PDMSデバイスの作製と表面改質

私はケン・コッツです。マサチューセッツ総合病院に併設されたBio MAsリソースセンターでポストドクターを務めています。私の主な研究プロジェクトは、マイクロ流体構造を持つ免疫親和性キャプチャーデバイスを用いて好中球を単離することです。

私たちは、後続のゲノム解析に向けたRNA抽出のため、このデバイスを国内5か所の異なる病院で使用しています。基本的には、シリコン上にSU-8フォトレジストのマスターが形成されています。このマスターの上に2液性のエラストマーであるPDMSを流し込み、そのPDMSで型を作成します。

マスターモールドをケースから取り出し、ペトリ皿に入れます。マスターモールドは、ペトリ皿の底にテープで固定します。天秤を用いて、PDMS、硬化剤、およびベース樹脂の混合物を計量します。

硬化剤と樹脂の比率は1：10です。通常、切り出したデバイスに対しては、樹脂20〜30 gと硬化剤2〜3 gをそれぞれ量り取ります。小型のウェイボートに硬化剤と樹脂の両方を注いだ後、標準的なプラスチックフォークを使用して2つを混ぜ合わせます。

硬化剤が樹脂内に均一に分散するように、力強く混ぜ合わせ、混合物を折り畳むようにして混ぜてください。通常、2つの成分が十分に混合されているかを確認します。気泡の数を確認することで、エラストマー全体に小さな気泡が均一に分散している状態を目指します。

次に、ペトリ皿に入ったSU-8マスターの上にPDMSを注ぎます。PDMSを載せたマスターを真空ベルジャーに入れ、チャンバー内を排気して、混入した気泡を除去（脱気）します。通常、脱気プロセスには30分から1時間かかります。

脱気後、デバイスを真空チャンバーから取り出し、65～80 °Cのオーブンに入れます。これらの温度における最小硬化時間は3～6時間です。当研究室では、通常、デバイスを一晩オーブンに入れておきます。

通常、11番の外科用鋼製メスを使用します。シリコンマスターの端から約0.5 cmまで直線的に切り込みを入れ、マスターの縁に沿って切り出して大きな円盤状にします。PDMSモールドをマスターから剥がし、構造面を上にして清潔なペトリ皿に置きます。

取り出した型をペトリ皿から出し、ナイフまたはリニアレールに取り付けたナイフを用いて、切断台の上に置きます。型に含まれているデバイスを切断します。切断された各デバイスは、その後の処理のために再びペトリ皿に戻されます。

通常、デバイスを流体と接続するために、PDMSデバイスに穴を開けます。穴あけに使用するデバイスは、標準的な3 mmシリンジです。3 mmシリンジの先端には、鈍端のステンレス製針が装着されています。

ステンレス製針の中には、針の内径に適合するワイヤーが入っています。このワイヤーはシリンジのプランジャーに接続されています。プランジャーを後ろに引き、針を後退させることで、PDMSに穴を開けるか、プラグ状に切り出すことができます。PDMSデバイスを裏返し、プランジャーを押して取り出します。

パンチデバイスを使用する際の秘訣は、プランジャーを可能な限り垂直に保ち、デバイス自体を一切回転させないことです。PDMSをパンチで貫通させた後は、ピンセットでPDMSデバイス全体を持ち上げて反転させ、プランジャーを押し下げてプラグを排出します。その後、ピンセットでプラグをつかんで廃棄します。

次に、プランジャーを再び戻し、デバイスを元の向きにひっくり返して、パンチを抜き出します。すべての穴を開けるまで、この操作を繰り返します。次にボンディング工程についてですが、PDMSデバイスをガラススライドにボンディングします。

本デバイスでは、PDMSをガラススライドに不可逆的に接合、または共有結合させます。これは、PDMSとガラススライドをプラズマアッシャーに入れ、反応性酸素プラズマにさらすことで行われます。具体的な手順は、PDMSデバイスをプラズマアッシャーのトレイに配置することから始まります。

デバイスの機能面を上に向けた状態で、標準的なガラス製顕微鏡スライドを任意に使用できます。本デバイスには、少し大きめの1.5インチの顕微鏡スライドを使用しています。これらはパッケージから取り出してそのまま使用可能です。

