"過酸化"と"酸化"ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する

次の実験の全体的な目標は、ヒドロキシルラジカルフットプリントを使用してRNA分子がどのように折り畳まれるかを確認することです。これは、マグネシウム媒介フォールディングに先立ってRNAの確認完全性を確保するRNAのエンドラベリング、ゲル精製、およびプレフォールディングによって達成され、次のステップとして、フェントン試薬を混合してヒドロキシルラジカルを生成し、その後、その溶媒アクセシビリティに従ってRNA骨格を切断することができます。次に、RNA切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、オートX線撮影で可視化します。

バンド積分は、半自動フットプリント解析ソフトウェアによって定量化されます。最終的な目標は、RNAの三次構造形成を反映したフォールディング等温線を生成することです。これは、正規化されたバンド積分を分数飽和にスケーリングすることで実現されます。

その後、等温線を丘の方程式に適合させることができます。ヒドロキシフットプリントの主な利点は、安価な化学物質を使用してRNAの三次構造情報を取得できることです。これは、小さなサイズのヒドロキシラジカルの活性が高いため、溶媒アクセス可能なヌクレオチドと埋もれたヌクレオチドを区別するのに最適なプローブです。この方法は、RNA構造生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

例えば、リボソームはどのようにして金属イオンを利用して活性確認を行うのでしょうか。ヒドロキシラジカルフットプリントは、RNAの特異性と認識の基礎を理解するために使用できます。この方法は、RNAの三次構造に関する情報を明らかにするだけでなく、RNAまたはDNA分子の正確なタンパク質結合部位を決定するために使用できます。

この分析法の主な課題は、リボヌクレアーゼによるサンプルの分解を防ぎ、適切な量のRNA切断を得るために鉄濃度を最適化することです。また、バンド間隔の詳細な分析は非常に難しい場合があります。このビデオの主な利点は、視聴者がヒドロキシラジカルフットプリント実験の計画段階と成功した実行を理解するのを助けることです このプロトコルの開始前に、書かれたプロトコルに記載されているように、試薬ですべてのフットプリントを準備します。

このビデオに付随して、RNAはそこに概説されているように4つの関連し、末端ラベル付けされたDFOを生成することができます。放射性標識RNAを変性ゲルエレクトロフェレーシスを用いて精製します。精製したRNAを、0.3モルの酢酸ナトリウムを使用して2回のゲル抽出により回収します。

次に、0.5ミリリットルの水溶液を1ミリリットルのエタノールと混合してRNAを沈殿させます。ドライアイス上で混合物を1分間インキュベートします サンプルを回転させた後、仰臥位を廃棄します。RNAペレットを70%エタノールで洗浄します。

追加の遠心分離後にスーピネートを取り出し、ペレットを真空中で乾燥させます。次に、精製したP 32標識RNAサンプルを溶解します。330マイクロリットルの1回反応バッファーピペットで、新しい反応チューブに30マイクロリットルのRNA溶液を入れます。

このRNAをエタノールで沈殿させ、乾燥させたら真空中で乾燥させると、このペレットは、95°Cで2分間加熱することにより、残りの緩衝RNA溶液を自然にする手順書に記載の参照ラダーを生成するために使用することができる。サンプルを室温で15分間呼び出し、その後、すばやく回転させて凝縮液を溶液に戻します。フットプリント実験を開始するには、30ウェル電気泳動ゲルを満たすのに十分なサンプルを27本の反応チューブにセットします。

はしごと劈開制御を含めた後、最終的なマグネシウム鉄濃度を決定して、滴定中点の周りの数桁にわたって対数スケールで等間隔になるように、マグネシウムイオンの1回の反応バッファーの調製は、テキストで別々に説明されています。RNAとマグネシウムイオン溶液を摂氏50度で5分間インキュベートします。次に、10マイクロリットルのRNA溶液を対応する量のマグネシウム鉄溶液90マイクロリットルと混合します。

最終容量を100マイクロリットルにするには、各混合物を50°Cで30分間インキュベートします。その後、溶液を摂氏25度で1時間平衡化させ、RNAフォールディングが起こるようにします。一方、反応中のヒドロキシルラジカルフットプリントを開始する直前に、書面によるプロトコルに記載されているようにファントム反応混合物を調製します。

RNA溶液を含む反応チューブの内側の上部に、鉄EDTA、アスコルビン酸ナトリウム、過酸化水素の液滴をそれぞれ2マイクロリットルの液滴をピペッティングして、液滴が接触しないようにして過酸化反応を準備します。激しく混合することにより、フットプリント反応を開始します。15秒後、300マイクロリットルの純粋な冷たいエタノールを加えて反応を停止します。

チューブを3〜5回回します。最後に、ペレットを沈殿させ、洗浄し、乾燥させるとともに、酸化反応の代替として先に行ったように、新たに調製したフェントン反応ミックスの5マイクロリットルをサンプルに添加することによって酸化ヒドロキシル反応を行う。酸化反応を摂氏25度で30分間インキュベートします。

