ニューロン-アストロサイト共培養におけるニューロンネットワークの電気生理学的活性の記録

多電極アレイ(MEA)プレートから始めます。各ウェルには、中央に配置された電極アレイが含まれています。

アレイは、細胞接着を促進するために培養基質でコーティングされています。

運動ニューロンとアストロサイトの懸濁液をアレイ上に液滴として追加します。

細胞の付着を可能にするためにインキュベートし、細胞生存率を維持する小分子を添加した温かい共培養培地を加えます。

インキュベーション中、アストロサイトはニューロンの成熟とシナプス形成を促進する因子を分泌し、ニューロンネットワークを形成します。

MEAを生理学的条件下で記録装置に入れて、ニューロンの活動を監視します。

ニューロンは、軸索に沿って伝わる活動電位と呼ばれる電気信号を伝達します。

シナプスに到達すると、信号は神経伝達物質の放出を引き起こし、信号を次のニューロンに伝播します。

各ウェル内の電極は、シナプスに接続されたニューロンによって生成された信号を細胞外に記録します。

同期したリズミカルな電気信号の検出は、ニューロンネットワークの確立を確認します。

めっき当日またはその前に、最初にPLOを水またはPBSで希釈して、24ウェルMEAプレートのコーティングを開始します。次に、各ウェルに15〜20マイクロリットルのPLOを加え、ウェルの中心に液滴を形成し、電極領域を覆い、ピペットチップで電極を損傷しないようにします。

コンパートメントの周囲の井戸に水を加え、十分な湿度を確保し、PLOを摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。次に、プラスチック製のマイクロピペットチップを使用して、電極に触れずにできるだけ多くのPLOを吸引します。次に、井戸を250マイクロリットルの水で3回洗います。

ピペットチップを使用して、できるだけ多くの水を取り除き、蓋を外した状態で表面を乾かします。次に、15〜20マイクロリットルの希釈ラミニンを加えて、各電極アレイを覆います。湿度コンパートメントに水を加え、蓋を元に戻した後、摂氏37度で最低2時間、一晩までインキュベートします。

プレーティング当日、運動ニューロンとアストロサイト培養物をPBSで一度すすぎた後、0.05%トリプシンを加え、摂氏37度で約5分間インキュベートして細胞を持ち上げます。トリプシン阻害剤を含む15ミリリットルの円錐形チューブに細胞を収集し、培地またはベースでプレートを洗浄して、すべての細胞が確実に収集されるようにします。

心分離によって細胞をペレットダウンし、1,000マイクロリットルのピペットを使用して、運動ニューロンとアストロサイトを20マイクロモルのROCK阻害剤を含む共培養培地で再懸濁し、1ミリリットルの単一細胞懸濁液を生成します。血球計算器を使用して、運動ニューロンと星状細胞を数え、数えながら細胞懸濁液にキャップをし、摂氏4度の発泡スチロールラックに入れます。

両方の細胞懸濁液1ミリリットルを300回gで5分間遠心分離します。希望の量を計算し、ペレットを再懸濁します。必要な量のニューロンとアストロサイト懸濁液を等しい比率で混ぜ合わせ、ピペッティングを2回して穏やかに混合し、完全に混ぜ合わせます。

次に、プレートの各ウェルからラミニンを除去し、10マイクロリットルの最終結合細胞懸濁液を各ウェルに移し、電極アレイを覆う小さな液滴を形成します。プレートを摂氏37度で乱されていない細胞液滴で20〜30分間インキュベートし、プレート上に最初の付着物を形成します。

次に、ROCK阻害剤を含む250マイクロリットルの温かい共培養培地を各ウェルの壁にピペットで下ろし、各ウェルの反対側の壁に同じ量をピペットでピペットし、プレートを摂氏37度で24〜36時間インキュベートします。翌日、プレートに破片や死細胞がないか調べ、必要に応じて、培地をROCK阻害剤を含む新鮮な共培養培地と交換します。

それ以外の場合は、共培養2日目から、ROCK阻害剤を含まない共培養培地を使用して、週に2回半培地交換を行います。記録を行うには、共培養1日目からできるだけ早く、温度を摂氏37度、二酸化炭素を5%に設定して開始します。次に、プレートを記録機に移し、記録する前に少なくとも5分間平衡化します。実験計画に応じて、1 日おきまたは毎週 1 分から 15 分かけてベースライン活動を記録します。