Name: 過酸化と酸化ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: 学ぶ過酸化・酸化ヒドロキシルラジカルフットプリント法によるRNA三次構造形成の定量解析。フェントン試薬を用いて溶媒可及性を評価し、折りたたみ等温線を生成する生化学的手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、健康RO1 - GM085130の国立研究所と国立科学財団MCB0929394からの補助金によって支えられている。私たちは、彼女のもてなしのためにと彼女の研究室でフィルムに私たちを可能にするための博士マリオンシュミットに感謝。

1。フットプリントの試薬の調製<ol><li> 100mMのカコジル酸ナトリウム、1mMのEDTA、および1 M KClを含む10 ×反応バッファーを準備します。 7.4にpHを調整する。 0.2μMのアセテートフィルターデバイス（Nalgene）を使用してバッファをフィルタリングする。備考：10 ×バッファに直接ピペットのRNAをしないでください。 </li><li>表1に示すように、各反応の滴定の反応ミックスを調製する。滴定のミックスの音量（所望の濃度で1 ×バッファーとMg（II））が1 ×バッファー中のRNAの10μlを添加する前に、90μlのはずです。 </li><li> 6.63M尿素、20mMのクエン酸ナトリウム、1mMのEDTA、0.25μg/μLのtRNAは、0.025％キシレンシアノール、および0.025％ブロモフェノールブルーを含むリボヌクレアーゼT1消化バッファーを準備します。このバッファは、最大6ヶ月までは4℃で保存することができます。 </li><li>フェントン反応は250mmのFe（NH 4）2（SO 4）2、250mMのEDTA、500 mMのL -アスコルビン酸ナトリウムの新しく調製した水溶液を必要とします。濃度は、第1章で述べた0.5はそのようなラジカルや多様な二価イオンの濃度を清掃しませんカコジル酸ナトリウムなどのバッファーで平衡実験に最適です。 </li><li>過酸化（1.5.1）および酸化（1.5.2）フット反応の試薬。 <ol><li>過酸化フェントン反応は、100 mMのFe - EDTA溶液、及び50mMナトリウムL -アスコルビン酸および1.5％H 2 O 2の新しく調製した水溶液を必要とします。のFe - EDTA溶液は鉄以上のEDTAの1.1倍過剰を持っているEDTAとの混合のFe（NH 4）2（SO 4）2によって調製される。 </li><li>ちょうど酸化的開裂反応（3.4.2）を開始する前に、液のFeの2μlの（NH 4）2（SO 4）2（250 mM）を、EDTA 2.2μL（250 mM）で、62.5を組み合わせることにより、フェントン反応ミックスを作成するL -アスコルビン酸ナトリウム（500 mM）で、22.5μlの10 ×反応バッファーと0のフットプリント反応混合物（3.4.2）での最終濃度に到達するH 2 Oの135.5μL。それぞれ10 mMの、0.11 mMの、および6.61 mMの、。 </li></ol></li></ol> 2。フットプリントの実験用RNAの調製<ol><li> RNAはDNAテンプレート6または、短い50以上のヌクレオチドであれば、購入できる（統合されたDNA技術で例えば、www.idtdna.com）のin vitro転写規格により製造することができる。フットプリント実験中にRNAのサンプルの整合性を維持するために推奨実験室の清浄度の手順に従ってください。7 </li><li> in vitroで転写されたRNAの脱リン酸化8は前のRNAの5'末端の32 P標識に必要です。 RNAの10 pmolのは、末端標識kinasingによるものである。9は、解決策はホスファターゼの成功不活化後曇りになるはず。 </li><li>変性ゲル電気泳動を用いて放射標識RNAを精製する。 RNAは、0.3 M酢酸ナトリウム（pH 5.5）を使用して、続く2つのゲル抽出によって回収される。 RNAは1 mlのエタノールとそれに続くと0.5ミリリットルの水溶液を混合して沈殿させ、ドライアイス上で1分間インキュベーション。 4℃、0.5時間12500 rpmでサンプルをスピン。上清を捨て、70％エタノールでRNAペレットを洗浄。追加の遠心分離後上清を除去し、真空中でペレットを乾燥させます。 </li><li>反応チューブにRNA溶液を、エタノールおよび真空中で乾燥したRNAと沈殿物の1X Buffer.Pipet30μlの330 ULで32 P標識したRNAサンプルを溶かし、リファレンスラダー（ステップ3.5）生成するためにこのチューブを保持。 95℃で加熱することによってバッファリングされたRNA溶液を変性℃で2分間。 15分間室温に試料を冷却し、戻って溶液中にチューブの蓋に凝縮をダウンさせるクイックスピンを与える。 </li></ol> 3。フットプリント実験<ol><li>電気泳動の櫛は、分析ゲルあたりのデータポイントの上限数を決定します。我々は30も櫛を使用してください。リファレンスラダーは2井戸と未切断の制御1つを占有。 27反応チューブを準備します。最後のマグネシウム（II）concentratiアドオンは、均等に滴定の中間点の周りに、桁違いにまたがる対数スケールで等間隔する必要があります。 </li><li>これとは別に、5分間50℃RNAおよびMg（II）ソリューション℃でインキュベートする。 100μlの最終容量に達するまで1 ×バッファー中のMgの対応する量（II）の90μlのRNA溶液の10μlを混ぜる。 50℃で30分のためのソリューションをインキュベート℃に</li><li>折りたたみが行われている間ソリューションは、25℃で1時間平衡化してみましょう。 </li><li>過酸化（3.4.1）または酸化（3.4.2）ヒドロキシルラジカルフットプリンティング反応。 <ol><li> 2μlの鉄- EDTA（100 mm）の液滴を配置することにより、過酸化反応を開始、2μlのL -アスコルビン酸ナトリウム（50mMの）と2μlのH 2 O 2（1.5％）は反応の最内側で互いに分離RNA溶液と激しく混合することによりフットプリント反応を開始するを含むチューブ。 300μlの冷無水エタノールを添加することにより15秒後に反応を停止します。チューブを3-5回回し。沈殿、洗浄しステップ2.4​​のようにペレットを乾燥させます。 </li><li>作りたてのフェントン反応ミックス（1.6）の5μlを添加して酸化的ヒドロキシルラジカルfootprintingreactionを開始します。 25℃で30分間インキュベートするチューブを3-5回回して反応ミックスをクエンチするために冷無水エタノールを300μlを追加。ステップ2.4​​で示したように沈殿物は、ペレットを洗浄し、乾燥させます。 </li></ol></li><li>ステップ1.3で調製した溶液を使用して標準的な手順10によればリボヌクレアーゼT1ダイジェストのリファレンスサンプルを生成する。 </li><li> 8μlのゲルローディング色素II（Ambion社）と確認RNAでRNAペレットを溶解は、ガイガーカウンターを用いて再懸濁されている。 </li><li> 11ロードサンプルつの参照や制御を含む標準的なプロトコールに従って変性、8％ポリアクリルアミドシーケンシングゲルを準備します。 60 Wで別々のRNA断片 - 2.5時間で75 W。一晩貯蔵燐光体スクリーンに乾燥ゲルを公開。たとえば、フィルムレスオートラジオグラフィー用のイメージングシステムと蛍光面をスキャン。ストーム865（GEヘルスケア）や台風（GEヘルスケア）。お使いのコンピュータにゲルのイメージファイルを転送します。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>各ヌクレオチドのヒドロキシルラジカル反応性は、分析用ゲル電気泳動で各バンドの強度を定量することにより決定されます。ダウンロード、インストール、およびオープンSAFA、シングルバンドのフィッティングと定量化のためのオープンソースソフトウェアを使いやすい。12、13のユーザマニュアルの指示に従ってください。簡単に言えば、。ゲルのファイルとしてゲルの画像が続きます。txtファイルとしてRNA配列を読み込みます。バンドの強度を調整する、レーンを定義する、アンカーのレーンを選択し、ゲルの位置合わせを行います。ヌクレオチドのバンドの割り当ては、RNase T1の消化ラダーへの参照で発生します。バンドの積分を定量化し、潜在的に不変残基を正規化して割り当てる正規化/ colorplot機能を使用してください。 。txtファイルとして出力を保存します。 </li><li> SAFAはでを表すゲル上のレーンと行を表す列を含むスプレッドシートを出力するRNA断片に対応する個々のバンドのバンドの密度をtegrated。最初に、エンドポイントのMg（II）濃度（この例での50 mM）のプロファイルを持つマグネシウム（II）のサンプルがないから派生した保護プロファイルを比較することにより、溶媒露出度の顕著な変化を表示する保護サイトを識別する。値が小さいほど、より多くのヌクレオチドは、ヒドロキシルラジカルおよびその逆からの攻撃に対して、保護された。 </li><li>個々の又はMg（II）濃度対ヌクレオチドのグループの正規化されたバンドの積分から折りたたみ等温線を作成します。等温線は、個別にFI = L +（U - L）による飽和度にスケーリングされます• <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> fが分析されているバンド（s）の統合された密度を示す場所、LとUは、移行する下限値と上限値を表し、 <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y">飽和度は14のデータがフィット非線形lを使用しているイーストスクエア解析プログラム（我々は、Origin（OriginLabの）またはグラフパッド（グラフパッドソフトウェア社）のいずれかを使用する。）ヒルの方程式（1）に、 <img alt="式1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（1）"> K dが平衡である解離定数、[M]フォールディング反応を媒介する変数、この例のMg（II）の濃度に相当し、n Hはヒル係数である。この手順のスケール飽和度への移行は、その中間点を決定し、遷移がシグモイドであるかどうかの現象学的テストを提供します。 