軟体動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタアメフラシ
July 15th, 2012
我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示しアメフラシ。我々は、蛍光染料を使用して画像内カルシウム、カルシウムオレンジ、シャープ（細胞内）電極を用いたシナプス伝達を誘導し、監視します。
細胞内カルシウムは、シナプス可塑性のいくつかのメカニズムの重要な部分として示唆されてきました。これらの考え方は、カルシウムの変化とシナプス効果の変化を同時にモニタリングすることで検証できます。ここでは、カルシウムイメージングと細胞内記録を組み合わせることで、これがどのように達成されるかを示します。
私たちの実験は、軟体動物Aplysia Cahoraの神経節で行われています。この調製物には、同定された大きなニューロン、アピアにとって自然な低温、遅い信号、イメージングの容易さなど、多くの利点がありますが、私たちが示す一般的な技術は他のシステムに簡単に転用できます。こんにちは、ニューヨーク市のマウントサイナイ医科大学のフィッシュバーグ神経科学科およびフリードマン脳研究所のエリザベス・クロッパー研究室のコリン・エヴァンスです。
本日は、軟体動物Aplysia cahoraの頬側神経節における細胞内カルシウム濃度とシナプス効果の変化を同時にイメージングするデモを行います。細胞内カルシウムを検出するために、細胞IMP透過型カルシウムインジケーター色素カルシウムオレンジをシナプス前ニューロンに注入します。次に、調製物を顕微鏡下で移動させ、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンを鋭利な電極で突き刺します。
シナプス前刺激を繰り返すと、シナプス後電位またはPSP振幅の増加として見られるシナプス後反応の増強がもたらされます。カルシウム指示色素の蛍光シグナルを測定することで、シナプス前細胞内カルシウムの同時変化を検出することができます。体重約150グラムの成体動物に75ミルの等張性塩化マグネシウム溶液を注入して麻酔を開始するには、麻酔をかけた動物をワックスで覆われた皿に固定し、次に肉眼鉗子とハサミを使用して、動物の足に切開を行い、頬側腫瘤を露出させます。
頬側神経節は頬側にあり、2つの接続された半神経節で構成されています。これには数百のニューロンが含まれており、他の神経節のニューロンとともに、動物の摂食行動の生成と制御に貢献しています。細いハサミで座屈したすべての神経を切断して神経節を慎重に解放し、動物から取り除きます。
次に、解放された神経節を、人工海水で満たされたシルガードコーティングされた皿の基部に固定します。神経節は結合組織の鞘に包まれており、個々のニューロンを露出させるためには結合組織を取り除く必要があります。検証用鉗子、虹彩はさみ、および細心の注意を使用して、この鞘を切り取ります。
ニューロンの損傷を避けるために、イメージング中に任意の動きが問題となるため、約15分のピンで鞘神経節を安定させます。細胞内記録や色素注入用の鋭利な電極を調製するには、マイクロ電極プーラーでキャピラリーチューブを引っ張ります。外径1mmの薄肉フィラメントボアケイ酸ガラスを使用しています。
記録電極は、3モルの酢酸カリウムを充填したときに約10メガの抵抗を持つ必要があるため、それに応じてプーラーを調整してD電極を充填します。引っ張られた電極の背面を、電極内部のガラスフィラメントに沿ったカルシウムオレンジ染料の毛細管現象の10ミリモル溶液に浸し、先端に染料を引き込み、電極を200ミリモルの塩化カリウムで埋め戻して良好な電気的接触を確保します。カスタムメイドのBelaを使用して電極特性を改善し、記録電極抵抗を約5メガに下げています。
電極は、酸化アルミニウム懸濁液の流れに対して45度の角度で保持されます。懸濁液に塩化ナトリウムを混合し、オームメーターを接続することで、電極抵抗をモニタリングすることができます。面取りプロセスでは、欺かれたバックル神経節が入った皿を電気生理学装置に移し、電極で目的のニューロンを突き刺してその同一性を確認することで、目的のニューロンを特定します。
カルシウムイメージング用のニューロンを準備するために、まず色素充填電極を細胞体に挿入し、理論的には色素に30分間の超分極、15ナノアンペアの電流パルスを充填します。Dカルシウムオレンジが細胞に入ると、SORはかすかなピンク色を帯びます。次に、記録電極を慎重に引っ込め、調製物を少なくとも30分間放置して、色素がニューロンの微細なプロセスに拡散するのを待ちます。
次に、調製した皿を蛍光顕微鏡に移します。NA0.3の10倍の水浸レンズを直立固定ステージ顕微鏡に使用し、ステージではなくレンズを動かしてピントを合わせます。これにより、マニピュレータの取り付けが容易になります。
記録電極には、適切なフィルターブロックを選択します。SI 3フィルターブロックは、カルシウムオレンジの正しい励起フィルターと発光フィルターを提供し、カメラパラメーターと照明強度を減光フィルターと視野絞りで調整します。光が多ければ多いほどノイズは少なくなりますが、製剤が漂白される可能性があります。
クールなスナップCCDカメラは、毎秒約30フレームのフレームレートで500 x 300ピクセルのフィールドをキャプチャでき、良好な信号対雑音比です。可能な限り光源シャッターを閉じたままにして、filニューロンの照明を最小限に抑えます。イメージングソフトウェアで、関心領域またはROISを選択します。
これらの領域は、ソフトウェアが強度測定を行う場所を定義します。私たちは一般的に、シナプス前ニューロンの一次枝、二次枝、三次枝をイメージします。difiニューロンの隣に追加のROIを配置して、後で他のすべてのデータポイントから減算されるバックグラウンド値を取得します。
シナプス前およびシナプス後ニューロンの細胞内記録電極は、シナプス伝達を誘導および監視するために使用されます。カメラのフレームアウトトリガー信号を使用してデータ収集ソフトウェアを起動すると、電気生理学的データ収集とイメージングデータ収集の同期を確保できます。同期を確保する別の方法は、カメラポート内にLEDを取り付けることです。
