着テープを使用し、表面に平行に引いて、雲母の皮をむきます。除去された材料は、テープ上に表示されます。マイカが目に鏡面になるまで、このプロセスを2-3回繰り返します。 </li><li>ガラス/ SiO 2を、さらに化学的表面改質が必要な場合は、ステップ2.1~2.2の浴超音波処理ルーチンを繰り返します。また、Uを使いますV露光ユニット電力に応じて30〜60分間（18 W UV-C殺菌ランプ））表面上に残されてもよい任意の有機物を熱分解します。この手順は、かなりの粗さを増大させることなく、表面をより親水性にします。 </li></ol></li></ol>カンチレバー先端の調製<ol><li>超純水に続いてイソプロパノール浴中のカンチレバーチップ、60分間ずつ浸し。 </li><li>カンチレバー/先端が（ゲルボックスで長期間貯蔵した後など 、）大規模な清掃が必要な場合は、ステップ1の前にアセトン中で30分間浸漬（&gt; 99.5％の純度）を追加（セクションもアドレッシング汚染を参照してください）。ゲルボックスにヒントのストレージは、我々の経験では、非常に急速に59を発生することができ、汚染の主要な源の一つです。 </li><li>安定した水和サイト60の形成に有利にするためにUV光を簡潔に（&lt;5分）にヒントを公開します。それは、先端またはincに損傷を与えることができるよう、より長い露出オーバー時間を避けますその曲率半径をrease。 </li><li>カンチレバー上に（溶液の性質が調査されたサンプルに依存するが、この場合には、超純水中の塩化ルビジウムの10 mM溶液を使用します）イメージング溶液50μl〜AFMのカンチレバーホルダとピペットにカンチレバーを挿入し、プリウェットそれに先端;試料に接近するとき、これは、気泡の出現を制限します。 </li></ol> AFMセルの4セットアップ<ol><li>試料ステージ上にサンプルディスクと基板をマウントと撮像液の滴（その最高点で液体で、通常、2〜3ミリメートルの厚さ）を追加します。 </li><li> AFMにカンチレバーホルダーを接続します。 </li><li>カンチレバー/先端と試料上の流体間の毛細管ブリッジを形成するように近接さカンチレバーと試料を持参。 </li></ol> 5.初期化測定とカンチレバーのキャリブレーション<ol><li>先端-Eに近い測定レーザー（通常は赤）を合わせますカンチレバーのND。 AFMのモデルに応じて、ソフトウェア制御を介して、またはレーザー位置を手動で調整することによってのいずれかそう。液体中のカンチレバーの熱スペクトルを取得（ 図1A参照）。プロセスは、カンチレバーの主共振（基本固有モード）の周波数を見つけるために、レーザを用いてカンチレバーの熱変動を記録します。最も近代的なAFMでは、これはソフトウェア制御で自動化された手順を介して行われますが、詳細は、AFMからAFMに異なる場合があります。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> 図1：チューニングとカンチレバーを校正します。 ：基本的な固有モード（赤）の単純な高調波発振器（SHO）フィットとカンチレバーの垂直偏向（黒）の熱雑音スペクトル。ここで、共振が水に18.7 kHzです。最初の三つの曲げ固有モードに対応する最初の3つの共振周波数がhighliあります青い矢印でghted。 B：カンチレバーの逆光てこ感度の校正。 （非変形可能な）硬い表面に押し付けカンチレバーの線形偏向はボルトで測定された撓み及びナノメートルの対応する値との間の変換係数（InvOLS）を測定するために使用されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>硬い基板（ 例えば 、マイカ、ガラス）上のカンチレバーとの距離曲線対たわみを記録した （ 図1Bのように）線形偏向領域における曲線の傾きが団結61であることを課すことでたわみを校正- 63。 注：このプロセスは、（ボルトで）光検出器で測定したたわみとの間の変換係数を見つけ、（ナノメートル単位）カンチレバーの本当のたわみ - 自演逆光てこ感度（InvOLS）としてWN。キャリブレーションは、先端部が破損する恐れがありますので、すべての測定が完了した後、それを実施することをお勧めします。キャリブレーションの前に真の振幅の推定値（典型的には&gt; 90％正確な）を取得する前の実験中に同じタイプの別のカンチレバーについて導出InvOLS値を使用します。 </li><li>カンチレバーのバネ定数を得るために、66 -単純な調和振動子モデル64と熱的にスペクトルの共振ピークを合わせます。この手順では、ほとんどのAFMソフトウェアで自動化され、通常は問題になっているモデルの専門知識を必要としません。 </li><li>チューンカンチレバー。