メタロペプチダーゼに対するモノクローナル抗体作製ハイブリドーマ技術

メタロペプチダーゼで免疫されたマウスを取ります。脾臓を採取し、細胞懸濁液を入手します。

懸濁液をメッシュと遠心分離機でろ過し、組織の破片を取り除きます。

単離された細胞には、メタロペプチダーゼ特異的B細胞が含まれ、メタロペプチダーゼエピトープに対する抗体を産生します。

HGPRT酵素を欠く不死骨髄腫細胞を添加し、ヌクレオチド合成のための核酸塩基のサルベージを防ぎます。それらはde novoヌクレオチド合成を介して生き残ります。

遠心分離してペレットを取得し、上清を廃棄します。

PEGを加えてインキュベートし、骨髄腫とB細胞の融合を誘導してHGPRT陽性の不滅ハイブリドーマを形成します。

ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むHAT培地を追加します。腹膜マクロファージフィーダー層を含むウェルに移し、ハイブリドーマの成長を促進します。

アミノプテリンはde novoヌクレオチド合成をブロックし、融合していない骨髄腫細胞を死滅させます。融合していないB細胞は寿命が短いため死にます。

HGPRT陽性ハイブリドーマは、ヌクレオチド前駆体であるヒポキサンチンとチミジンを回収し、増殖し、メタロペプチダーゼ特異的モノクローナル抗体を分泌します。

上清を回収し、下流のアッセイで抗体産生を確認します。

まず、選択された成体雌マウスに100マイクログラムのAPMタンパク質を腹腔内注射し、最終的な抗原ブーストを行います。注射3日後、マウスから脾臓を採取し、DMEMで2回洗浄して血液と脂肪細胞を除去します。

200メッシュの銅グリッドを使用して脾臓細胞懸濁液をろ過して組織の破片を除去し、遠心分離を使用して脾臓細胞を回収して脾臓膜を除去します。6%ウシ胎児血清を添加した5ミリリットルのDMEMを含む25平方センチメートルのフラスコにマウスSP2/0骨髄腫細胞を播種し、細胞生存率を維持するために摂氏37度、二酸化炭素6%の雰囲気で細胞を培養します。

培養5〜6日後、細胞は蘇生後に80%から90%のコンフルエンスに達し、顕微鏡下で丸く、明るく、透明に見えるはずです。ハイブリダイゼーションの1日前に、マウスの腹腔からマクロファージを採取します。

膜マクロファージを、それぞれ100マイクロリットルのHAT培地を含む96ウェルプレートに0.1〜0.2倍10〜5分の1の密度で播種し、一晩インキュベートします。ハイブリダイゼーションのために、SP2/0細胞をピペットで8〜10本のボトルで穏やかに吸引し、10ミリリットルの無血清DMEM培地に再懸濁します。

細胞を新鮮なDMEMで洗浄し、2回遠心分離してから、10ミリリットルのDMEMに再懸濁します。定量した脾臓細胞をSP2 / 0細胞と10対1の比率で混合し、50ミリリットルのチューブに移します。

遠心分離後、上清を捨て、チューブの底にペレットを集めます。ハイブリダイゼーションの前にチューブを軽くたたいてペレットを緩めます。スポイトを使用して、チューブの底をゆっくりと回転させながら、摂氏37度に予熱したポリエチレングリコール1,500ミリリットルを緩んだ細胞ペレットに45秒かけて滴下します。

次に、摂氏37度に予熱したDMEM1ミリリットルを混合物に90秒間ゆっくりと加え、続いてさらに30ミリリットルの新鮮なDMEMを加え、フュージョンチューブを摂氏37度のウォーターバスに30分間入れます。

インキュベーション後、細胞を回収します。HAT培地を再懸濁し、腹膜マクロファージを接種した96ウェルプレートに培養します。5日後、100マイクロリットルの新鮮なHAT培地を各ウェルに加えます。そして再び、5日間のインキュベーションの後、培地をHT培地に交換します。0.05モルPBSで希釈した5マイクログラム/ミリリットルのAPNタンパク質でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用して、ELISAアッセイを使用してハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体を分析します。