この LED は、録音セッションの開始時に短時間点灯し、同期マークを提供します。一般的な実験では、短い電流パルスを注入することで、シナプス前ニューロンの活動電位をトリガーします。この例では、特定の仮説を検証するために、スパイクのバーストとそれに対応するカルシウムシグナルの増加を示します。
カルシウムシグナルを操作し、シナプス伝達への影響を決定することができます。例えば、カルシウムキレート剤EGTAのような薬剤は、シナプス前に注射するか、灌流システムを通じて適用することができます。データは、イメージングソフトウェアからテキストファイルにエクスポートし、次に電気生理学的データの取得に使用されたソフトウェア(この場合はCambridge Electronic DesignのSpike 2)にエクスポートすることで分析されます。
カスタムスクリプトを使用してROI強度値とそれに対応する膜電位の変化をプロットし、バックグラウンドROIから得られたバックグラウンドシグナルを差し引き、示されている式で相対的な変化を計算することにより、カルシウムシグナルの変化を定量化します。Fゼロは刺激直前の蛍光、Fは刺激中の蛍光です。ここでは、同定されたニューロンB21の蛍光カルシウムの変化を画像化した実験の結果を示します。
私たちが画像化した領域はAで示され、B1ではB21でスパイクのバーストを誘発し、B8でシナプス後電位を誘発し、カルシウムシグナルの変化を引き起こしました。B2はカルシウムキレート剤の注入の効果を示す。B 21のEGTAスパイクは、蛍光カルシウムの広範な増加を誘発しなくなり、シナプス後の電位振幅が減少します。
結論として、細胞内カルシウム濃度のモニタリングとシナプス伝達の有効性の評価を同時に行うことができる技術を実証しました。これらの技術は、ほとんどの機能的なイメージングと比較して、必要な機器が少なく、簡単かつ迅速に習得できます。
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概要
この研究は、Aplysiaの神経節製剤における細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス効力の同時モニタリングを実証しています。カルシウムオレンジをイメージングに、鋭利な細胞内電極をシナプス伝達に使用し、研究はカルシウムダイナミクスとシナプス可塑性の関係を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 神経科学
- シナプス可塑性
- カルシウムイメージング
背景
- 細胞内カルシウムはシナプス可塑性メカニズムにおいて重要な役割を果たしています。
- カルシウムとシナプス効力の同時モニタリングは、これらのメカニズムへの洞察を提供できます。
- Aplysiaの神経節製剤はこのような研究に利点を提供します。
- 実証された技術は他のシステムに適応できます。
研究目的
- シナプス伝達における細胞内カルシウムの役割を調査すること。
- カルシウムとシナプス効力の同時モニタリング方法を実証すること。
- Aplysiaを神経科学研究のモデル生物として利用すること。
使用された方法
- 蛍光色素カルシウムオレンジを使用したカルシウムイメージング。
- シナプス伝達をモニタリングするための鋭利な電極による細胞内記録。
- 軟体動物Aplysiaの神経節での実験。
- 効果的なイメージングのための大型の特定されたニューロンの利用。
主な結果
- カルシウム濃度とシナプス効力の成功的な同時モニタリング。
- カルシウムダイナミクスとシナプス伝達の関係を実証。
- このような研究にAplysiaを使用することの利点を強調。
- 他の生物学的システムに適用可能な方法論の提供。
結論
- 細胞内カルシウムはシナプス可塑性を理解する上で不可欠です。
- 組み合せられたイメージングと記録技術は神経科学研究に効果的です。
- Aplysiaはシナプスメカニズムを研究するための価値あるモデルとして機能します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding the mechanistic link between intracellular calcium dynamics and synaptic efficacy is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. This approach enables predictive confidence in pathway modulation by directly linking a key second messenger to functional synaptic output. The Aplysia ganglion model provides a disease-relevant system for probing conserved plasticity mechanisms with high signal-to-noise and experimental stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether modulating intracellular calcium alters synaptic transmission in identified neurons.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of calcium flux and postsynaptic potential changes.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by establishing causal relationships between calcium signaling and synaptic efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with normal ion channel distribution and stable synaptic connections for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers ratiometric-free fluorescence intensity changes correlated with electrophysiological readouts for high-content analysis.