外部から駆動時にその公称共振周波数に近い周波数の範囲にわたって（ 例えば、音響や光熱励起による）カンチレバーの振幅応答を探します。わずかに左に、このスペクトルにおいて最大の近くに駆動周波数を設定します。カンチレバーはacouある場合stically駆動、多くの偽の最大値は、チューニングするとき表示されることがあります。 <ol><li>できるだけ近く（とのエンベロープ内）AFMを制御するソフトウェアの種類とバージョンに依存してもよいAFMが、仕様の制御ソフトウェアを使用することにより、熱スペクトルで同定された共鳴共振ピークを選択します。 </li></ol></li></ol> 6.アプローチと試料の初期チェック<ol><li>自由振動の振幅が約5nmとなるように、駆動振幅を設定します。これは通常、ほとんどのAFM上の0.2から0.8 Vに対応（場合にInvOLSが校正されていません）。自由振幅の〜80％に振幅設定値を調整します。 </li><li>比較的高いフィードバックゲインを設定します（絶対値はAFMによって異なります）が、不安定性やリンギングが発生しないことを確認してください。 </li><li> （〜1 Hzから10 nmのそれぞれに、 例えば ）小さな値に初期スキャン速度、スキャンサイズを設定します。これは、いくつかのフィードバックパラメータが不十分に調整されている場合に、チップを保持するのに役立ちます長い距離にわたってスキャンを回避することによって。スキャンサイズはその後スキャン条件が適切で現れる場合に大きな値（ 例えば、100 nm）に増加させることができます。 </li><li>アプローチする前に（これは光学的に行われなければならないいくつかのケースでは）表面のおおよその高さを決定します。 </li><li> AFM制御ソフトウェアを用いて表面に先端のアプローチを開始します。このプロセスの細部を使用AFMやソフトウェアのモデルによって異なります。 <ol><li>ソフトカンチレバーを使用した場合のアプローチに問題がある場合、接触モードでのアプローチを行います。この場合、ゲインはAMモードの場合よりも低いことを確認し、チップを保持するために（光検出器にレーザーを中心とした後、0.1〜0.2 V）比較的低い値に設定値を設定します。 </li><li>先端がわずかに目標値（AMモードでの接触モードまたは減少の増加）を変化させることにより画像を開始せずに表面に到達したかどうかを評価します。先端が表面にある場合は、トンへの影響彼は、Zピエゾの延長は無視すべきです。 Z-ピエゾのライブの動きは、通常、ほとんどのAFMの制御ソフトウェアにグラフで表示されます。セットポイントの変化は、ピエゾの目に見える動きをトリガした場合、これは、偽の係合を示します。後者の場合には、わずかに高い（接触）または下（AM）の設定値を使用して、現在の先端位置からのアプローチを再起動してください。 </li></ol></li><li>先端が表面に到達すると、（通常は単に「停止」を押して）、Zピエゾを撤回し、カンチレバーを再調整（ステップ5.4を繰り返します。）;共振周波数は、おそらくチップと試料の相互作用に起因する低い値にシフトしています。 </li><li> （このチップ - 試料の距離で）、新たに調整された自由振幅の〜80％にセットポイントを変更します。 </li><li>カンチレバーをエンゲージし、撮像パラメータが適切であることを確認するために、AMモードで表面の10×10 nmの2スキャンを行っています。 <ol><li>トレース（左から右へスキャン）と帰（左に右スキャンする）ことを確認してくださいプロファイルは重ねます。さらに、設定値を減少させ、ゲインを大きくしてみてくださいない場合。 </li><li>画像にノイズになるとゲインを下げてください。 </li></ol></li><li> 1×1μmの2×5μmの2〜5 - -大規模で操作を繰り返したサンプルのスキャンは、これが可能である提供。ソフトまたは生物学的サンプルでは、​​これは先端の汚染をもたらす可能性があります。 </li></ol> 7.高分解能イメージング<ol><li>機能を可視化するのに適した値にスキャンサイズを減らす（ 例えば 、100×100 nmのタンパク質結晶のための2または雲母や方解石のための20×20 nmの2）。 </li><li>自動的にZ-ピエゾので、表面から先端を後退させるフィードバックループのための十分なカンチレバーの駆動振幅を減らします。カンチレバーが表面から離れている間、カンチレバーの振幅〜1-2 NM（ピーク・ツー・ピーク）となるように、駆動振幅を調整します。 </li><li> AFM制御ソフトウェアを使用して、プログレZ-ピエゾが表面に向かって再び拡張し、元の画像が回復されるまで、異常に一度にセットポイントmVの数十を減らします。 