SAFA（図3B）によって分析し、上記のようにフィットされたシーケンシングゲル（図3A）から派生した等温線を図3Cに示されています。図3に示すように、飽和度の等温線は、スプレッドシートのスケーリングによって生成された数式の小数部を使用して最高のフィット上限値と下限値（UとL）に対してSAFAによって生成された値= 値 /（U - L） - L /（U - L）。 </li></ol> 5。代表的な結果： 図3は、P4 - P6 RNA•OHフットプリント実験から代表的な結果を示しています。ゲルイメージ（左））、バックグラウンドの切断が最小限であること（右車線を示す）、b）単一ヌクレオチドの割り当てが原因T1車線（各GでのRNase T1を切断）で明確に定義されたバンドに可能であり、c）ヒドロキシルラジカルRNAの誘導の断片化は、よくバックグラウンドを超えています。高Mg（II）へのローからの移行は、個人およびRNA立体構造の形成を示すバンドのグループの統合されたバンドの密度を下げると提携しています。シングルまたはその開裂の変化付随して"保護"と呼ばれる連続したヌクレオチドのグループ。密接にその結晶構造に見られる分子の溶媒にアクセスできない領域に対応するマグネシウム（II）の特徴•OHの保護は、P4 - P6 RNAの折りたたみを媒介。15 折られたRNA分子はC明確な構造や動的な現象と相関されていない第三の接点保護の非常に異なるエクステント（つまり、どのバンドの密度の減少の背景に近い）がある。したがって、いくつかのRNA分子は、図3に示すように、明確に定義された構造の遷移が表示され、一部はしません。バンド強度は、SAFA 12解析（図3B）により定量化し、正規化されています。出力は、•OHに対する保護の相対的な度合いを可視化する"熱"のプロットです。色の変化は、Mg（II）を添加すると、アクセシビリティの変化を説明します。それぞれ、赤または青のショーよりアクセス以上の保護されたヌクレオチドの白。シェーディングの各程度は、保護の曲線（図3C）としてプロットし、ヒルの式（1）のような結合モデルによって分析することができる数値と提携しています。保護153から155に所属する平衡解離定数は約2倍のその保護163から164の対応する値のです。 ontent"&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ヒドロキシルラジカル生成とP4 - P6 RNAの折りたたみ。 A）のFe（II）は、過酸化水素からヒドロキシルラジカルの生成を触媒する。アスコルビン酸は第一鉄に鉄（III）バックを低減します。 B）マグネシウム（II）の非存在下で、何P4 - P6三次構造は、ヒドロキシルラジカルは、すべてのアクセス可能なバックボーンの位置を貫通して切断できるように、形成されていない。 Mgの加算（II）は、溶媒のみアクセス可能なバックボーンがヒドロキシルラジカルによって切断できるように、P4 - P6の折り畳みが開始されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ヒドロキシルラジカルフットプリンティング実験に概要。 ）DephophorylationとRNAの32 P 5'末端ラベリング。 B）変性ポリアクリルアミドゲル上で32 P -ラベルされたRNAの精製。 C）RNAのバンドの切除、その後のRNA抽出、およびエタノール沈殿。 D）PrefoldingとRNAの折りたたみ。 E）新たに調製したフェントン反応混合物の添加は、ヒドロキシルラジカルを生成する。ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動により、F）のRNA断片の分離。 SAFAソフトウェアによるRNA断片のG）定量。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。過酸化フェントンフットプリント反応後のRNA断片の解析。 （A）RNAは、ヒドロキシルラジカルにさらさ​​れ、切断産物は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて解決されました。画像は、Mg（II）の濃度の増加と過酸化開裂生成物を示しています。リファレンスとコントロールレーンが表示されています。このイメージファイルは、各バンドの音量をquantitates SAFAプログラムの入力です。 （B）SAFAによって生成される"熱"プロット。 （C）SAFAからヌクレオチド数の出力に統合されたバンドの密度を関連する値のスプレッドシートは、ヒルequatiのような結合モデルによって分析され（1）。保護地域は、Mg（II）濃度の関数としてバンドの積分密度の増加に応じて選ばれた。 K dは、RNAの半分が監視されているサイトで折り畳まれる時にマグネシウム（II）濃度である。ヒル係数、n Hは 、バインディングの共同性に関する情報を提供し、この特定のサイトのフォールディングに関与するマグネシウムイオンの数の下限推定値を提供する曲線の傾きの尺度です。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表1"> 表1。異なるマグネシウム（II）濃度を含むRNAサンプルを生成するための代表的なボリューム。