次に、300マイクロリットルの純粋な冷たいエタノールを加えて反応を急冷し、チューブを回して混合します。もう一度、沈殿します。ペレットを洗浄し、酸化反応または酸化反応のいずれかが完了したら

乾燥させたRNAペレットを8マイクロリットルのゲルローディング色素2に溶解します。P 32標識RNAが再懸濁されていることを確認するには、geerカウンターを使用して、標準的なプロトコルに従って変性8%ポリアクリルアミドシーケンシングゲルを調製します。30ウェルコームを使用して、2つのリファレンスと劈開コントロールを含むサンプルをロードします。

RNAフラグメントを60〜75ワットで2時間半分離します。乾燥させたゲルを保存用リン酸化スクリーンに一晩さらします。イメージングシステムでリン酸化スクリーンをスキャンし、フィルムレス自動X線撮影を行います。

次に、ゲル画像ファイルをコンピューターに転送して分析します。データ解析を開始するには、シングルバンドフィッティングと定量化のためのSafaとオープンソースソフトウェアを開きます。RNA配列をドットTXTファイルとして読み込み、続いてゲルピクチャーをドットゲルファイルとして読み込みます。

レーンを定義し、バンドの強度を調整します。次に、アンカーレーンを選択し、RNAの1つの消化ラダーを参照して発生するヌクレオチドへのバンドのゲルアラインメント割り当てを実行します。バンド強度を定量化し、正規化スラッシュ カラー プロット機能を使用して、潜在的に不変な残基を正規化して割り当てます。

出力をtxtファイルとして保存します。SFAは、ゲル上のレーンを表す列と、RNAフラグメントに対応する個々のバンド積分を表す行を含むスプレッドシートを出力します。まず、マグネシウムイオンを含まないサンプルから得られる保護プロファイルとエンドポイントのマグネシウムイオン濃度のプロファイルを比較することにより、溶媒アクセシビリティに顕著な変化を示す保護部位を特定する必要があります。

値が低いほど、ヌクレオチドはヒドロキシルラジカルからの攻撃に対してより保護され、その逆も同様です。次に、スプレッドシート形式を使用して、バンド、ヌクレオチドの個別またはグループの強度とマグネシウム鉄濃度の遷移曲線を作成し、このプロトコルのテキスト部分で説明されているように、これらの遷移を個別にフラクショナル飽和関数にスケーリングします。最後のステップとして、データを丘の方程式に当てはめます。

この分析では、遷移を分数飽和にスケーリングし、遷移の中点を決定し、遷移がシグモイドで示されているかどうかの現象論的テストを提供します。以下は、P 4 P 6 RRNAヒドロキシルラジカルフットプリント実験の代表的な結果です。等温線は、Safaで分析したシーケンシングゲルから導き出され、分析セクションで説明されているように適合しました。

ゲル画像は、バックグラウンドの切断が最小限であり、T oneレーンの明確に定義されたバンドにより単一ヌクレオチドの割り当てが可能であることを示しています。RNAのヒドロキシラジカル誘導分裂は、バックグラウンドをはるかに上回っています。低マグネシウムイオンから高マグネシウムイオンへの遷移は、RNAの形成を示す個々のバンドおよびバンドのグループの強度の低下と選択的に関連しています。

三次構造保護とは、隣接したヌクレオチドの単一またはグループを指し、その切断に伴ってバンド強度が定量化され、サファー分析によって正規化されます。出力は、ヒドロキシルラジカルに対する保護の程度を視覚化した熱プロットです。色の変化は、マグネシウム鉄が添加されたときのアクセシビリティの変化を表しており、白から赤はよりアクセスしやすいヌクレオチドを示し、白から青はより保護されたヌクレオチドを示します。

シェーディングの各度合いは数値に関連付けられており、保護曲線としてプロットし、丘の方程式などのバインディングモデルで分析できます。この例では、保護 1 5 3 から 1 5 5 までの affiliated の平衡解離定数は、保護 1 6 3 から 1 6 4 の対応する値の約 2 倍です。このヒドロキシラジカルフットプリント実験は、適切に実施すれば1日半で行うことができます。

この手順を試みるときは、RNAの汚染を避けるために、手袋と白衣を着用することを忘れないでください。また、最終的な鉄濃度は実験系によって異なります。したがって、この手順に従ってフットプリントを作成する前に、線量反応実験を実施することをお勧めします。

時間分解ヒドロキシラジカルフットプリントなどの他の方法は、追加の質問に答えるために実行できます。例えば、RNA分子は、その開発後、どの重要な時点でミスフォールドまたはアクティブ確認に達するのでしょうか?この技術は、構造生物学の分野の研究者が核酸の分子三次間相互作用および中間分子三次相互作用を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、RNA分子の三次構造形成を決定する方法についてよく理解できるはずです。この手順を実行する際には、手袋や保護ゴーグルの着用、プレキシガラスシールドの使用など、Caateとリンのステージ2が危険な予防措置であることを忘れないでください。