Name: 軟体動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタアメフラシ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶアメフラシを用いた細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率の同時モニタリング法。Calcium Orange蛍光イメージングと鋭電極細胞内記録を組み合わせ、シナプス可塑性のメカニズムを解明する神経科学研究に応用可能です。

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PHSのグラント（MH51393）は、この作業を支持した。我々が使用するアメフラシの一部は研究資源は、NIHのナショナルセンターからの助成金RR10294下マイアミ大学のアメフラシのための国家リソースによって提供されています。

1。準備<ol><li> 75〜100ミリリットル等張塩化マグネシウム溶液を注入することにより、動物を麻酔。我々はイメージングのために使用アメフラシは、一般的に 150〜200グラムあり、Marinus Scientificから得られる。 </li><li>ワックス覆われた皿に麻酔動物をピン。注射針は、この目的のためによく働く。無菌テクニックは必要ありません。総鉗子および標準はさみを使用すると、動物の足の切開を行い、口腔内の質量を公開します。頬神経の位置を確認します。すべて頬神経を切断することによって春のはさみと微鉗子、慎重にフリー神経節を使用しています。 </li><li>神経節を取り出して、人工海水を含むシルガードコートディッシュに入れてください。神経を安定させるために頬の神経が通っていくつかの昆虫ピンを配置。 Desheath細胞内記録のためのニューロンを公開するために極細鉗子と春のはさみ、ようを使って頬の神経節。その後、約15細かい虫（minを使用して再ピンガングリオンutien）ピン。どんな動きが撮像中に問題となるような神経は、所定の位置にしっかりと保持されなければならない。 </li></ol> 2。電極を準備<ol><li>フィラメント（例えばWPI TW100F-4）とプラー付きガラスキャピラリーチューブを用いて電極を引き出します。設定は、個々に必要な抵抗の電極を作成するために決定されるべきである。電極は面取り工程を省略した場合面取り、または約5 Mオームされる場合は、3MのKAc（酢酸カリウム）で満たされたときに私たちの電極抵抗が10 Mオーム程度である。 </li><li>シリンジとmicrofil針を使用して3 M KAc/30 mMのKClを含む溶液と電極の1組を記入してください。これらの電極は、電気生理学的に使用されます。 </li><li>染料の電極のバックエンドを浸漬することによりカルシウムインジケーター色素を有する電極の2番目のセットを埋める、以前に約で再構成。 500μg染料の40μlの蒸留水。電極の先端が満たされたとき、背中約1/4インチを埋める良好な電気的接触を確保するためのKCl 200mMのと電極の端の。 </li><li>これは色素注入を容易にし、複数の膜貫通による被害を減少させるので、それは、ベベル電極に有益である。我々は、塩水/アルミナ粉末懸濁液の流れを生成するカスタムbevelerを使用しています。電極をホルダに取り付けられ、その先端は45°の角度で流れに入ります。電極抵抗は連続的に監視し、面取りは抵抗のKAc充填電極の約5 Mohmをに達したときに終了します。染料埋め電極は同じ時間のために面取りされ、通常15から20 Mohmをの抵抗を持っています。 </li></ol> 3。カルシウム指示薬色素のロード<ol><li>電気生理学リグの準備を配置し、視覚的に興味のあるシナプス前ニューロンを見つけます。我々の実験の多くは、給餌、B21 5,6の間に利用同定感覚ニューロンで行われます。比較的固定positionは、大きさ（〜100μm）を、そしてB21のソーマの細長い形状は見つけることが容易になります。 </li><li>カルシウムインジケーター色素を含有する電極との利害のニューロンを突き刺す。 B21のIDはシナプス後ニューロンB8をimpalingによって確認することができます。 〜8 nAの電流でB21の脱分極は、スパイクとB8 7へのPSPのインストールを容易にする結果を引き起こします。 </li><li>約30分間過分極パルス（通常は-15 NA、1 Hzの、75％のデューティ·サイクル）を渡すことによって、興味のシナプス前ニューロンに色素を注入します。色素ローディングが成功した場合は、ニューロンの細胞体は、かすかなピンクの色を取得します。ゆっくりニューロンからそれを引き出すことによって色素含有電極を外します。 </li><li>染料はフォロワニューロンとシナプスを作る微細なプロセス中に拡散するまで、約30分のための準備を残す。 </li></ol> 4。カルシウムイメージングと電気生理学的記録<ol><li>イメージングmicroscに準備を置きOPE。準備と皿はぬれた粘土とは違って、粘り気のまま、Permagumシールコードの断片で冷却プラットフォーム上に保持されている。固定ステージ顕微鏡は、対物レンズを移動させることで焦点を当てています。ステージでは、磁石マウントマニピュレータを装着可能にする、静止したままである。高倍率は振動（特に横移動）が問題になり、全体のイメージングの設定が防振プラットフォーム上に配置する必要があります。 </li><li>通常の電解質溶液を含む電極を持つシナプス前とシナプス後ニューロンを突き刺す。 </li><li>画像カルシウムオレンジ（励起549 nmの発光576 nm）を8に適したフィルタブロックを選択して、カメラを調整します。