生細胞イメージングによる免疫学的Synapseトポロジーの評価

トランスフェクトされたスーパー抗原処理されたヒト内皮細胞を含むバッファーを入れた顕微鏡皿を取り、スーパー抗原をクラスII MHC分子に複合体化させます。

これらの人工抗原提示細胞は、膜と細胞質上で異なる蛍光タンパク質を共発現します。

次に、T細胞受容体を介して内皮細胞上のスーパー抗原と相互作用し、安定した細胞間結合、免疫シナプスを形成するTリンパ球を導入します。

これにより、T リンパ球の細胞骨格の再構成が引き起こされ、細胞の拡散とアクチンの伸長が開始され、アクチン、接着、シグナル伝達分子が豊富なインバドソーム様突起 (ILP) が形成されます。

接着分子は内皮細胞上の特定の受容体に結合し、相互作用を強化します。

シナプスの形成は T リンパ球シグナル伝達経路を活性化し、細胞内カルシウムレベルを上昇させ、ILP を安定させます。

ILPは内皮細胞に局所的な膜曲げを誘導し、一過性表面リングを形成する

蛍光顕微鏡下で、内皮細胞内の蛍光細胞質変位の暗い円形ゾーンで構成され、ILPの周囲の異なる蛍光膜リングと共局在するシナプストポロジーを分析し、免疫学的シナプス形成を確認します。

細胞をライブ画像化するには、顕微鏡システムの電源を入れ、適切な画像キャプチャソフトウェアを開きます。自動マルチチャンネルタイムラプスイメージングの適切なパラメータと、10〜30秒の取得間隔と約20〜60分の合計時間を設定します。

次に、対物レンズに新鮮なオイルを追加します。0.5ミリリットルのバッファーAを含む顕微鏡皿を加熱ステージアダプターに取り付け、以前は摂氏37度に設定されたアダプターのスイッチをすぐにオンにします。2〜3分間の平衡化後、20マイクロリットルのピペットを使用して、安静なFura-2をロードしたリンパ球を取り付けられた顕微鏡ディッシュチャンバーに加え、明視野イメージングをオンにします。

接眼レンズへの光路を選択し、粗いフォーカスノブを使用して対物レンズを顕微鏡皿の底に接触させます。次に、接眼レンズとファインフォーカスノブを使用して、皿の底に沈殿したT細胞を見つけ、XYステージコントロールを使用して、少なくとも10個の細胞を含むフィールドを選択します。

適切なセルが配置されたら、明視野から蛍光光源に、接眼レンズイメージングからCCDカメラに切り替えます。取得パラメータを最適化し、静止中のFura2-340およびFura2-380画像を取得します。

成功した結果を生み出すための重要なステップの1つは、蛍光取得パラメータを慎重に最適化し、十分なシグナルが収集され、Fura-2の場合、ベースラインの340/380比が1に近づくようにすることです。

Fura-2露光時間が設定されたら、T細胞のディッシュを内皮細胞の顕微鏡ディッシュに交換します。使い捨てのトランスファーピペットを使用して、培地をすばやく除去し、1ミリリットルの予熱したバッファーAで細胞を一度すすぎ、次に、洗浄液を0.5ミリリットルの新鮮なバッファーAと交換します。

目的を使用して、明るく蛍光を発する内皮細胞が健康に見えるフィールドを特定し、Fura-2で示したように、各チャネルの平均蛍光シグナル強度が検出器のダイナミックレンジの25%から75%の間に収まるように注意しながら、メンブレン-YFPとDsRedの取得パラメータを調整します。

生細胞イメージング実験を実施する前に、内皮細胞のみの画像を数間隔キャプチャして、自動化ソフトウェアでベースラインを確立します。次に、少量のピペットの先端を対物レンズの中心に近い培地に挿入し、5マイクロリットルの濃縮Fura-2をロードしたリンパ球を顕微鏡ディッシュイメージングフィールドの中心にゆっくりと分注します。

リンパ球が落ち着いたら、焦点を微調整して、T細胞/内皮細胞界面が焦点面に維持されるようにします。40倍と63倍の対物レンズでは、フィールドごとに10〜20セルが最適です。