定量的マイクロ中和アッセイの最適化
2016年12月14日
この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。
このマイクロ中和アッセイの全体的な目標は、現在流行しているすべてのタイプのインフルエンザウイルスと、抗体および抗ウイルス測定の活性を定量的、ハイスループット、および高感度な方法で特徴付けることです。この方法は、インフルエンザウイルスの抗原特性評価、抗体の定量的中和、抗ウイルス活性など、ウイルス学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、目に見えるプラークと見えないプラーク、および単一細胞感染を含む、感染した細胞集団全体を特徴付けることです。
マイクロ中和アッセイは、ロンドンのWHOインフルエンザ協力センターのアシスタントディレクターであるYipu Lin博士によって実証されます。次のプロトコルのバイオセーフティレベル(BSL)は、季節性インフルエンザウイルスの場合はBSL 2、潜在的なパンデミックインフルエンザウイルスの場合はBSL 3+です。まず、十分な細胞を96ウェルプレートに分注します。
細胞を摂氏37度、CO25%で2〜3日間インキュベートし、コンフルエンスに到達させます。70%エタノールを使用して、マルチウェルプレートウォッシャーを滅菌し、PBSまたはVGMを使用してすすぎます。次に、200マイクロリットルのウイルス増殖培地(VGM)を使用して、コンフルエントセルを洗浄します。
細胞からVGMを吸引し、すぐに各ウェルに50マイクロリットルのVGMを加えます。次に、6本の滅菌チューブのそれぞれに900マイクロリットルのVGMを追加します。次に、100マイクロリットルのウイルスを最初のチューブにピペットで入れ、よく混ぜます。
最初のチューブから始めて、各希釈間でチップを交換しながら、ウイルスの段階希釈液を調製します。各ウイルス希釈液を最高希釈率から50マイクロリットル追加して、96ウェルプレートのウェルを複製します。次に、プレートを摂氏37度に2〜3時間置き、ウイルスが細胞に感染するのを待ちます。
テキストプロトコルに従ってオーバーレイを調製した後、接種物をウェルから取り出します。次に、各ウェルに200マイクロリットルのオーバーレイを加え、摂氏37度で一晩邪魔されずにインキュベートします。PBS A中の氷冷した4%PFAを200マイクロリットルの井戸に加え、摂氏4度で30分間、または室温で20分間インキュベートします。
インキュベーション後、PFAを吸引し、PBS Aのウェルあたり200マイクロリットルを使用してプレートを2回洗浄します。100マイクロリットルの透過化バッファーをプレートに加え、室温で30分間インキュベートします。次に、PBS Aを使用してプレートを2回洗います。
次に、インフルエンザA型に対するマウスモノクローナル抗体をウェルあたり50μLをウェルに加え、室温で1時間振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、300マイクロリットルの洗浄バッファーを使用してウェルを3回洗浄します。次に、50 μLのHRP標識ヤギ二次抗体をサンプルに加え、室温で1時間インキュベートします。
前回と同様にウェルを3回洗浄した後、ウェルごとに50マイクロリットルの基質を追加し、室温で30分間、または青色の発育がはっきり見えるまでインキュベートします。反応を止めるには、200マイクロリットルの蒸留水を使用してウェルを2回洗います。その後、プレートを風乾した後、暗い場所に保管してください。
フラットベッドスキャナーのスキャン領域にウェルプレートを配置し、L字型の位置制限を使用して、最適で再現性のあるイメージング位置を取得できるようにします。ここに示す設定を使用してプレートをスキャンします。次に、ウェルプレートリーダーソフトウェアを実行し、[Load Image]ボタンをクリックして画像をロードし、必要なウイルス濃度を計算します。
次に、グローバルしきい値タブで、ヒストグラムの赤いバーをスライドさせて、サンプリングしきい値を調整します。次に、更新ボタンをクリックして、画像への影響を調べます。次に、[中和/滴定の計算]ボックスにチェックを入れます。
「Sampling」ボタンをクリックして、感染した細胞集団(ICP)を定量化します。次に、プロンプトが表示されたら、[保存]ボタンをクリックしてサンプリング結果を保存します。滴定結果を取得するには、ウェルプレート定義マップをロードまたは入力します。
滴定:最適なウイルス集団は、しきい値を示します。「滴定プロセス」タブを選択して、滴定結果を計算します。次に、滴定結果を確認してから、[保存して閉じる]ボタンをクリックして結果を保存します。