最も科学的なCCDカメラは、調査員が読み出されるCCDセルのサブセットを選択することができます。さらに、細胞（ビニング）組み合わせることができます。ビニング増加感度ながら小さなサブセットを選択すると、速度が向上します。これらの2つの設定は、一緒に露光時間で、決定フレームレートは、1秒間に取得することができますどのように多くの画像、すなわち。適切な設定は、画像580×500×300ピクセル（10倍レンズと0.5倍のカメラアダプタを使用）と350μmの2の面積を務める。露光時間&lt;25 msの適正露出を提供する最小限の量に照度を調整する光路に中性濃度フィルタを追加します。 アメフラシに十分な速さで画像単一スパイク誘発カルシウム変化することである-これらの設定は、約30Hzのフレームレートをもたらすべきである。最後に、唯一の撮影領域が点灯しているように、視野絞りを閉じます。 </li><li>イメージングソフトウェアで、測定したいニューロンの領域をマークします。要素のARソフトでは、これは、興味のある領域（ROI）を置くことによって &quot;時間測定&quot;セクションで行われます。 B21は双極性ニューロンと前作でその横方向のプロセスに接触関心9のシナプス後ニューロンが実証されています。一般的に我々のイメージは、プライマリ、セカンダリ、および三次のブラジャーニューロンの各部分の上にROIを配置することにより、横方向のプロセスのnches。染料埋めニューロンの隣にある追加のROIは、後で他のすべてのデータポイントから差し引かれるバックグラウンド値を提供するために測定されます。 </li><li>カメラの &quot;フレーム読み出し&quot;信号によって提供されるトリガ信号を待つために電気生理学的買収を（これらの実験スパイクIIに）指示しています。画像取得（要素、AR）を起動して、カメラが最初のフレームを取るときにスパイクIIは自動的に録音を開始します。また、簡単に顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDをオンにするには1401電源のTTL出力を使用することができます。これはその後イメージングと電気生理学的なデータを同期させるための信号を提供します。 </li><li>所望の周波数で短い脱分極電流パルスのシリーズを注入することにより、シナプス前ニューロンを刺激する。活動電位はsuccessfあるかどうかを決定するために、各パルス（オシロスコープをトリガ刺激などによる）監視することが重要ですully生成。カルシウムオレンジは他の染料に比べて非常に安定した写真ですが、それは漂白染料がどのように発生するかを確認するためにはるかに刺激せずに、コントロールトライアルを記録することをお勧めします。 </li><li>細胞内カルシウム濃度が操作された実験では、このようなEGTAのような薬物は、シナプス前ニューロンに導入され、前述の刺激やデータ収集の手順が繰り返されます。 </li></ol> 5。代表的なデータの分析<ol><li>テキストフ​​ァイルに書き込むことによって、画像データ（各ROIの測定された強度値のリスト）をエクスポートします。スパイクIIでカスタムスクリプトは、テキストフ​​ァイルをインポートすることができます。このスクリプトは、個々のプローブの領域を使用して値を正規化し、バックグラウンドプローブの値を減算します。データポイントは、その後 &quot;仮想RealWave&quot;チャンネルとして電気生理学的データと一緒にプロットされます。スパイクIIにおける &quot;チャネルプロセス/タイムシフト機能&quot;は正確に撮像データポイを整列するために使用される参考として、LED信号を使用してNTS、。 </li><li>パーセントの変化に応じて値を取得するには、DF / F O = FF（O）/ F Oとしての蛍光の相対的な変化を計算することにより、画像データを分析します。 F Oは単なる刺激時の刺激とF蛍光の前に蛍光レベルを示します。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="図1" /> 図1実験の全体的なスキーム。実験は、 アメフラシの神経節の準備で行われます。細胞内カルシウムの変化は、イオン泳動シナプス前ニューロンに導入され、蛍光色素、で撮像する。そのシナプス伝達を誘導し、監視できるように、事前とシナプス後ニューロンはその後鋭い電極と突き刺されています。 <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="図2" /> <strオング&gt;図2カルシウムイメージングとアメフラシの頬神経節内の識別されたニューロンから細胞内記録。ニューロンB21の画像化された側枝の（）写真。ボックスには、関心の測定領域を示している。 B21の（B1）の細胞内刺激は、それはまた、活動電位を発生させる原因となって、シナプス後ニューロンフォロワーB8（真ん中のトレース）に活動電位（下のトレース）と容易性シナプス後電位（PSP）を彷彿とさせます。シナプス前カルシウム蛍光の増加は上のトレースに示されている。 homosynaptic円滑化に関するEGTAのシナプス前（B2）の効果。 EGTAは細胞内に注入したB21〜15分前に、細胞内刺激。それは、EGTAが低濃度でシナプス伝達を抑制するのに十分速くない遅効カルシウムキレート剤、であると考えられている。広範囲のカルシウム信号とPSP振幅の対応する減少の減少に注意してください。 （C）は、PSPの振幅は、シナプス前calciuと相関M信号。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。

