マウス胚由来の腹側中脳ニューロンにおけるカルシウム流入の可視化

マウス胚に由来する腹側中脳ニューロンの培養物を含むカバーガラスを取ります。

細胞は、カルシウム指標を発現するためにウイルスベクターに感染します。

カバーガラスを、記録バッファーを灌流した共焦点顕微鏡の記録チャンバーに移します。

可視光を使用して、複数のニューロンを含む領域を特定し、蛍光イメージングに切り替えます。

細胞内カルシウムレベルが低い場合、指示薬は結合していないままで、低い蛍光強度を示します。

ニューロンの固有の特性は自発的な活動電位を生成し、電位依存性カルシウムチャネルを開いてカルシウムの流入を可能にします。

過剰なカルシウムは指示薬に結合し、蛍光強度を増加させるコンフォメーション変化を誘発します。

発的なカルシウム活性を追跡するために、時間の経過に伴う蛍光強度を記録します。

ニューロン上の受容体に結合して継続的な活動電位を生成する神経伝達物質を高濃度で導入します。

持続的な電位依存性カルシウムチャネルの活性化は、カルシウムの流入を延長し、蛍光強度の持続的な増加を引き起こします。

原稿の指示に従って、1リットルのHEPES記録バッファー、200ミリリットルの20マイクロモルグルタミン酸記録バッファー、および200ミリリットルの10マイクロモルNBQX記録バッファーを準備します。滅菌ミリメートルのペトリ皿に3ミリリットルの記録バッファーを入れます。

感染した培養物の入ったペトリ皿をインキュベーターから取り出し、先端の細い鉗子で1つのカバーガラスの端を慎重につかみ、記録バッファーで皿に移します。残りのカバーガラスを培地に入れて摂氏37度のインキュベーターに戻し、記録バッファーを含む皿を共焦点顕微鏡に輸送します。

イメージングソフトウェアを起動します。初期化中に、蠕動ポンプを始動し、ラインを記録バッファーに入れます。次に、流量を毎分2ミリリットルに調整します。感染したカバーガラスをペトリ皿から細い鉗子で記録槽に移します。10倍の水浸対物レンズと明視野光を使用して、焦点面を見つけ、ニューロン細胞体が高密度にある領域を探します。次に、40倍対物レンズに切り替えて、サンプルの焦点を合わせ直します。

染料リストウィンドウでAlexa Flour 488を選択して適用します。蛍光色素の露出オーバーや光退色を防ぐために、HVとレーザー出力を低く設定してください。Alexa Fluor 488チャンネルの場合、HVを500に、ゲインを1倍に、オフセットをゼロに設定します。488レーザーラインの出力を5%に設定し、ピンホールサイズを300マイクロメートルに増やし、フォーカスx2スキャンオプションを使用して、発光信号をサブ飽和レベルに最適に調整します。

その後、各チャンネルの最適な視認性が得られるように設定を調整できます。顕微鏡の設定が最適化されたら、ステージを動かして、GCaMP6f蛍光の自発的な変化を示す複数の細胞がある領域を見つけ、イメージングに必要な平面に焦点を合わせます。クリップ矩形ツールを使用して、1秒未満のフレーム間隔を実現できるサイズにイメージングフレームをクリップします。間隔ウィンドウを 1.0 の値に設定し、Num ウィンドウを 600 に設定します。

tシリーズムービーをキャプチャするには、時間オプションを選択し、XYtスキャンオプションを使用してイメージングを開始します。イメージングの進行状況バーを観察し、適切な時点でHEPES記録バッファーから20マイクロモルのグルタミン酸記録バッファーにラインを移動します。撮影が完了したら、シリーズ完了ボタンを選択し、完成したTシリーズ動画を保存します。グルタミン酸をさらに5分間灌流し続け、培養ニューロンが合計10分間グルタミン酸にさらされるようにします。

画像化するカバーガラスごとにこのプロセスを繰り返します。実験直後に神経細胞体中の微量カルシウムを見ることが可能です。楕円ツールを使用して、ニューロン体細胞の周囲に必要な数のROIを描画し、系列分析ボタンを使用してトレースを視覚化します。グルタミン酸にさらに5分間さらした後、細い鉗子でカバーガラスを浴から取り出し、すべてのイメージングが完了するまで記録バッファーと一緒にペトリ皿に戻します。