- Scalability: Uses long-wavelength dye Calcium Orange requiring no filter wheel, simplifying imaging setup and increasing throughput potential.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved synaptic plasticity mechanisms applicable to neuropsychiatric and neurodegenerative disorder targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism probing with preclinical validation through standardized calcium-synaptic readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how target modulation affects both calcium dynamics and functional synaptic output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking target engagement (via calcium modulation) to functional phenotypic outcomes (synaptic efficacy), supporting lead identification and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about calcium-dependent signaling pathways in synaptic plasticity using direct perturbation and dual-readout measurement.
- Screening: Enables assay standardization through stable preparations, low phototoxicity dyes, and synchronized electrophysiology-imaging data collection.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ΔF/F fluorescence and PSP amplitude) that allow comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating intracellular calcium changes with synaptic efficacy in a disease-relevant invertebrate model of conserved neural mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing calcium-dependent synaptic mechanisms across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in calcium-synapse relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dye loading, electrode preparation, and synchronization via LED trigger.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets implicated in synaptic dysfunction.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on dual-modality readouts of target engagement and functional effect.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intracellular sharp electrode recording and calcium imaging techniques.
- Depends on fluorescence microscopy capable of 30 fps imaging and electrophysiology rigs with LED synchronization.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for synchronized data acquisition.
- Involves adaptation considerations when transferring the Aplysia ganglion preparation to other model systems with different neuronal sizes or synaptic properties.
- Limited by the inability of Calcium Orange to provide absolute calcium concentrations due to non-ratiometric nature and dye diffusion variables.