<ol><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li>
<li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators%3A+Calcium+green%2C+calcium+orange+and+calcium+crimson%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophysical+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li>
<li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators%3A+rapid+transient+response+to+flash+photolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li>
<li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2%2B+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li>
<li>Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li>
<li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%22">The Handbook</a>. , 10th edition, Invitrogen. (2005).</li>
<li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldberg%2C+JH+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

我々は同時に、細胞内カルシウム濃度を監視し、シナプス伝達の有効性を評価するために用いることができるテクニックを紹介します。これらの技術は、短期可塑性の様々な形態が仲介されているどのように判断するのに役立ちます。 イメージングは​​蛍光顕微鏡とCCDカメラを用いて行われる。ほとんどの機能イメージングのセットアップと比較した場合、これらの機器の要件は比較的控えめです。手法はシンプルで簡単に習得することができます。 CCDカメラで撮像が良い時間分解能を持つ大面積の可視化を可能にしながら、空間分解能が制限されています。したがって、細胞内カルシウムの比較的広範囲または &quot;背景&quot;が増加の役割についての仮説をテストするための有用な技術である。棘における空間分解能および研究カルシウム動態を改善するために、レーザー走査型共焦点顕微鏡、または2光子顕微鏡とカルシウム指示薬カルシウムグリーンを私は可能性プロトコル10のわずかな変更で使用すること。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>カルシウムオレンジ</td><td>インビトロジェン</td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマ</td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td>カルシウム校正バッファーキット</td><td>インビトロジェン</td><td> C-3008MP </td><td>信号の感度とダイナミックレンジをテストするのに便利</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>シグマ</td><td> M0250 </td><td>動物を麻酔する0.33 M溶液で使用</td></tr></tbody></table> 表1に使用する試薬。 <table border="1"><tbody><tr><td> 設備名 </td><td> 会社 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> FN-1直立蛍光顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>ナリシゲと、ITS-FN1ステージ</td></tr><tr><td> NMN-21マニピュレータ</td><td>ナリシゲ</td><td>磁石と一緒にステージに取り付けられた</td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCDカメラ</td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NISの要素、AR （バージョン3.22） </td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>イメージングソフトウェアは、蛍光データを取得するために使用</td></tr><tr><td> 10X/0.3wプランフルーア客観</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>この水浸レンズは3.5mmの非常に長い作動距離を持つ</td></tr><tr><td> X-Citeの120 PCのメタルハライドランプ</td><td>エキスフォ</td><td>蛍光イメージングのために使用</td></tr><tr><td> LS-DWL ハロゲンランプ</td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3フィルターセット</td><td>クロマ·テクノロジー</td><td>; </td></tr><tr><td>パワー1401 A / Dコンバータ</td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td>サンプリングは3 kHzで行われていた</td></tr><tr><td>スパイクII （バージョン7.07） </td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td>電気生理学的データを取得するために使用されるソフトウェア</td></tr><tr><td> SEC-10 LXアンプ</td><td> NPIエレクトロニクス</td><td> 10Xヘッドステージで使用</td></tr><tr><td>モデル410アンプ</td><td>ブラウンリー精度</td><td>信号を増幅し、フィルタリングするために使用</td></tr><tr><td> WS-4 </td><td>マイナスKテクノロジー</td><td>イメージングのための防振</td></tr><tr><td>冷却プラットフォーム</td><td>カスタムメード</td><td>真鍮板に経由氷水を可変速度で励起される</td></tr></tbody></table> 表2機器に使用。