75パーセントと新自由振幅の95％の間で設定値の振幅を保管してください。 </li><li> AFM制御ソフトウェアを使用してゲインを再調整してください。高い利得が大きなノイズを導入することなく、より低い振幅で使用することができます。 <ol><li>無料の振幅、設定値の最適な組み合わせを決定し、高解像度のために獲得するように、ステップ7.2から7.4を繰り返します。最適条件は、サンプル（溶媒和の風景や液体の濡れ性）だけでなく、カンチレバー（バネ定数、剛性）に依存します。 </li><li>撮影条件を最適化するために、振幅の異なる組み合わせを探索します。再び自由振幅42を増加させる必要があるかもしれません。このような場合には、第一のより高い値に設定値を調整し、ドライブ（振幅を減少させるために使用されるよりも、すなわち 、逆の手順）を増加させます。 </li><li> setpoiをキープ0.5 20nmの範囲の振幅のnt - 1.5 nmの（ピーク・トゥ・ピーク）設定値の比率では、（典型的には0.75から0.95）0.7以上に保ちます。 2 N / mの - 親溶媒インターフェイスの場合、0.5のバネ定数とカンチレバーを使用しています。これは、チップが表面に当たることなく、界面の液体の大部分を除去するのに十分です。経験則は式が提案されています。参照29の4。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

その発明以来、30年前、原子間力顕微鏡（AFM）1は、特に巨視的な表面領域にわたって平均ところ、ナノスケールでサンプルを調査するための選択肢の技術としての地位を確立していることは不可能であり、地域の情報が必要です。典型的なAFM測定では、フレキシブルカンチレバーの偏向は分子の少数カンチレバーの端部に取り付けられultrasharp先端との間の相互作用力を定量化するために使用されます。考え相互作用のタイプ及び時間スケールに応じて、情報の広い範囲は、ソフト生体膜2,3の粘弾性特性を含む、誘導することができる、単一の化学物質の強さまたは分子結合4,5の原子論的な詳細表面6から8、磁気9、容量10、サンプルの11、熱12,13および化学14導電特性を<sup&gt; 15。それは探針と試料との間の特定の力に依存しないため、AFMの成功の一部は、材料16の広い範囲に及び、真空17、ガス11,18または液体19,20などの複数の環境で動作する能力であります。 しかし、実際には、周囲以外の条件でAFMを動作させるのは、困難で、多くの公開された結果は、静止空気中で得られることができます。追加された困難は、大きな摩擦力を回避することにより、チップと試料の両方を保持するために動的モード（振動先端）でAFMを動作させるために通常必要であるという事実に由来します。より困難なものの、動的な動作は、原則的に分析し、空間分解能の損失なしに、サンプルに関する詳細な情報を提供することができます。多周波測定を、23 - 10年間で、液体の動的AFMのフィールドは、ビデオレートAFM 21の出現から、重要な進展が見られました<sup&gt; 24,25およびインタフェース26で水和構造のサブナノメートルイメージング- 31。 36、ポリマー研究37、電気化学38 - - 40固液界面41特徴付け- 44を液中に浸漬しながら、AFM動作について日常的に生物学および生物物理学32で使用されています。振動カンチレバーの周りの液体の存在はかなりそのダイナミクス45と同様に、先端と試料29,42の間の相互作用を変化させます。適切に使用されるとき、液体は、周囲条件46で達成最高の解像度と比較して、大きさのほぼオーダーの典型的な改善と、撮像解像度26,29を強化するために利用することができます。 AFMでは、特定の測定のために達成可能な最高の空間分解能は、AFM自体の品質とtの両方の性質に依存します彼は相互作用が20,47,48をプローブしました。現時点では、ほとんどのハイエンドは、熱限界12のそれに近い市販のAFM存在するノイズレベルはそれほど解像度のための決定要因は、通常、チップと試料の相互作用です。これは、効果的に解像度を決定し、この相互作用の空間勾配である：短距離、急速に減衰する相互作用に基づく測定は長距離相互作用が遊んでいるときよりも高い解像度の結果を生成します。彼らは離れて、試料49の表面から移動するときに液体のわずか数分子径（一般的に&lt;1 nm）を超える消滅する傾向があるため、液体では、溶媒和力は、撮像解像度を向上させることができます。これらの力は、液体分子と試料の表面との間の相互作用に由来します。表面に強い親和性を有する液体は、より規則およびサンプル29,42,50との界面におけるバルク液体未満の携帯になる傾向があります。結果として、それはナノスケール-the溶媒和の風景での界面の液体の特性の局所的な変化に非常に敏感な測定をレンダリング、バルク液体42よりも界面の液晶分子を変位させる振動AFMチップのために多くのエネルギーがかかります。 