高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

この手順の全体的な目標は、固相ペプチド合成とペプチドの水系自己組織化による高秩序ナノシートへのシンプルで効率的な方法を説明することです。ポリペプチドと構造的に類似しているペプチドは、側鎖がアルファ炭素ではなく窒素に結合している置換グリシンポリマー中にあります。このプロセスは、他のサブモノマー法を介して特定のペプチド配列を合成することから始まります。

サブモノマー法は、各モノマーを鎖に順次導入する2つの単純な化学ステップで構成されています。まず、固体支持体に結合したアミンにブロモアセチル化します。次に、臭化物は第一級アミンで置換されます。

これらのステップは、所望の鎖長が達成されるまで繰り返される。鎖伸長後、ペプチドは固体支持体から切断され、得られた粗ペプチド油はHPLCによって精製され、ペプチドのナノシートへの自己組織化を開始するように特徴付けられる。ペプチドの希薄な緩衝液をガラスバイアルに調製し、穏やかに混合します。最後のステップとして。

ナノシートを顕微鏡で観察します。この結果は、2つの単純な化学ステップの反復サイクルにより、ナノシートに自発的に自己組織化する配列特異的なポリマーを生成できることを示しています。ペプチドは、タンパク質と従来のポリマーの特性の中間の特性を持つ、新しいクラスの生体模倣ポリマーです。

従来のポリマーと同様に堅牢で合成的に汎用性が高いだけでなく、タンパク質やDNAペプチドのように高度に調整可能で配列特異的な材料として、生物活性薬物の同定や人工タンパク質の設計など、生物医学や材料科学の主要な問題に対処するための先端材料として浮上しています。ペプチドの主な利点には、正確な配列制御、非常に多様なビルディングブロックの利用可能性、効率的な合成、プロテアーゼの安定性などがあります。基本的な装置と市販の試薬を含む一般的なペプチド手動合成法の概要を説明し、ほとんどのラボでペプチドを簡単に合成できるようにしています。

合成ステップの視覚的なデモンストレーションは重要であり、固相合成の分野に参入する個人にとって貴重な参考資料となります。ここでは初めて、両親媒性ペプチド36 merの精製と特性評価、および高度に秩序化されたナノシートへの自己組織化について説明しました。このプロトコルは、書面によるプロトコルに記載されている実験装置のセットアップから開始します。

次の手順は、透明化のために使い捨てのポリプロピレンフリットカートリッジの代わりにガラス反応容器で実行されます。フリット反応容器に100ミリグラムのRアミド樹脂をセットした後、2ミリリットルのジメチルフォームアミドまたはDMFアジテートを10分間バブリングしてレジンを膨潤させます。その後、溶液を真空で排出し、膨潤した樹脂を分離します。

次に、DMF中に20%フルメチルピリジンを1ミリリットル追加して、FM O基を保護します。2分間撹拌し、水気を切ります。このプロセスを12分間繰り返してから、2ミリリットルのDMFを加えて15秒間攪拌し、水気を切ることで樹脂をすすぎます。

ペプチド鎖の増殖は、ブロモアセチル化と置換ステップを含む最初のサブモノマーサイクルで開始します。ブロモアセチル化のためには、DMF中の0.6モルブロモ酢酸1ミリリットルとジイソプロピルカルボダニ86マイクロリットルを添加する。30分間攪拌した後、水気を切り、2ミリリットルのDMFですすいでください。

次に、インキュベーション後30〜120分間インキュベートする末端のメチルパイロジェノンに1〜2モルアミンの1ミリリットルを加えて置換を行い、2ミリリットルのDMFで排出およびすすぎます。再び、サブモノマーサイクルを繰り返すことにより、ペプチド鎖を成長させ続けます。最終的な変位が完了したら、2ミリリットルのDMFですすいでください。

これに続いて、ジオラメタン洗浄キャップを装着し、反応容器を切断するまで保管します。切断を開始するには、乾燥した樹脂をすべてフード内で作動する20ミリリットルのシンチレーションガラスバイアルに移し、適切な個人用保護具を使用し、4ミリリットルのトリフルオロ酢酸またはTFA切断カクテルをシンチレーションガラスバイアルとキャップに追加します。室温で10分から2時間しっかりと攪拌します。

または、ロータリーシェーカーを使用して溶液を混合します。TFA劈開液を回収するには、ディスポーザブルポリプロピレン製フリットカートリッジでレジンを濾過し、あらかじめ秤量した新しい20ミリリットルシンチレーションガラスバイアルに入れます。次に、1ミリリットルの新鮮な切断カクテルを追加して樹脂をすすぎ、残留ペプチドを収集します。

これを繰り返し、2回すすぎます。窒素を穏やかに吹き込むか、ビオットチャージを使用してTFAを蒸発させます。V 10エバポレーターレッドは、原油を1対1のアセトニトリルと水の6ミリリットルに溶解します。

次に、サンプルを凍結して凍結乾燥します。このプロセスは、2回目の凍結乾燥後にもう一度繰り返す必要があります。.粗製品店の重量を、カビの生えた分析用HPLCやエレクトロスプレーLCMSの組み合わせにより、マイナス20°Cの乾燥粉末として記録します。