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

これは、細胞内カルシウムの変化はシナプス可塑性の重要な形態（例えば、homosynaptic促進）1の数の誘導を仲介することが示唆されている。これらの仮説は、同時に細胞内カルシウムの変化とシナプス伝達効率の変化を監視することによってテストすることができます。我々は、これは細胞内記録技術とカルシウムイメージングを組み合わせることによって達成することができる方法を示しています。我々の実験は、軟体動物アメフラシcalifornicaの頬神経節で行われている。この準備は、実験的に有利な多くの特長を備えています：Gangliaのは容易アメフラシから削除され、実験は通常のシナプス結合を作ると、通常のイオンチャネルの分布を持っている成人のニューロンを使用することができます。 アメフラシのために自然である動物の低代謝率と比較的低い温度（14-16℃）のために、準備が長時間安定しています。 ENT &quot;&gt;我々は簡単にイオントフォレーシスを介したニューロンに&quot;読み込まれる&quot;カルシウムオレンジ2の細胞透過性のバージョンを使用します。この長波長蛍光色素はカルシウムに結合すると、蛍光強度が増加し細胞内遊離カルシウムの変化を検出するためにはカルシウムオレンジありレシオメトリック色素（例えば、フラ2）とは異なり、高速の速度論的性質3とは、イメージングのためのフィルターホイールを必要としません。それは安定したかなりの写真や他の色素（例えば、フルオ3）2,4未満光毒性です。すべての非レシオメトリックと同様に染料、カルシウムオレンジはカルシウム濃度の相対的変化を示していますしかし、それはロードと拡散による色素濃度の変化を考慮することはできないので、それは絶対的なカルシウム濃度を提供するためにキャリブレーションすることはできません。 直立、固定ステージ、複式顕微鏡は、毎秒30フレームの周りの記録が可能なCCDカメラで画像ニューロンに使用されていました。 アメフラシこの時間分解能で細胞内カルシウム濃度であっても単一のスパイク誘発性の変化を検出するために十分です。シャープ電極を同時に同定前とシナプス後ニューロンにシナプス伝達を誘導し、記録するために使用されます。各試験の結論では、カスタムスクリプトは、電気生理学やイメージングのデータを結合します。適切な同期を確実にするために、我々は顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDからの光パルスを使用しています。シナプス前カルシウムレベル（細胞内EGTA注射を介してなど）の操作は、私たちは様々な形態の可塑性を媒介する細胞内カルシウムの役割に関する具体的な仮説をテストすることができます。

我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示し<em&gt;アメフラシ</em&gt;。我々は、蛍光染料を使用して画像内カルシウム、カルシウムオレンジ、シャープ（細胞内）電極を用いたシナプス伝達を誘導し、監視します。

細胞内カルシウム濃度の変化が、多くの重要な形態のシナプス可塑性の誘導を媒介することが示唆されている（例：...