ソフトウェアの詳細な手順については、付録の S1 を参照してください。ウイルスの中和を行うには、2〜3日前に細胞単層を準備します。次に、プレートの各ウェルに50マイクロリットルのVGMを追加します。
11列目と12列目は、それぞれウイルス制御と細胞制御に使用します。受容体破壊酵素(RDE)処理血清の20分の1希釈分の50マイクロリットルのアリコートを、列1から10の最初の行に追加します。50マイクロリットルを列Aから列Hに移し、50マイクロリットルを列Hから廃棄することにより、2倍段階希釈を行います。次に、細胞制御カラムの各ウェルに50マイクロリットルの希釈液を添加します。
細胞コントロールカラムを除くプレートの各ウェルに50マイクロリットルのウイルスを加えます。プレートを摂氏37度で2〜3時間インキュベートします。次に、接種物を取り出し、各ウェルにオーバーレイを追加します。
プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、このビデオで前述したように、プレートを固定して染色します。中和を定量化するには、このビデオで前述したように、フラットベッドスキャナーのスキャン領域にウェルプレートを配置します。
プレートをスキャンし、ウェルプレートリーダーソフトウェアを実行して、以前と同様に必要なウイルス力価を計算します。ウェルプレートマップをロードまたは入力した後、Neutralization:Infection Deductionで閾値を示します。次に、[Neutralization Process]を選択して力価を計算します。
最後に、力価を確認し、[保存して閉じる]ボタンをクリックして中和結果を保存します。ここに示されているのは、10の1.0倍からネガティブなウイルスまで、10の1.0倍からネガティブな6倍まで希釈された8種類のインプットウイルスの最近の抗原特性評価実験からの滴定結果です。このグラフは、ウイルスの希釈が増加するとICPが減少することを示しています。
曲線は、ウェル内のすべての細胞で感染を引き起こしたのと同じウイルスのICPに対して正規化されました。この表には、中和のための入力ウイルス希釈として選択されたICP飽和度の30%を生成したウイルス希釈液がリストされています。この図は、1つのインプットウイルスと5つの抗血清を用いた中和実験の結果を示しています。
グラフは、血清希釈の増加に伴う感染プロセスを示しています。縦軸上の正規化された陽性集団は、参照ウイルスの平均ICPに対する対応する抗血清応答からのICPの比率を表しています。最後に、中和力価は、50%ICP減少に対応する抗血清希釈液の逆数として決定されました。
このアッセイは、インプットウイルスの定量滴定、ハイスループットイメージング、データ処理など、一貫性、速度、検出感度に焦点を当てています。費用対効果が高く、ユーザーフレンドリーで、ウイルス抗原研究で日常的に使用されています。
概要
本研究では、循環インフルエンザウイルス間の抗原関係を分析するために設計されたマイクロ中和試験を紹介します。このプロトコルではフラットベッドスキャナーを使用し、主にタイトレーション、タイトレーションの定量、中和、および中和の定量の4つのステップで構成されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- ウイルス学
- 免疫学
- 感染症
背景
- このアッセイは、現在流行しているインフルエンザウイルスの特性評価を目的としています。
- 抗体活性および抗ウイルス効果を定量的に測定します。
- 本手法はハイスループットかつ高感度です。
- ウイルス学分野における重要な課題に対応しています。
研究目的
- インフルエンザウイルスの抗原性を特性評価する。
- 抗体の中和能を定量化する。
- 抗ウイルス活性を体系的に評価する。
使用した手法
- 96ウェルプレートにおける細胞単層の調製。
- タイトレーションのためのウイルスの連続希釈。
- 感染細胞を定量するためのフラットベッドスキャナーの使用。
- 検出および解析のための特異的抗体の適用。
主な結果
- 本アッセイは、感染細胞集団全体を効果的に特性評価します。
- ウイルスの希釈度が高まるにつれて、感染細胞集団が減少することが結果に示されています。
- 中和およびタイトレーション結果の定量化に成功したことが実証されました。
- 視覚的なデータにより、インフルエンザウイルスの解析における本アッセイの有効性が裏付けられています。
結論
- マイクロ中和試験は、ウイルス学研究において非常に有用なツールです。
