マウスの子犬の脳への介在ニューロン前駆細胞の移植

麻酔をかけたレシピエントマウスの子犬から始めます。頭蓋骨が露出したままになるように、頭をテープで固定します。

解剖学的参照ラムダを使用して、ターゲット脳領域を特定します。

成熟した介在ニューロンに分化できる介在ニューロン前駆細胞の懸濁液をロードしたターゲット領域にマイクロピペットを配置します。

これらの前駆細胞は、レシピエントと同じ発達段階にあるドナーの子犬の皮質、線条体、または海馬に由来します。

懸濁液を脳に注入して、前駆体を起源領域に送達するホモトピー移植、または異なる脳領域に導入するヘテロトピー移植のいずれかを行います。

逆流を防ぐために、マイクロピペットを引っ込める前に懸濁液を拡散させてください。

子犬を回復のために加温パッドに移します。

レシピエント子犬の脳内のドナー前駆体の生存と成熟を評価できるようになりました。

先端の細いマイクロピペットに鉱物油をロードします。マイクロピペットをナノリットルのインジェクターに取り付け、ナノリットルの注入装置を磁気ベースに取り付けられたマニピュレーターに固定します。最初の子犬が氷上で麻酔されている間、細胞溶液を数回ピペットで移動して、均一な細胞分布を確保します。

鉱物油を排出し、ピペットに単一細胞懸濁液を完全に充填します。つま先を挟むことに反応がないことを確認したら、頭のてっぺんが比較的平らになるように、頭を粘着パテの上に乗せてペトリ皿カバーの上に子犬を置きます。

ダイヤモンドの穴の開いたラボテープで頭を覆い、皮膚が伸びるまでテープをぴんと張って引っ張り、頭がしっかりと固定され、穴からラムダが見えるようにします。固定された子犬をナノリットルのインジェクターの下に移動させ、チップがラムダの真上になるようにマイクロピペットを下げます。

マニピュレーターのx、y座標を観察し、マイクロピペットがヘッドの中外側軸と前後軸に沿って適切な座標に配置されるまで、マニピュレーターのノブを調整します。先端が皮膚に小さな凹みを作るまでマイクロピペットを下げ、Z軸マニピュレーターノブをしっかりと、しかし穏やかに回して、マイクロピペットを皮膚と頭蓋骨を通して脳に押し込みます。

先端がテントのような形をした皮膚の円錐形に囲まれるまでマイクロピペットを少し引っ込め、Z軸に沿って座標を表示します。次に、マイクロピペットを適切な実験深さまで下げ、細胞を注入します。細胞が送達されてから15秒待ってからマイクロピペットを引っ込め、必要に応じて2番目の場所で注射を繰り返します。子犬を加熱パッドの上に置き、完全に回復するまで監視してから、ホームケージに戻します。