<ol><li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+%22footprinting%22%3A+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%28II%29-ethylenediaminetetraacetic+acid+catalyzed+cleavage+of+RNA+and+DNA+oligonucleotides%3A+similar+reactivity+toward+single-+and+double-stranded+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms.</a> Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+higher+order+folding+of+a+catalytic+RNA+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule.</a> Science. 251, 401-407 (1991).</li>
<li>Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+folding+at+millisecond+intervals+by+synchrotron+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting.</a> Science. 279, 1940-1943 (1998).</li>
<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+footprinting%3A+a+high-resolution+method+for+mapping+protein-DNA+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts.</a> Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementing+global+measures+of+RNA+folding+with+local+reports+of+backbone+solvent+accessibility+by+time+resolved+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting.</a> Methods. 49, 142-147 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).</li>
<li>Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+endoribonuclease+activity+of+the+Tetrahymena+ribozyme%3A+enhanced+cleavage+of+certain+oligonucleotide+substrates+that+form+mismatched+ribozyme-substrate+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes.</a> Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).</li>
<li>Knapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+approaches+to+probing+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).</li>
<li>Slatko, B. E., Albright, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+gel+electrophoresis+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Denaturing gel electrophoresis for sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).</li>
<li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAFA%3A+semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> RNA. 11, 344-354 (2005).</li>
<li>Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+%2AOH+radical+footprinting+data+using+SAFA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li>
<li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li>
<li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain%3A+principles+of+RNA+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li>
<li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nucleic+acids+footprinting%3A+thermodynamic+and+kinetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li>
<li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+RNA+compaction%3A+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li>
<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+DNase+footprint+titration%3A+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ヒドロキシルラジカルフットプリントは、核酸の溶媒接触可能表面積を評価する貴重なツールです。三次構造14の定性的および定量的な形成は、イオンの種類や濃度、pH、温度、結合タンパク質または折りたたみ共同因子としてのパラメータの関数として追跡することができる。まっすぐ進むと安価なプロトコルの強力な組み合わせと単一ヌクレオチドレベルで、その結果、溶媒アクセシビリティと折り畳みの情報は、このメソッドは非常に魅力的です。伝統的に•OHフットプリント反応をH 2 O 2、我々は（図1A）"過酸化"と呼ぶプロトコルを追加使用して実行されます。我々のハイライトが自然に反応を介して過酸化水素の少量を生成するためにO 2を溶解して利用している代替手段（"酸化"）プロトコル17 <img alt="式2" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（2）">どち...

