高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

本手順の目的は、固相ペプチド合成および、ペプチドが高度に秩序化されたナノシートへと水中で自己組織化するための、簡便かつ効率的な方法を記述することです。構造的にポリペプチドに類似したペプチドは、側鎖がα炭素ではなく窒素に結合している置換グリシンポリマーです。このプロセスは、その他のサブモノマー法を用いて特定のペプチド配列を合成することから始まります。

サブモノマー法は、各モノマーを順次鎖に導入する2つの単純な化学的ステップで構成されています。まず、固体支持体に結合したアミンをブロモアセチル化します。次に、臭化物を一次アミンで置換します。

これらの工程を、目的の鎖長に達するまで繰り返します。鎖の伸長後、ペプチドを固体支持体から切り離し、得られた粗ペプチドオイルをHPLCで精製し、特性評価を行うことで、ペプチドのナノシートへの自己組織化を開始させます。ペプチドの希釈水性緩衝液をガラスバイアルに調製し、穏やかに混合します。これが最終ステップとなります。

ナノシートを顕微鏡下で観察します。その結果、2つの単純な化学的ステップを反復させることで、自発的にナノシートへと自己組織化する配列特異的なポリマーを合成できることが示されました。ペプチドは、タンパク質と従来のポリマーの中間的な特性を持つ、バイオインスパイアされた新しいクラスのポリマーです。

ペプチドは、従来のポリマーのような堅牢性と合成上の汎用性を備えている一方で、タンパク質やDNAのように高度な調整が可能であり、配列特異性も持っています。そのため、生物活性薬の同定や人工タンパク質の設計など、生物医学や材料科学における重要な課題を解決するための高度な材料として台頭しています。ペプチドの主な利点には、精密な配列制御、極めて多様なビルディングブロックの利用可能性、効率的な合成、およびプロテアーゼ安定性が挙げられます。ここでは、基本的な設備と市販の試薬を用いた一般的なペプチドの手動合成法について概説し、ほとんどの研究室でペプチドを容易に合成できるようにします。

合成手順を視覚的に実演することは非常に重要であり、固相合成の分野に入る人々にとって貴重な参照資料となります。ここでは、両親媒性36量ペプチドの精製とキャラクタリゼーション、および高度に秩序化されたナノシートへの自己組織化について初めて記述します。まず、書面によるプロトコルに従って実験装置のセットアップを行い、本プロトコルを開始してください。

視認性を高めるため、以下の手順は使い捨てのポリプロピレン製フリットカートリッジではなく、ガラス製反応容器を用いて行います。100 mgのR amide resinをフリット付き反応容器にセットした後、2 mLのジメチルホルムアミド（DMF）を加えて樹脂を膨潤させ、バブリングにより10分間撹拌します。その後、真空吸引で溶液を排出し、膨潤した樹脂を単離します。

次に、Fmoc基を脱保護するために、DMFで調製した20%フルメチルピリジンを1 mL加えます。2分間撹拌し、ろ液を捨てます。この工程を12分間繰り返した後、2 mLのDMFを加えて15秒間撹拌し、ろ液を捨てることで樹脂を洗浄します。

ブロモアセチル化と置換ステップを含む最初のサブモノマーサイクルで、ペプチド鎖の伸長を開始します。ブロモアセチル化では、DMFに溶解した0.6 molarのブロモ酢酸1 mLと、ジイソプロピルカルバミド86 µLを添加します。30分間撹拌した後、液を排出し、2 mLのDMFで洗浄します。

次に、1〜2 Mのアミン1 mLを末端メチルピロゲノンに添加して置換反応を行い、30〜120分間インキュベートします。インキュベート後、液を排出し、2 mLのDMFで洗浄します。再びサブモノマーサイクルを繰り返して、ペプチド鎖を伸長させます。最後の置換反応が完了した後、2 mLのDMFで洗浄します。

次に、dioraメタン洗浄キャップで密閉し、切断工程まで反応容器を保存します。切断を開始するには、フード内で適切な個人用保護具を着用し、乾燥した樹脂すべてを20 milliliterのシンチレーションガラスバイアルに移します。4 millilitersのトリフルオロ酢酸（TFA切断カクテル）をシンチレーションガラスバイアルに加え、キャップを閉めます。室温で10分から2時間、激しく撹拌します。

あるいは、回転振盪機を使用して溶液を混合します。使い捨てのポリプロピレン製フリットカートリッジを用いて樹脂をろ過し、あらかじめ重量を測定した新しい20 milliliterのシンチレーションガラスバイアルにTFA切断溶液を回収します。次に、1 milliliterの新しい切断カクテルを加えて樹脂を洗浄し、残存しているペプチドを回収します。

この操作を繰り返し、2回洗浄します。窒素気流を緩やかに吹き付けるか、バイオチャージV 10エバポレーターを使用してTFAを留去します。得られた粗オイルを、アセトニトリルと水の1:1混合液6 mLに溶解させます。

その後、サンプルを凍結および凍結乾燥させます。この工程を、2回目の凍結乾燥の後にもう一度繰り返してください。粗生成物の重量を記録し、乾燥粉末として-20 °Cで保存し、修飾分析用HPLCおよび/またはエレクトロスプレーLCMSを用いて分析します。