溶媒和力を利用するために、いくつかの実用的な側面を考慮する必要があります。まず、先端の振動振幅は&lt;一般的に、1 nmの溶媒和力の範囲に匹敵する必要があります。第二に、使用される液体は、試料の表面で明確に定義された溶媒和の景観を形成しなければなりません。肉眼、これは考えサンプルのための「濡れ」の液体を必要とすることと同じです。例えば、水に、疎水性グラファイト42,51よりも親水性の雲母の分子レベルの分解能を達成することが容易です。最後に、先端部を支持するカンチレバーのバネ定数を適切52,53選択する必要があります。これらの詐欺で作業する場合ditions、AFMは、界面の分子レベルの画像を提供しないだけでなく、試料表面54に関する化学的情報を得るために使用することができ、ローカルサンプル液親和性に関する情報を導出します。 液体中のAFMのための操作の最も一般的なダイナミックモードは、振幅変調（AM、また「タッピングモード &#39;）AFMと周波数変調（FM）AFMです。その振動振幅が連続チップ-試料間距離を再調整するフィードバックループによって一定に保たれつつ、第1ケース55には、チップサンプルをラスタ・スキャンします。試料のトポグラフィ画像は、フィードバックループによって適用される補正から得られます。 FM-AFM 28,41,56には、先端が試料を走査しながら、一定に保持されるカンチレバー/チップの発振周波数です。両方の技術は、液体36,57で同等の地形分解能を提供します。チップと試料の相互作用の定量化は、よりstraiになる傾向がありますghtforwardと正確なFM-AFMではなく、AM-AFMは、実装が簡単より堅牢で、より柔らかいカンチレバー、容易に変形やデリケートなサンプルを研究するために有用なものを扱うことができます。重要なことは、AM-AFMの一部は歴史的な理由だけでなく、原因、制御することが技術的に容易であるという事実のために、AFMユーザーの間でより広範囲です。 振幅AM-AFMイメージングの間のフィードバックループによって一定に保たれているが、先端振動と駆動振動との間の位相遅れを自由に変更することが許されます。位相遅れはサンプル58との界面における先端の振動中に消費するエネルギーに関連している、チップと試料の相互作用についての有用な情報を提供することができます。したがって、位相イメージングは​​地形イメージングに同時に取得することができ、多くの場合、試料表面の不均一性を強調で相補的です。位相イメージングは​​、ジ含む、相互作用の様々なマッピングのために利用されています付着エネルギー42、粘弾性特性58とインターフェース44の水和風景の矩形マッピング。 具体的には、液体中に高解像度の画像を得ることにより制御する多数のパラメータ、およびすべての状況で動作する単純な、系統的プロトコルが存在しないため、非自明なままです。画質は、典型的には、他の55のうち、カンチレバー形状および弾性、先端化学、振動振幅、およびサンプルの剛性に依存します。 AFM測定は、定義により、また、システムの摂動です。その結果、適切な配慮なしにイメージング変数や環境条件を変更すると、再現性の困難および/または不適当な観察と誤った結果につながることができます。 ここでは、AMPLで動作市販の装置を用いて、溶液中でのハードおよびソフトのサンプルの高解像度の画像を達成するための我々のプロトコルを提示しますitude変調。私たちの目標は、それぞれの場合にイメージングプロセスの基礎となる物理的原理からの私達の選択の根拠を説明する、異なるサンプル以上の解像度に影響を与える可能性が高い主なパラメータを最適化するための実用的な手順を提供することです。我々詳細は、基板洗浄及び準備から、カンチレバー、撮像パラメータの調整と共通の問題のトラブルシューティングの選択にステップ・バイ・ステップのアプローチ、。高解像度のための私達の選択や手続きの背後にある科学的根拠を説明することの方法論を適応させる際に合理的な選択をすることに役立ち、およびイメージング・小説・システムのための出発点となるべき。 このテキストを通して、私たちは、AFMの振幅変調動作モードを参照するためにAMを使用しています。我々は、 設定値のいずれかと、カンチレバーの偏向（接触モード）または振動振幅（AMモード）の間、フィードバックパラメータを一定に維持指します。 AMモードでは、カンチレバーは、外部から駆動されます。いずれかの音響振動によってまたはパルスレーザでは、カンチレバーの基部に焦点を当てました。 駆動振幅は、外部振動信号の強度です。カンチレバーの所定の振動振幅を達成するのに必要な駆動振幅の絶対値は、このような駆動方法（音響、磁気または光熱）、カンチレバーの固定及びパラメータ（剛性、幾何学）およびレーザアラインメントのような多くのパラメータに依存します。