定量的マイクロ中和アッセイの最適化

このマイクロ中和アッセイの全体的な目標は、現在流行しているすべてのタイプのインフルエンザウイルスと、抗体および抗ウイルス測定の活性を定量的、ハイスループット、および高感度な方法で特徴付けることです。この方法は、インフルエンザウイルスの抗原特性評価、抗体の定量的中和、抗ウイルス活性など、ウイルス学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、目に見えるプラークと見えないプラーク、および単一細胞感染を含む、感染した細胞集団全体を特徴付けることです。

マイクロ中和アッセイは、ロンドンのWHOインフルエンザ協力センターのアシスタントディレクターであるYipu Lin博士によって実証されます。次のプロトコルのバイオセーフティレベル(BSL)は、季節性インフルエンザウイルスの場合はBSL 2、潜在的なパンデミックインフルエンザウイルスの場合はBSL 3+です。まず、十分な細胞を96ウェルプレートに分注します。

細胞を摂氏37度、CO25%で2〜3日間インキュベートし、コンフルエンスに到達させます。70%エタノールを使用して、マルチウェルプレートウォッシャーを滅菌し、PBSまたはVGMを使用してすすぎます。次に、200マイクロリットルのウイルス増殖培地(VGM)を使用して、コンフルエントセルを洗浄します。

細胞からVGMを吸引し、すぐに各ウェルに50マイクロリットルのVGMを加えます。次に、6本の滅菌チューブのそれぞれに900マイクロリットルのVGMを追加します。次に、100マイクロリットルのウイルスを最初のチューブにピペットで入れ、よく混ぜます。

最初のチューブから始めて、各希釈間でチップを交換しながら、ウイルスの段階希釈液を調製します。各ウイルス希釈液を最高希釈率から50マイクロリットル追加して、96ウェルプレートのウェルを複製します。次に、プレートを摂氏37度に2〜3時間置き、ウイルスが細胞に感染するのを待ちます。

テキストプロトコルに従ってオーバーレイを調製した後、接種物をウェルから取り出します。次に、各ウェルに200マイクロリットルのオーバーレイを加え、摂氏37度で一晩邪魔されずにインキュベートします。PBS A中の氷冷した4%PFAを200マイクロリットルの井戸に加え、摂氏4度で30分間、または室温で20分間インキュベートします。

インキュベーション後、PFAを吸引し、PBS Aのウェルあたり200マイクロリットルを使用してプレートを2回洗浄します。100マイクロリットルの透過化バッファーをプレートに加え、室温で30分間インキュベートします。次に、PBS Aを使用してプレートを2回洗います。

次に、インフルエンザA型に対するマウスモノクローナル抗体をウェルあたり50μLをウェルに加え、室温で1時間振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、300マイクロリットルの洗浄バッファーを使用してウェルを3回洗浄します。次に、50 μLのHRP標識ヤギ二次抗体をサンプルに加え、室温で1時間インキュベートします。

前回と同様にウェルを3回洗浄した後、ウェルごとに50マイクロリットルの基質を追加し、室温で30分間、または青色の発育がはっきり見えるまでインキュベートします。反応を止めるには、200マイクロリットルの蒸留水を使用してウェルを2回洗います。その後、プレートを風乾した後、暗い場所に保管してください。

フラットベッドスキャナーのスキャン領域にウェルプレートを配置し、L字型の位置制限を使用して、最適で再現性のあるイメージング位置を取得できるようにします。ここに示す設定を使用してプレートをスキャンします。次に、ウェルプレートリーダーソフトウェアを実行し、[Load Image]ボタンをクリックして画像をロードし、必要なウイルス濃度を計算します。

次に、グローバルしきい値タブで、ヒストグラムの赤いバーをスライドさせて、サンプリングしきい値を調整します。次に、更新ボタンをクリックして、画像への影響を調べます。次に、[中和/滴定の計算]ボックスにチェックを入れます。

「Sampling」ボタンをクリックして、感染した細胞集団(ICP)を定量化します。次に、プロンプトが表示されたら、[保存]ボタンをクリックしてサンプリング結果を保存します。滴定結果を取得するには、ウェルプレート定義マップをロードまたは入力します。

滴定:最適なウイルス集団は、しきい値を示します。「滴定プロセス」タブを選択して、滴定結果を計算します。次に、滴定結果を確認してから、[保存して閉じる]ボタンをクリックして結果を保存します。

ソフトウェアの詳細な手順については、付録の S1 を参照してください。ウイルスの中和を行うには、2〜3日前に細胞単層を準備します。次に、プレートの各ウェルに50マイクロリットルのVGMを追加します。

11列目と12列目は、それぞれウイルス制御と細胞制御に使用します。受容体破壊酵素(RDE)処理血清の20分の1希釈分の50マイクロリットルのアリコートを、列1から10の最初の行に追加します。50マイクロリットルを列Aから列Hに移し、50マイクロリットルを列Hから廃棄することにより、2倍段階希釈を行います。次に、細胞制御カラムの各ウェルに50マイクロリットルの希釈液を添加します。

細胞コントロールカラムを除くプレートの各ウェルに50マイクロリットルのウイルスを加えます。プレートを摂氏37度で2〜3時間インキュベートします。次に、接種物を取り出し、各ウェルにオーバーレイを追加します。

プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、このビデオで前述したように、プレートを固定して染色します。中和を定量化するには、このビデオで前述したように、フラットベッドスキャナーのスキャン領域にウェルプレートを配置します。

プレートをスキャンし、ウェルプレートリーダーソフトウェアを実行して、以前と同様に必要なウイルス力価を計算します。ウェルプレートマップをロードまたは入力した後、Neutralization:Infection Deductionで閾値を示します。次に、[Neutralization Process]を選択して力価を計算します。

最後に、力価を確認し、[保存して閉じる]ボタンをクリックして中和結果を保存します。ここに示されているのは、10の1.0倍からネガティブなウイルスまで、10の1.0倍からネガティブな6倍まで希釈された8種類のインプットウイルスの最近の抗原特性評価実験からの滴定結果です。このグラフは、ウイルスの希釈が増加するとICPが減少することを示しています。

曲線は、ウェル内のすべての細胞で感染を引き起こしたのと同じウイルスのICPに対して正規化されました。この表には、中和のための入力ウイルス希釈として選択されたICP飽和度の30%を生成したウイルス希釈液がリストされています。この図は、1つのインプットウイルスと5つの抗血清を用いた中和実験の結果を示しています。

グラフは、血清希釈の増加に伴う感染プロセスを示しています。縦軸上の正規化された陽性集団は、参照ウイルスの平均ICPに対する対応する抗血清応答からのICPの比率を表しています。最後に、中和力価は、50%ICP減少に対応する抗血清希釈液の逆数として決定されました。

このアッセイは、インプットウイルスの定量滴定、ハイスループットイメージング、データ処理など、一貫性、速度、検出感度に焦点を当てています。費用対効果が高く、ユーザーフレンドリーで、ウイルス抗原研究で日常的に使用されています。