粗生成物の純度および目的の分子量の有無は、本文に記載された手順に従って決定できます。その後、記述された手順に従い、逆相分取HPLCを用いて粗ペプチド混合物を精製することが可能です。本セクションでは、単一鎖配列特異的な両親媒性36 meペプチドからシートを形成するためのプロトコルについて説明します。

ペプチド鎖の合成、精製、および凍結乾燥後、得られた白色粉末をDMSOに溶解し、2 mMのストック溶液を作成します。次に、20 µMのペプチド溶液を調製するために、Dr.Glassファイルを用意します。まず、445 µLのMilli-Q水と50 µLの10xシート形成バッファーを加えます。

バイアルをボルテックスして混合します。次に、2 mMのペプチドストック溶液を5 µL加え、緩やかに膨潤させます。得られた溶液シートは、希釈したペプチド水溶液を緩やかに撹拌することで形成されます。

キャップ付きのガラスバイアルを水平位置から垂直位置へとゆっくりと傾けます。これによりシートが緩やかに揺さぶられ、シートが得られます。ただし、この方法で得られるシートは小さくなる傾向があり、高品質なシートを多く得るための直線的なエッジが少なくなります。

チューブ回転機またはナノシートの蛍光染色用にカスタマイズしたロッカーを使用し、ガラスバイアルを水平軸を中心に1日間ゆっくりと回転させます。ナノシート溶液100 µLに100 µM Nile redを1 µL加え、最終濃度を1 µMにします。Nile redは環境感受性染料であり、疎水性環境に局在すると蛍光強度が上昇します。次に、1%アロス溶液を熱水で調製し、プラスチック製ペトリ皿に注ぎます。

アガロース溶液の厚さが約1/8インチになるようにし、溶液を平らな表面で静置して冷却させます。アガロースが固まった後、スパチュラを用いて1 cm × 1 cmの正方形に切り出します。次に、切り出した正方形をガラススライド上に移し、同一平面上に並べます。アガロースの断片の上に、シート溶液を1 µL滴下します。

2分後、arosが緩衝液を吸収し、シートが表面に残ります。15分以内にシートをイメージングしてください。あるいは、シートと溶液をイメージングする場合、ガラススライド上の直径20 mm、厚さ0.12 mmのガスケット内に15 µLをロードしてください。

サンプルをカバーグラスで覆い、数日以内にイメージングを行い、ナノシートのSEM観察を実施します。まず、ナノシートの吸着を促進するためにシリコンチップをプラズマエッチングします。次に、プラズマ処理したシリコン基板上にペプチドシート溶液を20 µL滴下し、3分間静置します。その後、キムワイプの先端で余剰な溶液を取り除き、表面に20 µLの水を滴下して、再び余剰な溶液を吸い取ることで、バッファーと塩を除去します。

あるいは、緩衝液と塩を除去するために、ペプチドシート溶液を水に対して透析します。この場合、透析後のシート溶液 20 µL をプラズマ処理したシリコン基板上に滴下し、自然乾燥させます。プラズマ処理したシリコン基板上でシート溶液が乾燥した後、1 kV から 5 kV のビームエネルギーでインレンズ検出器を用いた SEM によるシートの撮像が可能です。

高度に秩序化された二次元ナノシートへと折りたたまれる、配列特異的な36 meブロック電荷ペプチドの合成、キャラクタリゼーション、および精製を行った。この36 meブロック電荷ペプチドの合成には、エチレンジアミン、フェネチルアミン、およびt-ブチル-β-アラニンを用いた。合成後、粗ペプチドを95%水系TFAを用いて樹脂から切り離した。

TFA溶液を回収し、蒸発させた後、粗製の36 me ブロック電荷ペプチドを逆相HPLCで精製しました。続いて、精製したブロック電荷ペプチドの質量を MALDI で確認しました。

観測された質量 4981.2 は、計算上の質量 4981.74 とよく一致しています。凍結乾燥粉末を DMSO に溶解して 2 mM のストックソリューションを作成し、4 °C で保存しました。上述のプロトコルに従ってシートを調製し、蛍光光学顕微鏡で撮像しました。

最大300 µmまでの特徴サイズを持つ多様な形状が観察され、特に直線的なエッジが顕著に見られます。また、SEMを用いてシートを撮像したところ、同様に顕著な直線的エッジが明らかになりました。このビデオでは、ペプチドの固相合成および、ペプチドの水系自己組織化によるナノシート形成のための、簡便かつ効率的なプロトコルについて説明します。

文字通り数百種類のアミノ酸ビルディングブロックが容易に入手可能であり、本プロトコルで使用できるため、ポリペプチドで到達可能な設計空間は実質的に無限です。ペプチドは、合成の柔軟性、堅牢性、および秩序性の高さから、生物医学およびナノサイエンス研究において有望な材料となります。特に原子レベルにおいて、ナノシートは2次元ディスプレイ・スキャフォールド、膜模倣体、バイオセンサー、タンパク質模倣体、およびデバイス作製の潜在的なプラットフォームとして機能します。

トリオール、酢酸、ブロモ酢酸などの腐食性試薬を取り扱うことは非常に危険です。怪我を防ぐため、すべての反応はドラフトチャンバー内で行い、適切な個人用保護具を着用してください。