<table><tbody><tr><td>名称</td><td>メーカー</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム（注意！毒性あり）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC処理水</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素 (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

&quot;過酸化&quot;と&quot;酸化&quot;ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、rnaの構造における均衡の変化を監視する

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA分子は、生物学において重要な役割を果たしている。遺伝情報を伝達することに加えて、RNAはレギュレータ、バインダーや触媒などの特定の生物学的役割を果たすユニークな立体構造に折りたたまれることができる。三次接触の形成についての情報は、RNA分子の機能を理解することが不可欠です。ヒドロキシルラジカル（•OH）は、その高い反応性と小さなサイズのため、核酸の構造のユニークなプローブである。1フットのプローブとして使用する場合は、ヒドロキシルラジカルがDNAを1とを有するRNA 2のホスホジエステルバックボーンの溶媒接触可能表面をマッピング一塩基の解像度と同じくらい素晴らしい。ヒドロキシルラジカルフットプリンティングはDNA -タンパク質1とRNA -タンパク質複合体で、例えば、分子間の接触面内のヌクレオチドを識別するために使用することができます。平衡3と4の遷移運動は、solutiの関数としてヒドロキシルラジカルフットプリンティングを行うことによって決定することができます変数または時間で、それぞれ。フットプリントの主な特徴は、プローブにその限られた暴露（例えば、&quot;シングルヒット動力学&quot;）ポリマーの各ヌクレオチドの均一サンプリングの結果です。5 このビデオの記事では、我々は、RNAサンプルの調製およびMg（II）を介したフォールディング等温線の測定を説明するために、 テトラヒメナのリボザイムのP4 - P6のドメインを使用してください。我々は、H 2 O 2（我々はこの&quot;過酸化&quot;プロトコルと呼ぶ）と自然に溶存O 2を使用している貴重な、しかし広く知られていない、別のを（我々が呼ぶこの&quot;必要とするよく知られているヒドロキシルラジカルフットプリンティングプロトコルの使用を説明し酸化&#39;プロトコル）。データの削減、変換および分析手順の概要が提示される。

このプロトコルは、Mg（II）依存性ヒドロキシルラジカルフットプリンティングの2つの方法でRNA三次構造の形成を定量化する方法について説明します。

&quot;過酸化&quot;と&quot;酸化&quot;ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する