駆動振幅の正確な値は、したがって、関連しないが、カンチレバーの適切な（および定量化）の振動振幅を提供するようにそれを各実験に調整されます。駆動カンチレバーは遠く離れたサンプルからであり、その振動のない減衰がチップと試料の相互作用を介して発生していない場合には、その振動振幅は自由振動の振幅と呼ばれています。振動先端が試料表面に近づくと、その振幅が減少し始めます。フィードバックが有効になっている場合は、z軸ピエゾはconstでますantly選択した設定点の振幅をキールするように、その拡張子を再調整定数。目標値は、通常、無料の振幅よりも常に小さいです。自由振幅の上に設定点比 、セットポイントの振幅の比（撮像振幅）を参照するのが一般的です。目標比より小さい、厳しい撮影条件です。

<table><tbody><tr><td>マルチモードIIIA AFM</td><td>ブラ</td><td>ッカーNA</td><td></td></tr><tr><td>Cypher ES AFM</td><td>Asylum Resarch</td><td>NA</td><td>を使用したマシンの1つ</td></tr><tr><td>AFMカンチレバー/チップ</td><td>Nanoworld</td><td>Arrow UHF-AUD</td><td>最高の高周波</td></tr><tr><td>AFMカンチレバー/チップ</td>オ<td>リンパス</td><td>RC800-PSA</td><td>多用途で安価な</td></tr><tr><td>超純水</td><td>ミリポア</td><td>NA</td><td>ラボのフィルタリングシステムは、汚染を誘発することができます</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&nbsp;</td><td>標準的な化学薬品、それ以上の精製は不要</td></tr><tr><td>一価塩</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>標準化学薬品、それ以上の精製なし</td></tr><tr><td>脂質</td><td>Avanti 極性脂質</td><td></td><td>標準プロトコルを使用して形成された脂質二重層</td></tr><tr><td>クリスタル</td><td>MTI</td><td></td><td>研磨クリスタル</td></tr><tr><td>スコッチテープ</td><td>3M</td><td>スコッチマジックテープ</td><td>半透明テープ 最適に機能します。透明が強くくっついている</td></tr></tbody></table>

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

原子間力顕微鏡(AFM)は、空気中および液体中のサンプルのナノスケールイメージングのための確立された技術となっています。最近の研究では、振幅変調(タッピング)モードで操作すると、液体中の幅広い軟質サンプルと硬質サンプルに対して原子レベルまたは分子レベルの分解能の画像が得られることが示されています。このような状況では、微小振動振幅(SAM-AFM)は、サンプルの表面で溶媒和された液体を利用することにより、分解能を向上させます。この技術は、材料科学、生物学、生物物理学、表面化学など、さまざまな分野で成功裏に適用されていますが、液体で高解像度の画像を取得することは、初心者ユーザーにとって依然として困難です。これは、カンチレバーの選択、サンプル調製、イメージングパラメータの正しい操作など、制御および最適化する変数が多数あることが一因です。ここでは、市販の装置でSAM-AFMを使用して、流体中の硬質および軟質サンプルの高解像度画像を取得するためのプロトコルを紹介します。私たちの目標は、装置とサンプルの洗浄と調製、カンチレバーの選択、イメージングパラメータの最適化など、高解像度の画像を達成するためのステップバイステップの実用的なガイドを提供することです。各ステップでは、すべてのユーザーの特定のシステムへの方法論の適応を促進するための選択の背後にある科学的根拠を説明します。