- この試験により、インフルエンザウイルスの抗原関係に関する知見が得られます。
- 本手法は、抗体応答および抗ウイルス活性に対する理解を深めるものです。
よくある質問
業界における重要性
このイメージングベースの微量中和試験により、感染細胞集団全体を測定することで、インフルエンザウイルスの抗原関係の定量的かつハイスループットな特性評価が可能になります。本手法は、ほとんどの研究室に適した、コスト効率の高いスキャナーベースの形式で抗ウイルス活性および抗体活性の評価をサポートします。また、ウイルスのサブタイプ間で再現性のある力価測定および中和データを提供することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： ウイルスの感染力および抗体による中和の定量的な測定を通じて、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： プラーク形成に依存することなく、循環しているインフルエンザ株の抗原性を特性評価することで、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 抗ウイルス薬および抗体スクリーニングの下流ワークフローに向けて、バリデートされた生物学的システムを調製する。
- 運用上の価値： イメージングおよびソフトウェアベースの解析を通じて、標準化され再現性のある定量的アウトプットを提供する。
- 戦略的価値： インフルエンザの抗ウイルス薬および免疫原性研究におけるスクリーニングの準備体制と拡張性を向上させる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：抗体および抗ウイルス候補物質の探索から前臨床評価に至るまで、疾患に関連した一貫性のあるシステムを提供します。
- 運用上の価値：一貫したタイトレーションおよび中和活性の読み取りにより、リスク調整に基づいた前進への意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、初期のウイルス特性解析から、抗ウイルス薬および抗体開発プログラムにおけるリード化合物の同定に至るまでの、ディスカバリー・コンティニュアムに適合しています。
- 基礎生物学研究：ウイルスと細胞の相互作用および免疫干渉を定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：標準化されたウイルス力価測定および感染細胞集団の定量化により、アッセイの準備を可能にします。
- 分析：感染細胞集団と中和抗体価の定量的測定を提供し、条件間の比較分析を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：ワクチンおよび治療薬の評価に関連する抗原性の特性解析を支援し、前臨床試験への継続性を確保します。
- 組織的な再利用：複数のシーズンや株にわたるインフルエンザウイルス研究において、再利用可能なイメージングベースのプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ウイルスと抗体の相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、ターゲット検証における予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：固定されたイメージングプロトコルと自動化ソフトウェア解析により、標準化、再現性、およびスケーラビリティを確保する。
- 戦略的価値：ポートフォリオの優先順位付けに必要な、信頼性の高い抗原性および中和データを提供し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：抗体および抗ウイルス薬候補の定量的かつ一貫した評価を通じて、リスク調整済みの開発推進を可能にする。
実施上の検討事項
- ウイルスの取り扱い、抗体の調製、およびアッセイ結果の解釈には、ウイルス学および免疫学の専門知識が必要です。
- 画像の取得および感染細胞集団の定量化には、フラットベッドスキャナーの利用可能性と互換性のあるソフトウェアに依存します。
- 再現性のある結果を得るためには、ウイルス力価測定プロトコルおよびウェルプレートマッピングのチーム間での標準化が必要です。
- 非インフルエンザウイルスや代替細胞株へ展開する場合、感染性の最適化に基づいた適応上の検討が必要となります。
- 実用上の制限として、信頼性の高い画像コントラストを得るには、選択した細胞株において十分なウイルス感染性があることに依存します。