RNA分子は生物学において不可欠な役割を果たしています。遺伝情報を伝達することに加えて、RNAは独自の三次構造に折りたたまれ、...を遂行することができます。

本実験の全体的な目的は、ヒドロキシラジカルフットプリンティングを用いてRNA分子がどのように折り畳まれるかを明らかにすることである。これは、末端標識、ゲル精製、およびRNAのプレフォールディングを行うことで達成される。これにより、次のステップであるマグネシウム介在性の折り畳みの前に、RNAの構造的完全性が確保される。その後、フェントン試薬を混合してヒドロキシラジカルを生成させ、溶媒への接近可能性に応じてRNA主鎖を切断させる。次に、RNAの切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーによって可視化する。バンド積分値は、半自動のフットプリンティング解析ソフトウェアによって定量化されます。最終的な目的は、RNAの三次構造形成を反映したフォールディング等温線を作成することです。これは、正規化されたバンド積分値を分率飽和度にスケール変換することで達成されます。その後、等温線にヒル方程式を当てはめることができます。ヒドロキシフットプリンティングの主な利点は、安価な化学物質を用いてRNAの三次構造情報を得られる点にあります。ヒドロキシラジカルはサイズが小さく活性が高いため、溶媒に接しているヌクレオチドと埋もれているヌクレオチドを区別するための完璧なプローブとなります。この手法は、RNA構造生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、リボソームはどのように金属イオンを利用して活性形態に到達するのでしょうか。ヒドロキシルラジカルフットプリント法を用いることで、RNAの特異性と認識の基礎を理解することができます。この手法は、RNAの三次構造に関する情報を明らかにするだけでなく、RNAまたはDNA分子における正確なタンパク質結合部位を決定するためにも利用可能です。この手法における主な課題は、リボヌクレアーゼによるサンプルの分解を防ぐことと、適切な量のRNA切断を得るために鉄濃度を最適化することです。また、バンド間隔の詳細な解析は非常に困難な場合があります。この動画の主な目的は、ヒドロキシルラジカルフットプリント実験の計画段階と、その確実な遂行について視聴者の理解を深めることです。本プロトコルの開始前に、記述されたプロトコルに従い、すべてのフットプリント試薬を準備してください。このビデオに付随して、そこに概説されている通り、4つの関連するDFOを用いてRNAを合成し、末端標識することができます。変性ゲル電気泳動を用いて、放射性標識したRNAを精製してください。0.3 molar 酢酸ナトリウムを用いて2回連続でゲル抽出を行い、精製したRNAを回収します。次に、水溶液 0.5 milliliters を 1 milliliter のエタノールと混合し、RNAを沈殿させます。混合物をドライアイス上で 1 minute 間静置します。サンプルを遠心分離した後、上清を捨てます。RNAペレットを 70% ethanol で洗浄します。追加の遠心分離後に上清を除去し、ペレットを真空中で乾燥させます。次に、精製した $^{32}\text{P}$ 標識RNAサンプルを溶解します。1×反応バッファー 330 $\mu\text{L}$ が入った新しい反応チューブに、RNA溶液 30 $\mu\text{L}$ をピペットで加えます。エタノールでRNAを沈殿させ、その後、真空状態でペレットを乾燥させます。乾燥後、このペレットは、記載の手順に従ってリファレンスラダーを作成するために使用できます。残りの緩衝RNA溶液を95 °Cで2分間加熱し、変性させます。サンプルを室温で15分間冷却した後、クイックスピンを行い、凝縮物を再び溶液に戻します。フットプリント実験を開始するために、30ウェルの電気泳動ゲルを十分に満たすサンプル数となるよう、27本の反応チューブを準備します。ラダーと切断コントロールを含めた後、タイトレーションの中点付近で数桁にわたり対数スケール上で等間隔になるように、最終的なマグネシウムイオン濃度を決定します。1倍反応バッファーにおけるマグネシウムイオンの調製については、本文中で別途説明しています。RNAとマグネシウムイオン溶液を50 °Cで5分間インキュベートします。次に、10 µLのRNA溶液を、対応する量の90 µLのマグネシウムイオン溶液と混合します。最終容量を100 µLにするため、各混合物を50 °Cで30分間インキュベートします。続いて、RNAの折り畳みが起こるよう、25 °Cで1時間静置して溶液を平衡化させます。その間、ヒドロキシラジカルフットプリント反応を開始する直前に、記載のプロトコルに従ってブランク反応ミックスを調製します。RNA溶液を含む反応チューブの内側上部に、EDTA鉄、アスコルビン酸ナトリウム、および過酸化水素をそれぞれ2 µLずつ、液滴同士が触れないようにピペッティングして、ペルオキシダーゼ反応の準備をします。激しく混合してフットプリント反応を開始します。15秒後、300 µLの純粋な冷エタノールを加えて反応を停止させます。チューブを3〜5回転がします。最後に、前述の手順に従ってペレットを沈殿させ、洗浄し、乾燥させます。酸化反応の代替案として、酸化ヒドロキシル反応を行う場合は、サンプルの各チューブに、調製直後のFenton反応ミックスを5 µL添加します。