前のセクションで説明したプロトコルは、正常molecular-または原子レベルの画像を達成するために、いくつかの市販のAFMを用いて適用されています。すべての画像は手順7.1から7.4ステップ以下、個々に調整0.5 nmから1.5 nmの作業振幅で得られました。結果は、ソフト（ 図2）と硬い（ 図3）試料の広い範囲を得ることができました。それぞれの場合において、関心の特徴が強調されています。技術の大きな利点の一つの小さな振動振幅と高設定点は、脂質の脆弱な自己アセンブリを可能にする、サンプルの先端によって加えられる力を最小限に抑えることである（ 図2A）、タンパク質（ 図2BおよびD）、および両親媒性分子（ 図2C）は 、溶液中の損傷を与えることなく撮像することにします。そのような鉱物硬い結晶性物質（ 図3A、B、D）とすべての場合において、それが効果的に記述されたプロトコルを用いて画像形成される界面の液体であるため、表面（ 図3C）に吸着させ、単一の金属イオンは、アプローチを使用して画像化することができます。溶媒和力は、 図2および図 3に示すサンプルに匹敵する：すべてのサンプルは、（より一般的に図2C、3B、3Dの場合は「親溶媒」）イメージングソリューションに関して親水性です。一貫して、同程度の剛性を有するカンチレバー（0.3 - 0.8 N / m）をすべての場合に使用しました。サンプルチップの両方が液体分子を画像化することができる明確に定義された溶媒和構造を形成することを確実にするために親溶媒であるべきです。これは必ずしも十分条件ではありませんが、ほとんどの場合、比較的少量の液体分子のために、サンプルの対称性を模倣する方法で、液体再構造そのもの。高解像度のメインドライバは、吸着した溶媒分子の親和性の局所的変動であります（ 図2A、3A、3Cの場合はオングストロームスケール）表面のため。技術は、溶媒構造が表面を横切って大幅に変化する材料にしたがって最適です。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> 図2：水溶液中でAM-AFMによって撮像されたソフトのインターフェイス。 ：ゲル相におけるジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）脂質二重層は、150mMのKClの中で画像化しました。六角形にパックされた脂質頭部基は、水和における部位特異的な変化を示す局所的なコントラストとともに、地形や位相の両方で識別可能です。 B：150mMの塩化カリウム、10mMトリス、pH7.4中に結像好塩菌のsalinarumの紫膜。いくつかのバクテリオロドプシンタンパク質トリマーが強調表示されます。相が原因タンパク質上のローカル水和サイトへの地形とは異なるコントラストを示します。個々のタンパク質トリマー<html> （破線）を作製することができます。 C：色素増感太陽電池中のTiO 2ナノ粒子の表面に吸着された両親媒性色素（Z907）分子。画像は、エチル - イソプロピルスルホンで取得しました。スポンジ状の外観は、吸着色素分子によって生成されます。 D：B.アンアクアポリン四量体と同じバッファで撮像されたネイティブのウシレンズ膜におけるアクアポリンの結晶が強調表示されます。サブ構造は、ヘリックス間のループに対応する位相は、タンパク質の近くに異常な水の挙動に起因する著しく異なるコントラストを示している地形に表示されます。画像は、参考文献36（B）、参考文献38（C）及びREF 67（D）から適合されています。スケールバーは5nmの（A）、10nmの（B）、（C）3ナノメートル、15ナノメートル（D）カラースケール600、それぞれ200午後及び15°（A）の高さと位相の変化を示しています午後4°（B）、2.5 nmおよび2.5°（C）、及び1.6 nmおよび9.5°（D）。ロード/ 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> 図3：流体溶液中のハードのサンプルの代表AM-AFM像。 A：方解石結晶[ <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" />平衡化した超純水の溶液に結像]表面。 B：ジメチルスルホキシド（DMSO）で得られた画像形成されたチタン酸ストロンチウム。高解像度を水に不可能でした。 C：3 mMのRbClをで撮像された白雲母-単一の吸着のRb +イオンは両方の相と高さのスキャンにおける雲母の格子サイトに表示されます。 D：DMSO中に撮像された中で炭化ケイ素。予想結晶構成は、画像Bに示されており、D.画像は、参考文献68（A）から参考文献42（BおよびD）に適合されていますそして、ref 44（C）。スケールバーは3ナノメートル（A、B、D）および5nmの（C）です。カラースケールは、それぞれ250午後と14°（A）、600午後及び5.5°（B）、800午後と15°（C）、および500午後と3.5°（D）の高さと位相の変化を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

我々は、液体中の振幅変調（タッピングモード）原子間力顕微鏡を用いて、サブナノメートルの解像度の画像を達成するための方法を提示します。この方法は、市販の原子間力顕微鏡で実証されています。私たちは、パラメータの私達の選択の背後にある理論的根拠を説明し、解像度の最適化のための戦略を示唆しています。

