1, 2-ジチオランの合成とキャラクタリゼーション自己組織化ペプチド

1, 2-ジチオランの合成のためのプロトコルは、ペプチドやペプチドの自己集合結果超分子構造の評価に変更されました。

超分子構造の機能性を高めるための構造が成長するにつれて、1,2-ジチオラン基を自己組織化ペプチドに組み込むこの方法は、超分子表面での反応性に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1,2-ジチオラン前駆体分子の結合と脱保護が、最終修飾ペプチドの精製ステップが1回のみで樹脂上で行われることです。アセンブリが最終的な超分子構造に成熟するのにかかる時間は異なるため、超分子アセンブリの特性評価方法と結果を視覚的に示すことが重要です。

ジチオラン前駆体を合成するには、まず、1グラムの3-ブロモ-2-プロピオン酸を約4ミリリットルの1モル水酸化ナトリウムに溶解し、50ミリリットルの丸底反応フラスコで摂氏55度で攪拌しながら溶解します。すべての試薬を溶液に懸濁したら、反応フラスコをセプタムで密封し、フラスコを窒素雰囲気下に置く。次に、1.49グラムのチオ酢酸カリウムと3ミリリットルの2モル硫酸を4ミリリットルの脱イオン水に加えて、その場でチオ酢酸を作成します。

チオ酢酸溶液をプラスチック製の使い捨て10ミリリットル注射器に吸引し、注射器に18ゲージの針を装備し、次に針で中隔を貫通して混合物を反応フラスコに滴下し、摂氏55度で一晩反応を続けます。翌朝、メタノールとジクロロメタンを混合したシリカゲル60 F254プレート上の薄層クロマトグラフィーにより反応をモニターし、ブロモクレゾールグリーン染色による反応進行を可視化します。完了した反応が室温まで冷却されたら、混合物を2モル硫酸でpH1に酸性化します。

黄色の油を溶液から分離し、40ミリリットルの冷たいクロロホルムを3つ添加して製品を抽出し、有機層を組み合わせて硫酸マグネシウムを乾燥させ、減圧下でクロロホルムを除去します。製品は、全体の収率が83%の黄色のオイルである必要があり、さらに精製せずに使用できます。ジチオラン前駆体をオンレジンペプチドのN末端に結合させるために、5ミリリットルのジメチルホルムアミドに4等量のジチオラン前駆体、4等量のHBTUおよび10当量のDIPEAを添加します。

カップリング混合物を室温で10分間予備活性化してから、N末端樹脂含有フリットシリンジにサンプルを添加します。カップリング反応を2時間振とうし、続いて新鮮なジメチルホルムアミドで5ミリリットルを3回洗浄し、カップリング反応と一晩の振とうを繰り返します。2回目のカップリング後、5ミリリットルのジメチルホルムアミド洗浄を3回、続いて5ミリリットルのジクロロメタン樹脂洗浄を3回行い、乾燥した樹脂を10ミリリットルのマイクロ波反応チューブに移します。

次に、N末端ジチオラン前駆体からチオ酢酸基を脱保護するために、チューブに2ミリリットルのジメチルホルムアミドを添加します。樹脂を膨潤させ、容器に小さなマグネティックスターバーを追加し、低速マグネティックスターリングでレジンを再懸濁します。15分後、チューブに2ミリリットルの濃水酸化アンモニウムを加え、反応容器をシリコンセプタムでキャップし、容器を摂氏75度で45分間攪拌しながらマイクロ波反応器に入れます。

マイクロ波反応が完了したら、レジンを清潔で使い捨てのフリットシリンジに移し、5ミリリットルのジメチルホルムアミド2回と5ミリリットルのメタノール洗浄2回でレジンを洗浄します。最後の洗浄後、樹脂含有シリンジに5ミリリットルの切断カクテルを加え、室温で穏やかに振とうしながら1時間半インキュベーションします。高速液体クロマトグラフィーまたはHPLC精製用に1ミリリットルの粗ペプチドを調製するには、アセトニトリル中の濃縮ペプチドストック400マイクロリットルを、0.1%のトリフルオロ酢酸を添加した600マイクロリットルの水に加え、22マイクロメートルシリンジフィルターで溶液をHPLCバイアルにろ過します。

ペプチドを精製するには、UV検出器を222ナノメートルと330ナノメートルに設定したUV検出器を使用して、15〜55%アセトニトリルの線形グラジエントで20分間で3ミリリットル/分の流速でC18セミ分取カラムを使用します。次に、目的のピークを収集して組み合わせます。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間またはMALDI-TOF質量分析法によるペプチド製品の確認には、0.5マイクロリットルの2,5-ジヒドロキシ安息香酸マトリックスを含むマトリックス支援レーザー脱離/イオン化プレート上で、収集したピークの0.5マイクロリットルを混合します。

自己組織化溶液を調製するには、凍結乾燥ペプチド粉末1ミリグラムを20%アセトニトリルと10ミリモルHEPESの混合物に1.5ミリリットルの微量遠心チューブで溶解し、アセンブリ溶液をボルテックスしてサンプルを室温で組み立てます。ペプチド集合体が成熟に達したら、減衰した全反射ダイヤモンド結晶上の薄膜として8〜10マイクロリットルの集合溶液を乾燥させ、乾燥膜が形成されるにつれて1640〜1631センチメートルの大きくて広い水ピークが消失するのを監視します。1500〜1800逆センチメートルのバックグラウンドスペクトルと赤外線スペクトルを、2逆センチメートルの解像度で平均50回のスキャンで取得し、各サンプルスキャンの前にバックグラウンドスキャンを差し引きます。

ベータシートアセンブリの赤外線シグネチャは、1625〜1635逆センチメートルの鋭いピークとして観察する必要があります。ペプチドサンプルがベータシートに富む超分子構造に成熟したら、透過型電子顕微鏡のカーボングリッドの表面に10マイクロリットルのペプチド集合体溶液をロードし、集合体をグリッドの表面に1〜2分間吸着させます。グリッドの端に濾紙をタッチして余分なサンプルを取り除き、新たに調製した2%酢酸ウラニルの汚れをグリッド表面に10マイクロリットル加えて2〜3分間インキュベーションした後、濾紙で余分な汚れを取り除き、グリッドを真空デシケーターに一晩置いてから、透過型電子顕微鏡による翌日のイメージングを行います。

ジチオラン前駆体分子の最初のワンステップ合成を除けば、残りの1,2-ジチオラン修飾ペプチド合成は固体支持体上で行われます。3-ブロモ-2-プロピオン酸のジチオラン前駆体である3-2-プロパン酸への変換は、プロトンと炭素-13の核磁気共鳴によって確認され、その後、樹脂上にまだ残っているペプチドの遊離N末端アミンに結合します。脱保護後、粗ペプチドを逆相HPLCで精製し、MALDI-TOF質量分析法で製品の質量を確認します。

フーリエ変換赤外分光法および円二色性分光法を使用して、精製された1,2-ジチオランペプチドの成熟アミロイド繊維への自己組織化を監視し、それらの拡張ベータシートコンフォメーションを特徴付けることができます。その後、透過型電子顕微鏡で繊維を画像化することができます。これらの方法は、レジン上に残っている任意のペプチド配列のN末端を修飾するために使用できますが、ペプチド自己組織化条件は各ペプチドに対して最適化する必要があることを覚えておくことが重要です。

これらの技術は、自己組織化ペプチドに1,2-ジチオラン基を付加することで、生体材料分野の研究者が超分子表面反応性を探求することを可能にします。