酸化反応を25 °Cで30分間インキュベートします。次に、反応を停止させるために純粋な冷エタノールを300 µL加え、チューブを回転させて混ぜ合わせます。再度、沈殿させます。ペルオキシダーゼ反応または酸化反応のいずれかが完了した後、ペレットを洗浄し、乾燥させます。乾燥させたRNAペレットを8 µLのゲルローディングダイ2に溶解させます。ガイガーカウンターを用いて、$^{32}$P標識RNAが再懸濁されたことを確認します。標準的なプロトコルに従い、変性8%ポリアクリルアミドシーケンシングゲルを調製します。30ウェルのコームを用い、2つのリファレンスと切断コントロールを含むサンプルをロードします。60〜75Wで2時間30分間、RNAフラグメントを分離させます。乾燥させたゲルをストレージホスホスクリーンに一晩露光します。フィルムレス自動放射線照写用イメージングシステムを用いて、ホスホスクリーンをスキャンします。次に、ゲルの画像ファイルを解析用のコンピューターに転送します。データ解析を開始するには、シングルバンドのフィッティングおよび定量化のためのオープンソースソフトウェアであるSafaを開きます。RNA配列を.TXTファイルとして読み込み、続いてゲルの画像を.gelファイルとして読み込みます。レーンを定義し、バンド強度を調整します。次に、アンカーレーンを選択し、RNA T1消化ラダーを基準として、バンドからヌクレオチドへのゲルアライメント割り当てを行います。バンド強度を定量し、ノーマライゼーション/カラープロット機能を使用して、正規化および不変である可能性のある残基の割り当てを行います。出力をtxtファイルとして保存します。SFAは、列がゲルのレーンを、行がRNA断片に対応する個々のバンドの積分値を表すスプレッドシートを出力します。まず、マグネシウムイオンを含まないサンプルのプロテクションプロファイルと、最終濃度のマグネシウムイオンサンプルのプロファイルを比較することで、溶媒アクセシビリティに顕著な変化を示すプロテクション部位を特定する必要があります。値が低いほど、そのヌクレオチドはヒドロキシラジカルによる攻撃からより強く保護されていることを意味し、逆もまた同様です。次に、スプレッドシート形式を用いて、個々のまたはグループのヌクレオチドのバンド強度とマグネシウム・鉄濃度の関係を示す遷移曲線を作成してください。本プロトコルの本文に記載されている通り、これらの遷移を分数的飽和関数に個別にスケールさせます。最終ステップとして、データをHill式に当てはめてフィッティングしてください。この解析では、転移を分率飽和度でスケーリングして転移の中点を決定し、転移がシグモイド形状であるかどうかの現象論的な検証を行います。以下は、P4-P6 rRNAヒドロキシルラジカルフットプリント実験の代表的な結果です。等温線はSafaを用いて解析したシーケンシングゲルから導出し、解析セクションに記載の方法でフィッティングを行いました。ゲル画像から、バックグラウンドの切断は最小限であり、T laneにおいてバンドが明確に分かれているため、単一ヌクレオチドの割り当てが可能であることがわかります。ヒドロキシルラジカルによって誘導されたRNAの断片化は、バックグラウンドを十分に上回っています。低濃度のマグネシウムイオンから高濃度への移行は、個々のバンドおよびバンド群の強度の低下と選択的に相関しており、これはRNAの形成を示しています。三次構造保護とは、切断によってバンド強度が同時に変化する単一または連続したヌクレオチド群を指し、その強度はsaffer解析によって定量化および正規化されます。出力は、ヒドロキシルラジカルに対する保護度を可視化したサーマルプロットです。色の変化はマグネシウムおよび鉄の添加によるアクセシビリティの変化を示しており、白から赤への変化はアクセシビリティが高まったヌクレオチドを、白から青への変化はより保護されたヌクレオチドを示しています。各シェーディングの段階は数値に関連付けられており、これをプロテクション曲線としてプロットし、ヒル方程式などの結合モデルを用いて解析することが可能です。この例では、protection 1 5 3から1 5 5に関連付けられた平衡解離定数は、protection 1 6 3から1 6 4の対応する値の約2倍になります。このヒドロキシルラジカルフットプリント実験は、適切に実施すれば1日半で完了させることができます。この手順を行う際は、RNAのコンタミネーションを防ぐため、必ず手袋と白衣を着用してください。また、最終的な鉄濃度は実験系によって異なります。したがって、本手順に従ってフットプリント解析を行う前に、用量反応実験を実施することを推奨します。さらなる疑問を解決するために、時間分解ヒドロキシラジカルフットプリンティングなどの他の手法を用いることができます。例えば、RNA分子はその形成後、どの臨界時点でミスフォールド状態または活性化した構造に到達するのか、といった点です。この技術は、構造生物学分野の研究者が、核酸の分子内および中間的な三次相互作用を探索する道を開きました。このビデオを視聴することで、RNA分子の三次構造形成を決定する方法について十分に理解できるはずです。注意点として、手順の実施中は、手袋や保護ゴーグルの着用、およびプレキシガラス製シールドの使用など、危険物に対する予防措置を講じることを忘れないでください。