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

この手順の全体的な目的は、振幅変調（タッピングモードとしても知られる）で動作する市販のAFMを用いて、液体中で可能な限り最高の分解能でイメージングを行うことです。この手法は、高分解能を得るための最適なパラメータの組み合わせを用いることで、液体中における標準的なAFM操作の限界を押し上げるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ほとんどの市販のAFMで使用でき、特別な設備を必要としないことです。本手法は、AFMに関する基礎知識を有しており、本技術をより高度に活用したいと考えている研究者および技術者を対象としています。本手法は特定の試料に限定されるものではなく、物理学、生物学、化学、材料科学、およびサービス科学などの幅広い分野の試料に適用可能です。一般的に、本技術に不慣れな方は、特定の試料に対して最適なパラメータを見つけ出すまでに忍耐が必要となるため、習得に苦労することがあります。器具および基板を保持するディスクを、超純水でバスソニケーションします。続いてイソプロパノールで10分間、さらに超純水で10分間、それぞれ洗浄します。高解像度を目指す場合、わずかな汚染であっても致命的な結果を招く可能性があります。常に手袋を着用し、サンプル、カンチレバー、またはAFMセルに接触するあらゆる表面や器具が十分に洗浄されていることを確認してください。超音波処理後、各器具とサンプルディスクを窒素気流下で乾燥させます。単一の吸着金属イオンをイメージングするために、マイカの支持体としてスチールディスクを使用してください。超純水、イソプロパノール、そして超純水の順に浸した低リントのシングルプライティッシュで拭き取り、超音波洗浄で汚れが落ちない表面を物理的に洗浄します。その後、表面を最大30分間自然乾燥させます。次に、試薬を十分に混合して少量のエポキシ接着剤を調製し、洗浄済みのスチール試料ディスク上にエポキシを約10 µL滴下します。マイカ基板をエポキシ樹脂の上に置き、基板に圧力をかけてスチールディスクに固定します。メーカーの仕様に従い、高温で数時間エポキシ樹脂を硬化させます。その後、幅2.5 centimeterの粘着テープを基板にしっかりと押し当てて表面全体を覆い、最上層を滑らかに剥がします。マイカの表面が目視で鏡面のように滑らかになるまで、この工程を2〜3回繰り返します。カンチレバーチップをイソプロパノール、次に超純水のバスにそれぞれ60分間浸漬させます。その後、安定した水和部位の形成を促進するために、チップに最大5分間UV光を照射します。過剰な露光時間を長くしすぎると、チップが損傷したり、曲率半径が増大したりする可能性があります。カンチレバーをAFMのカンチレバーホルダーに挿入し、表面を事前に濡らすために、イメージング液 25 µLをカンチレバーとチップにピペットで滴下します。これにより、サンプルに接近させる際に気泡が発生しにくくなります。サンプルディスクと基板をサンプルステージ上に溶着させ、サンプルにイメージング液を1滴加えます。次に、カンチレバーホルダーをAFMに接続します。カンチレバーとサンプルを近接させ、カンチレバーチップ上の液体とサンプル上の液体の間にキャピラリーブリッジを形成させます。AFMソフトウェアを使用して、測定レーザーをカンチレバーのチップ先端付近に合わせます。次に、熱スペクトルのメインピークからカンチレバーの共振周波数を求めます。カンチレバーのたわしが校正されている場合、共振ピークを単振動子モデルでフィッティングすることで、カンチレバーのばね定数が得られます。次に、熱スペクトルで特定した共振周波数に近い周波数範囲で外部駆動させ、振幅応答を確認してカンチレバーを調整します。自由振動の振幅が約5 nmになるように駆動振幅を調整してください。これは、ほとんどのAFMにおいて通常0.2-0.8 Vに相当します。次に、振幅のセットポイントを自由振幅の約80%に調整します。続いて、フィードバックゲインを比較的高めに設定します。不安定な挙動やリンギングが発生しないことを確認した後、初期走査速度を約1 Hzに、走査サイズを10 nmに設定します。AFM制御ソフトウェアを使用して、チップを表面に接近させます。イメージングを開始せずに、セットポイント値をわずかに変更して、チップが表面に到達したかどうかを確認します。チップが表面にある場合、ZPAゾーンの伸長への影響は無視できるはずです。チップが表面に到達したら、ZPAゾーンを戻し、カンチレバーを再調律します。チップとサンプルの相互作用により、共振周波数はおそらく低い値にシフトしています。次に、セットポイントを新たに調律した自由振幅の約80%に変更し、カンチレバーを作動させて、振幅変調モードで表面を10 nm × 10 nmの範囲でスキャンし、イメージングパラメータが適切であることを確認します。