軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ

細胞内カルシウムは、シナプス可塑性のいくつかのメカニズムにおいて重要な役割を果たすことが示唆されています。これらの概念は、カルシウムの変化とシナプス伝達効率の変化を同時にモニタリングすることで検証可能です。本稿では、カルシウムイメージングと細胞内記録を組み合わせることで、これをどのように達成するかを実演します。

本実験では、軟体動物である Aplysia Cahora の神経節を使用します。この標本には、個別に同定されたニューロンが大きいこと、アワビにとって自然な低温環境であること、信号伝達が遅くイメージングが容易であることなど、多くの利点がありますが、ここで実演する一般的な手法は他のシステムにも容易に転用可能です。こんにちは、私はニューヨーク市にあるマウントサイナイ医学部のフィッシュバーグ神経科学科およびフリードマン脳研究所のエリザベス・クロッパー研究室のコリン・エバンスです。

本日は、軟体動物 Aplysia cahora の口腔神経節における細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化を同時にイメージングする方法を実演します。細胞内カルシウムを検出するため、シナプス前ニューロンに細胞膜透過性カルシウム指示薬である calcium orange を注入します。その後、標本を顕微鏡下に移動させ、シナプス前および後ニューロンに鋭利電極を刺入します。

反復的なシナプス前刺激を行うと、シナプス後電位（PSP）振幅の上昇として観察されるシナプス後反応の増強が起こります。カルシウム指示薬染料の蛍光信号を測定することで、シナプス前細胞内のカルシウム濃度の同時的な変化を検出できます。まず、等張塩化マグネシウム溶液 75 mils を注射して体重約 150 g の成体動物を麻酔し、麻酔した動物をワックスを塗布したシャーレに固定します。次に、粗いピンセットとハサミを用いて、動物の足に切開を加え、口塊を露出させます。

口神経節は口塊の腹側に位置し、連結した2つの半神経節で構成されています。そこには数百個のニューロンが含まれており、他の神経節のニューロンと共に、動物の摂食行動の生成と制御に寄与しています。微細な鋏ですべての口神経を切断して神経節を慎重に分離し、動物から取り出します。

次に、遊離させた神経節を、人工海水で満たしたシルガードコート皿の底に固定します。神経節は結合組織の鞘に包まれており、個々のニューロンを露出させるためにこの鞘を除去する必要があります。検証用ピンセットとアイリス剪刀を用い、細心の注意を払ってこの鞘を切り取り除いてください。

ニューロンへの損傷を避けるため、脱鞘神経節をピンで約15分間固定します。イメージング中のいかなる動きも問題となるためです。細胞内記録および色素注入用の鋭利な電極を準備するために、マイクロエレクトロードプラーを用いてキャピラリーチューブをプルします。ここでは、外径1 mmの薄壁フィラメントホウケイ酸ガラスを使用します。

記録電極は3 Mの酢酸カリウムを満たした状態で約10 MΩの抵抗値を持つ必要があるため、D電極を充填するためにプルヤーを適宜調整します。引き出された電極の後端を10 mMのカルシウムオレンジ色素溶液に浸すと、電極内部のガラスフィラメントに沿った毛細管現象によって色素が先端に吸い込まれます。その後、良好な電気的接触を確保するために、電極を200 mMの塩化カリウムでバックフィルします。電極特性を向上させ、記録電極の抵抗値を約5 MΩまで下げるために、カスタムメイドのBelaを使用します。

電極を45度の角度に保持し、酸化アルミニウム懸濁液の流れに浸します。懸濁液に塩化ナトリウムを混合し、オーム計を接続することで、電極抵抗のモニタリングが可能になります。ベベリング工程の間、摘出した後根神経節を含むディッシュを電気生理学装置に移し、電極で刺入して個体を特定することで、目的のニューロンを探し出します。

カルシウムイメージングに向けてニューロンを準備するために、まず色素を満たした電極を細胞体に挿入し、15 nano ampの過分極電流パルスを30分間与えて、色素を電気的に導入します。D calcium orangeが細胞内に進入すると、細胞体は淡いピンク色になります。その後、記録電極を慎重に引き抜き、色素がニューロンの微細突起まで拡散するように、そのまま30分以上静置します。

次に、試料を入れたディッシュを蛍光顕微鏡に移動させます。ここでは、ステージではなく対物レンズを移動させてピントを合わせる正立固定ステージ顕微鏡に、10倍 NA 0.3の水浸レンズを使用して観察します。これにより、マニピュレーターの設置が容易になります。

記録電極用に適切なフィルターブロックを選択してください。SI 3フィルターブロックを使用すると、calcium orangeに適切な励起および蛍光フィルターが得られます。中性濃度フィルターとフィールド絞りを用いて、カメラのパラメータと照明強度を調整してください。光量を増やすとノイズは減少しますが、標本を退色させる可能性があります。

CoolSnap CCDカメラは、500 × 300ピクセルの視野を、約30 fpsのフレームレートと良好なSN比で撮影できます。可能な限り光源のシャッターを閉じておき、filニューロンへの照明を最小限に抑えてください。イメージングソフトウェアで、関心領域（ROI）を選択します。

これらの領域は、ソフトウェアが強度測定を行う範囲を定義します。通常、シナプス前ニューロンの一次、二次、および三次枝をイメージングします。後で他のすべてのデータポイントから差し引く背景値を取得するため、difiニューロンの隣にさらにROIを配置してください。

シナプス伝達を誘発しモニタリングするために、シナプス前および後ニューロンに細胞内記録電極を挿入します。カメラのフレームアウトトリガー信号を用いてデータ収集ソフトウェアを起動させることで、電気生理学的データとイメージングデータの取得を同期させることができます。同期を確保するもう一つの方法は、カメラポート内部にLEDを取り付けることです。

このLEDは記録セッションの開始時に短時間点灯し、これにより同期マークを提供します。典型的な実験では、短時間の電流パルスを注入することで、シナプス前ニューロンに活動電位を誘発させます。この例では、特定の仮説を検証するために、スパイクバーストとそれに伴うカルシウム信号の上昇を示します。

カルシウム信号を操作し、シナプス伝達への影響を決定することが可能です。例えば、カルシウムキレート剤であるEGTAなどの薬剤を、シナプス前終末に注入するか、灌流システムを通じて投与します。データ解析は、イメージングソフトウェアからテキストファイルにエクスポートし、その後、電気生理学的データの取得に使用したソフトウェア（本研究ではCambridge Electronic Design社のspike two）に取り込むことで行います。

独自に作成したスクリプトを使用して、ROIの強度値と膜電位の対応する変化をプロットし、バックグラウンドROIから得られたバックグラウンド信号を差し引き、示した数式で相対的な変化を算出することで、カルシウム信号の変化を定量化します。F zeroは刺激直前の蛍光強度であり、Fは刺激中の蛍光強度です。ここでは、特定されたニューロンB 21におけるカルシウム蛍光の変化をイメージングした実験結果を示します。

撮像した領域をAに示します。B 1では、B 21においてスパイクバーストを誘発させたところ、B 8にポストシナプス電位が誘発され、カルシウム信号に変化が生じました。B 2は、カルシウムキレート剤であるEGTAを注入した際の影響を示しています。B 21におけるスパイクによって、カルシウム蛍光の広範な上昇はもはや誘発されず、ポストシナプス電位の振幅が減少しています。

結論として、細胞内カルシウム濃度を同時にモニタリングし、シナプス伝達の有効性を評価するために使用できる手法を実演しました。これらの手法は、ほとんどの機能的イメージングと比較して必要とされる設備がわずかであり、習得が簡単かつ迅速です。