ピラニア溶液での処理を推奨します。これにより、ガラススライドの表面に付着している可能性のある有機汚染物質を除去できます。デバイスとガラススライドをプラズマアッシャー用のトレイの上に配置した後、トレイをプラズマアッシャー内にスライドさせ、反応性酸素プラズマにさらします。

プラズマアッシャーのプログラム完了後、チャンバーを開き、デバイスを載せたプレートをベンチトップに取り出します。ピンセットを用いて、接合面に指が触れないように注意しながら、PDMSデバイスを慎重に持ち上げます。接合面をガラススライドの上に向け、PDMSとガラススライドの間に気泡が入っていないことを確認します。

ガラスに接合したPDMSデバイスをホットプレート上に置き、65～75 °Cで10分間加熱して、化学的結合を強化させます。このセクションでは、クリーンルームでの接合後、PDMSとガラスの表面を化学的に修飾します。これにより、表面に反応性のあるOH基を持つPDMS表面が得られます。この反応性表面は親水性であり、最終的にはPDMSの内部へと拡散します。

表面化学処理はプラズマ処理直後に行うのが最適であるため、5%のtrimethylcapto溶液を使用します。これはtrimethoxy-propyl-trimethylcaptoの5%体積溶液です。基本的に、これを入口から注入し、気泡が入らないようにデバイス内を完全に満たします。

気泡がある場合は、ピンセットで取り除きます。スランを注入した後、室温で15〜30分間静置します。通常は、反応開始10分後に2回目のスランを注入します。

シラン化反応が約30分間経過した後、すべてのデバイスを純エタノール3～4デバイス分でフラッシングします。排出された過剰分は、ケムワイプで拭き取ります。デバイスの洗浄後、デバイスを取り出して100 °Cに設定したホットプレートの上に置き、内部のエタノールを蒸発させます。これにより、シラン化表面のキュア（硬化）が促進されます。

デバイスが乾燥したら、デシケーター内で数ヶ月間保存するか、あるいはすぐに次のステップに進むことができます。デバイスのキュアリング後、ガラス面とPDMS面の両方にシランコーティングが施された状態になります。このシランはチオール基を持つキャプトシランであり、ヘテロ二機能性架橋剤であるGMBSと反応します。

これは純エタノールで希釈されています。水と反応するため、水系条件にさらされないよう注意する必要があります。これをデバイスに注入し、ここで行っているようにピンセットで気泡を除去して、すべての表面にこの分子を完全に密着させます。

カバーをかけ、30分間反応させます。GMBSを30分間反応させた後、デバイス内のエタノールの痕跡を取り除くため、脱イオン水でデバイスを洗浄します。その後、ビオチン結合タンパク質であるNeutrAvidinを流します。

次に、neutravainを10 micrograms/mLの濃度に予備希釈します。誤ってデバイス内に空気が注入された場合は、エタノールでデバイスを再度フラッシュして、すべての空気を効果的に除去する必要があります。エタノールはデバイス表面をより良く濡らすため、誤って混入した気泡を除去することが可能になります。イオン水でフラッシュした後、通常は希釈したneutravain溶液をデバイス容量の2〜4倍量で満たします。

Nutt travainは、Nutt travain上の任意の一次手段を介して表面に固定化されたGMBSと反応します。このプロセスは室温で1時間で行うことができます。通常、私はデバイスを4 °Cのコールドルームに一晩置きます。

ただし、抗体を添加する前に、溶液中で未結合のあらゆるAdenを洗い流す必要があります。これは、PBSで希釈した1% BSA溶液を流すことで行います。これらのチップは後続のゲノム解析に使用されるため、使用するすべての溶液はRNAフリーのものを使用します。

通常、デバイスを1% BSA溶液で4〜5倍量分フラッシュします。その後、抗体を添加します。本実験で使用する抗体はCD 66 Bであり、全血中の顆粒球に特異的な抗体です。

抗体の濃度は10～25 µg/mLの範囲で使用し、これを注入します。各デバイスに200 µLの抗体を注入します。100 µLずつ2回に分け、デバイスの各ポートに1回ずつ注入してください。

通常、一方のポートに100 µLを注入し、30分間待機した後、反対側のポートにさらに100 µLを注入します。