monitoring-equilibrium-changes-rna-structure-peroxidative-oxidative

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

プライマー伸長により解析し、高スループット選択2...

ハイスループットSHAPEを使用したRNA二次構造予測

ラディカルベースの​​生体模倣化学、バイオマーカー開発のために必要な建物のアップライブラリに適用されています。...

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

ここでは、RNAのDNAzyme依存性切断に関するプロトコルを提示する。これにより、RNA...

rRNA 2'-O-メチル化のDNAzyme依存性分析

ここでは、病変の高感度かつ正確な定量のための方法 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-茶道) および 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,N2-dGuo) DNA で.この方法は、曝露された A/J マウスの組織 (肺、肝臓および腎臓) における周囲微細粒子状物質 (PM2.5)...

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

インビボでタンパク質の高速光化学酸化(IV-FPOP)は、天然環境でタンパク質構造のマッピングを可能にするヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリント技術です。このプロトコルは、IV-FPOPマイクロ流体流動システムの組立とセットアップについて説明します。...

イン・ビボヒドロキシルラジカルプロテインフットプリントにおけるカエノハブディティス・エレガンスにおけるタンパク質相互作用の研究

ここでは、細胞内でのタンパク質の高速光化学酸化(IC-FPOP)と呼ぶタンパク質フットプリント技術を用いて、生細胞におけるタンパク質構造および相互作用部位を特徴付ける。...

細胞内高速光化学タンパク質による細胞タンパク質の特性分析

cDNAの速度論的架橋と解析は、生細胞におけるタンパク質-RNA相互作用のダイナミクスを高い時間分解能で調べることができる方法です。ここでは、酵母細胞の増殖、UV架橋、収穫、タンパク質精製、次世代シーケンシングライブラリ調製ステップなど、プロトコルについて詳しく説明します。...

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

タンパク質の高速光化学酸化は、タンパク質の構造特性を示す新たな手法です。異なる溶媒添加剤およびリガンドは、ヒドロキシルラジカル清掃特性を多様に有している。異なる条件でタンパク質構造を比較するために、反応で生成されたヒドロキシルラジカルのリアルタイム補償が反応条件を正常化するために必要である。...

タンパク質トポグラフィ変化の測定のためのタンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補正の実現

このプロトコルは、インラインラジカル線測定とプラズマ光源を使用して、フラッシュ酸化タンパク質のフットプリントを実行する方法を提示する。この方法は、タンパク質研究の高速光化学酸化の再現性を簡素化し、改善するために、危険なUVレーザーを置き換えます。...

レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析

MALDI−TOFを用いて、酸化されたRNAとエキソリボヌクレアーゼXrn−1との間の反応性から得られた断片を特徴付けた。本プロトコルは、RNAおよび/またはDNAを含む他のプロセスに適用できる方法論を記載する。...

MALDI−TOF質量分析法を用いた酵素分解によるRNA断片の同定

このプロトコルは、突然変異プロファイリング実験のために硫酸ジメチルでRNAを修飾するための指示を提供します。これには、2つの代替ライブラリ調製方法を使用したin vitro および in vivo...

硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

学ぶ過酸化・酸化ヒドロキシルラジカルフットプリント法によるRNA三次構造形成の定量解析。フェントン試薬を用いて溶媒可及性を評価し、折りたたみ等温線を生成する生化学的手法です。

"過酸化"と"酸化"ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する

さらに動画を探す