生細胞イメージングによる免疫学的Synapseトポロジーの評価

トランスフェクトされたスーパー抗原処理されたヒト内皮細胞を含むバッファーを入れた顕微鏡皿を取り、スーパー抗原をクラスII MHC分子に複合体化させます。

これらの人工抗原提示細胞は、膜と細胞質上で異なる蛍光タンパク質を共発現します。

次に、T細胞受容体を介して内皮細胞上のスーパー抗原と相互作用し、安定した細胞間結合、免疫シナプスを形成するTリンパ球を導入します。

これにより、T リンパ球の細胞骨格の再構成が引き起こされ、細胞の拡散とアクチンの伸長が開始され、アクチン、接着、シグナル伝達分子が豊富なインバドソーム様突起 (ILP) が形成されます。

接着分子は内皮細胞上の特定の受容体に結合し、相互作用を強化します。

シナプスの形成は T リンパ球シグナル伝達経路を活性化し、細胞内カルシウムレベルを上昇させ、ILP を安定させます。

ILPは内皮細胞に局所的な膜曲げを誘導し、一過性表面リングを形成する

蛍光顕微鏡下で、内皮細胞内の蛍光細胞質変位の暗い円形ゾーンで構成され、ILPの周囲の異なる蛍光膜リングと共局在するシナプストポロジーを分析し、免疫学的シナプス形成を確認します。

細胞をライブ画像化するには、顕微鏡システムの電源を入れ、適切な画像キャプチャソフトウェアを開きます。自動マルチチャンネルタイムラプスイメージングの適切なパラメータと、10〜30秒の取得間隔と約20〜60分の合計時間を設定します。

次に、対物レンズに新鮮なオイルを追加します。0.5ミリリットルのバッファーAを含む顕微鏡皿を加熱ステージアダプターに取り付け、以前は摂氏37度に設定されたアダプターのスイッチをすぐにオンにします。2〜3分間の平衡化後、20マイクロリットルのピペットを使用して、安静なFura-2をロードしたリンパ球を取り付けられた顕微鏡ディッシュチャンバーに加え、明視野イメージングをオンにします。

接眼レンズへの光路を選択し、粗いフォーカスノブを使用して対物レンズを顕微鏡皿の底に接触させます。次に、接眼レンズとファインフォーカスノブを使用して、皿の底に沈殿したT細胞を見つけ、XYステージコントロールを使用して、少なくとも10個の細胞を含むフィールドを選択します。

適切なセルが配置されたら、明視野から蛍光光源に、接眼レンズイメージングからCCDカメラに切り替えます。取得パラメータを最適化し、静止中のFura2-340およびFura2-380画像を取得します。

成功した結果を生み出すための重要なステップの1つは、蛍光取得パラメータを慎重に最適化し、十分なシグナルが収集され、Fura-2の場合、ベースラインの340/380比が1に近づくようにすることです。

Fura-2露光時間が設定されたら、T細胞のディッシュを内皮細胞の顕微鏡ディッシュに交換します。使い捨てのトランスファーピペットを使