トレースとリトレースのプロファイルが重なっているか確認します。重なっていない場合は、セットポイントをさらに下げ、ゲインを上げてみてください。画像にノイズが入る場合は、ゲインを下げます。可能であれば、試料の1〜5 µm²という広い領域でこの操作を繰り返します。軟らかい試料や生物学的試料の場合、これによりチップが汚染される可能性があります。スキャンサイズを、関心のある構造を可視化するのに適した値まで小さくしてください。これは20×20ナノメートルまで小さくすることが可能です。次に、フィードバックループによってZPAゾーンが自動的に後退し、チップが表面から離れるまで、カンチレバーの駆動振幅を下げます。カンチレバーが表面から離れている間に、カンチレバーの振幅がピークツーピークで1～2ナノメートルになるよう、駆動振幅を調整します。セットポイントを段階的に小さく下げていき、ZPA領域が再び表面に向かって拡大し、元の画像が復元されるまで調整します。セットポイントの振幅は、新しい自由振幅の75%から95%の間に維持してください。その後、振幅が低くなれば、大きなノイズを導入することなくより高いゲインを使用できるため、ゲインを再調整します。高解像度を得るために、フリー振幅、セットポイント、およびゲインの最適な組み合わせを見つけるようシステムを最適化してください。最適なシステム条件は、試料、液体の濡れ性、および使用するカンチレバーに依存します。親溶媒性界面には、ばね定数が 0.5 から 2 N/m のカンチレバーを使用してください。この手法を用いて、幅広い種類のサンプルからサブナノメートル分解能の画像が得られました。ここに示すソフトサンプルには、脂質二重層、halobacterium salinarum由来のパープルメンブレン、両親媒性二分子の自己組織化単分子層、およびウシ水晶体膜由来のアクアポリン結晶が含まれます。いずれの例においても、注目すべき特徴が強調されています。振動振幅を小さくし、設定値を高くすることで、チップが試料に及ぼす力を最小限に抑えることができます。これにより、脂質二重層の脆弱な自己組織化構造、天然バイオメンブレン内のタンパク質、および親水性・親油性分子を、溶液中で損傷させることなくイメージングすることが可能になります。方解石、チタン酸ストロンチウム、炭化ケイ素などの硬い結晶材料や、マイカ表面に吸着した単一金属イオンもこの手法でイメージング可能です。なぜなら、いずれの場合においても、実際にイメージングされているのは結晶自体ではなく界面液体であるためです。この手法を習得すれば、正しく実施する限り、ほぼ毎回、液体中で分子レベルまたは原子レベルの分解能を得ることができます。この手順を実施する際は、イメージングの対象が界面液体であることに留意することが重要です。そのため、ソフトなイメージング条件を用いる必要があります。チップ、試料、または液体の汚染が、高解像度を達成できない主な原因となることが一般的です。不確実な点がある場合は、液体が接触するすべての表面を洗浄し、イメージング溶液を再利用することが多くの場合有効です。また、外部ノイズは高解像度を得る上で不利に働きます。換気ダクトから離れた、振動の少ない床の上に設置することが望ましいです。このビデオを視聴することで、高解像度AFMを実現するためのイメージングパラメータの最適化方法を十分に理解できるはずです。もちろん、あらゆる最先端技術と同様に、サンプルの最適なイメージング方法を決定するには数回の試行が必要な場合があるため、忍耐強く取り組むことが重要です。

sub-nanometer-resolution-imaging-with-amplitude-modulation-atomic

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Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

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クワトロパラレルカンチレバーアレイを用いたアクティブプローブ原子間力顕微鏡によるハイスループット大規模サンプル検査(英語)

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液晶セルの透過型電子顕微鏡を使用して液体の材料の動的過程を明らかにする

学ぶ液体中の振幅変調原子間力顕微鏡を用いたサブナノメートル分解能イメージング手法。商業用AFMで高解像度を実現するパラメータ最適化プロトコルを習得し、物理学・生物学・化学・材料科学など幅広いサンプルに適用可能です。

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