画像ベースのマイクロニュートラル化アッセイを用いたウイルス間の抗原関係の解析

培地と連続希釈した受容体破壊酵素処理抗血清を哺乳類細胞単層に添加し、非特異的なウイルス結合を防ぎます。

インフルエンザウイルス懸濁液を追加します。ウイルスタンパク質に特異的な抗血清抗体は、結合してウイルスを中和し、細胞への侵入を防ぎます。

中和抗体濃度が低いか、中和抗体がない場合、ウイルス抗原結合が効果がなくなり、ウイルスが細胞受容体に付着します。

メディアを破棄します。セルロース含有培地を塗布し、半固体のオーバーレイを形成します。

ウイルスは宿主細胞機構を使用してウイルス粒子を形成し、細胞溶解を引き起こします。

オーバーレイはウイルスの移動を制限し、局所感染を促進し、細胞単層に穴を作ります。

オーバーレイを取り外します。細胞を固定し、透過性化します。

バッファーで洗浄します。透過処理された細胞内にウイルス抗原に結合する抗体を追加します。

一次抗体に結合するピペット西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体

ペルオキシダーゼ基質と過酸化水素を導入すると、青色の生成物が得られます。

抗血清希釈液に対してウイルスに感染した細胞集団を定量するための画像ウェル。

感染した細胞集団の特定の減少を示す抗血清希釈液を特定して、中和力価を決定します。

ウイルス中和を実行するには、2〜3日前に細胞単層を準備し、プレートの各ウェルに50マイクロリットルのVGMを追加します。11列目と12列目をそれぞれウイルスコントロールとセルコントロールに使用します。受容体破壊酵素またはRDE処理血清の20分の1希釈液の50マイクロリットルのアリコートを、列1〜10の最初の行に追加します。

50マイクロリットルを行Aから行Hに移し、行Hから50マイクロリットルを廃棄することにより、2倍の連続希釈を実行します。次に、細胞対照カラムの各ウェルに50マイクロリットルの希釈液を加えます。セルコントロールカラムを除くプレートの各ウェルに50マイクロリットルのウイルスを追加します。プレートを摂氏37度で2〜3時間インキュベートします。次に、接種物を取り除き、各ウェルにオーバーレイを追加します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、プレートを固定して染色します。

中和を定量化するには、フラットベッドスキャナーのスキャン領域にウェルプレートを配置します。プレートをスキャンし、ウェルプレートリーダーソフトウェアを実行して、必要なウイルス力価を計算します。