粗製品の純度と目的の分子量が存在するかどうかは、本文で概説されている手順に従って決定できます。その後、粗ペプチド混合物は、書かれた手順に従って逆相調製HPLCで精製できます。このセクションでは、一本鎖配列特異的両親媒性36 meペプチドからシートを形成するプロトコールについて説明します。

ペプチド鎖を合成、精製、凍結乾燥した後、得られた白色粉末をDMSOに溶解して、2ミリモルのストック溶液を作ります。次に、20マイクロモルのペプチド溶液を調製するための1つのDr.Glassファイルを入手します。まず、445マイクロリットルのミリQ水と50マイクロリットルの10xシート形成バッファーを追加します。

バイアルをボルテックスして混合します。次に、2ミリモルのペプチドストック溶液を5マイクロリットル加え、穏やかに膨潤させます。得られた溶液シートは、希薄なペプチド水溶液を穏やかに攪拌することによって形成されます。

キャップ付きのガラスバイアルを水平位置から直立位置までゆっくりと傾けます。シートを穏やかに振ると、シートも得られます。ただし、多くの高品質シートでは、シートは小さく、直線エッジが少なくなる傾向があります。

ナノシートの蛍光染色用のチューブローテーターまたはカスタマイズされたロッカーを使用して、ガラスバイアルを水平軸を中心に1日ゆっくりと回転させ、100マイクロモルのナイルレッドの1マイクロリットルをナノシート溶液の100マイクロリットルに加えて、1マイクロモルのナイルの最終濃度を得る。レッドは環境に敏感な色素であり、疎水性環境に局在すると蛍光強度が増加します。次に、お湯で1%アロス溶液を作り、プラスチック製のシャーレに注ぎます。

アロス溶液の厚さが約8分の1インチであることを確認し、溶液を平らな面で邪魔されずに冷却します。アロスが固まったら、へらを使って1センチ×1センチ四方に切ります。次に、カットした正方形をスライドガラスに移して、同じ平面にシートを集め、1マイクロリットルのシート溶液をアロスのピースに

2分後、arosはシートを表面に残してバッファーを吸収するはずです。15分以内にシートをイメージ化します。あるいは、スライドガラス上の直径20ミリメートルの0.12ミリメートルガスケットの内側に15マイクロリットルをロードするイメージシートと溶液に

数日以内にサンプルをカバースリップと画像で覆い、ナノシートのSEMを行います。まず、ナノシートの吸収を助けるためのプラズマエッチングシリコンチップ。次に、プラズマ処理されたシリコン基板上に20マイクロリットルのペプチドシート溶液を滴下し、溶液を3分後に放置し、Kimワイプピペットの先端で20マイクロリットルの水を表面に含ませて余分な溶液を除去し、再び余分な溶液を吸い上げて緩衝液と塩分を除去します。

あるいは、ペプチドシート溶液を水に対して透析して、緩衝液と塩分を除去します。この場合、透析シート溶液の20マイクロリットルをプラズマ処理されたシリコン基板上に滴下し、風乾させることができる。プラズマ処理されたシリコン基板上でシート溶液が乾燥した後、シートはレンズ内検出器を使用してSEMで1キロボルトから5キロボルトのビームエネルギーでイメージングできます。

高秩序な2次元ナノシートに折り畳まれる配列特異的な36 meブロックチャージペプチドの合成特性評価と精製を行った。36 meブロックチャージペプチドの合成を使用したアミンは、エチレンジアミンをフェネチル、アミン、およびtブチルベータアラニンにボックします。合成後、粗ペプチドを95%水性TFAで樹脂から切断しました。

TFA溶液が回収され、蒸発した後。粗36 meブロックチャージペプチドを逆相HPLCで精製しました。次に、精製されたブロックチャージペプチドの質量をカビの生えたものによって確認しました。

観測された質量 4981.2 は、計算された質量 4981.74 とほぼ一致しています。凍結乾燥粉末をDMSOに溶解して2ミリモルの原液を作製し、摂氏4度で保存した。シートは、前述のプロトコルおよび蛍光光学顕微鏡による画像によって調製した。

最大300ミクロンの範囲の特徴サイズのさまざまな形状が観察され、特にまっすぐなエッジが目立ちます。SEMは、シートを同様に画像化するためにも使用され、顕著な直線エッジが明らかになりました。このビデオでは、ペプチドの固体表面合成とペプチドのナノシートへの水性自己組織化のための簡単で効率的なプロトコールについて説明します。

文字通り数百のam平均ビルディングブロックが容易に利用可能であり、このプロトコルで使用できるため、ポリペプチドでアクセス可能な設計空間は実質的に無限です。ペプチドは、その合成の柔軟性、堅牢性、および秩序性により、生物医学およびナノサイエンス研究に有望な材料です。特に原子レベルでは、ナノシートは、2次元ディスプレイ足場、膜模倣、生物学的センサー、タンパク質模倣、およびデバイス製造のための潜在的なプラットフォームとして機能します。

トリオール、酢酸、ブロモ酢酸などの腐食性試薬の取り扱いは、怪我を防ぎ、すべての反応をドラフト内で行い、適切な個人用保護具を着用するために非常に危険です。