細胞内カルシウムは、シナプス可塑性のいくつかのメカニズムにおいて重要な役割を果たすことが示唆されています。これらの概念は、カルシウムの変化とシナプス伝達効率の変化を同時にモニタリングすることで検証可能です。本稿では、カルシウムイメージングと細胞内記録を組み合わせることで、これをどのように達成するかを実演します。本実験では、軟体動物である Aplysia Cahora の神経節を使用します。この標本には、個別に同定されたニューロンが大きいこと、アワビにとって自然な低温環境であること、信号伝達が遅くイメージングが容易であることなど、多くの利点がありますが、ここで実演する一般的な手法は他のシステムにも容易に転用可能です。こんにちは、私はニューヨーク市にあるマウントサイナイ医学部のフィッシュバーグ神経科学科およびフリードマン脳研究所のエリザベス・クロッパー研究室のコリン・エバンスです。本日は、軟体動物 Aplysia cahora の口腔神経節における細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化を同時にイメージングする方法を実演します。細胞内カルシウムを検出するため、シナプス前ニューロンに細胞膜透過性カルシウム指示薬である calcium orange を注入します。その後、標本を顕微鏡下に移動させ、シナプス前および後ニューロンに鋭利電極を刺入します。反復的なシナプス前刺激を行うと、シナプス後電位（PSP）振幅の上昇として観察されるシナプス後反応の増強が起こります。カルシウム指示薬染料の蛍光信号を測定することで、シナプス前細胞内のカルシウム濃度の同時的な変化を検出できます。まず、等張塩化マグネシウム溶液 75 mils を注射して体重約 150 g の成体動物を麻酔し、麻酔した動物をワックスを塗布したシャーレに固定します。次に、粗いピンセットとハサミを用いて、動物の足に切開を加え、口塊を露出させます。口神経節は口塊の腹側に位置し、連結した2つの半神経節で構成されています。そこには数百個のニューロンが含まれており、他の神経節のニューロンと共に、動物の摂食行動の生成と制御に寄与しています。微細な鋏ですべての口神経を切断して神経節を慎重に分離し、動物から取り出します。次に、遊離させた神経節を、人工海水で満たしたシルガードコート皿の底に固定します。神経節は結合組織の鞘に包まれており、個々のニューロンを露出させるためにこの鞘を除去する必要があります。検証用ピンセットとアイリス剪刀を用い、細心の注意を払ってこの鞘を切り取り除いてください。ニューロンへの損傷を避けるため、脱鞘神経節をピンで約15分間固定します。イメージング中のいかなる動きも問題となるためです。細胞内記録および色素注入用の鋭利な電極を準備するために、マイクロエレクトロードプラーを用いてキャピラリーチューブをプルします。ここでは、外径1 mmの薄壁フィラメントホウケイ酸ガラスを使用します。記録電極は3 Mの酢酸カリウムを満たした状態で約10 MΩの抵抗値を持つ必要があるため、D電極を充填するためにプルヤーを適宜調整します。引き出された電極の後端を10 mMのカルシウムオレンジ色素溶液に浸すと、電極内部のガラスフィラメントに沿った毛細管現象によって色素が先端に吸い込まれます。その後、良好な電気的接触を確保するために、電極を200 mMの塩化カリウムでバックフィルします。電極特性を向上させ、記録電極の抵抗値を約5 MΩまで下げるために、カスタムメイドのBelaを使用します。電極を45度の角度に保持し、酸化アルミニウム懸濁液の流れに浸します。懸濁液に塩化ナトリウムを混合し、オーム計を接続することで、電極抵抗のモニタリングが可能になります。ベベリング工程の間、摘出した後根神経節を含むディッシュを電気生理学装置に移し、電極で刺入して個体を特定することで、目的のニューロンを探し出します。カルシウムイメージングに向けてニューロンを準備するために、まず色素を満たした電極を細胞体に挿入し、15 nano ampの過分極電流パルスを30分間与えて、色素を電気的に導入します。D calcium orangeが細胞内に進入すると、細胞体は淡いピンク色になります。その後、記録電極を慎重に引き抜き、色素がニューロンの微細突起まで拡散するように、そのまま30分以上静置します。次に、試料を入れたディッシュを蛍光顕微鏡に移動させます。ここでは、ステージではなく対物レンズを移動させてピントを合わせる正立固定ステージ顕微鏡に、10倍 NA 0.3の水浸レンズを使用して観察します。これにより、マニピュレーターの設置が容易になります。記録電極用に適切なフィルターブロックを選択してください。SI 3フィルターブロックを使用すると、calcium orangeに適切な励起および蛍光フィルターが得られます。中性濃度フィルターとフィールド絞りを用いて、カメラのパラメータと照明強度を調整してください。光量を増やすとノイズは減少しますが、標本を退色させる可能性があります。CoolSnap CCDカメラは、500 × 300ピクセルの視野を、約30 fpsのフレームレートと良好なSN比で撮影できます。可能な限り光源のシャッターを閉じておき、filニューロンへの照明を最小限に抑えてください。イメージングソフトウェアで、関心領域（ROI）を選択します。これらの領域は、ソフトウェアが強度測定を行う範囲を定義します。通常、シナプス前ニューロンの一次、二次、および三次枝をイメージングします。後で他のすべてのデータポイントから差し引く背景値を取得するため、difiニューロンの隣にさらにROIを配置してください。シナプス伝達を誘発しモニタリングするために、シナプス前および後ニューロンに細胞内記録電極を挿入します。カメラのフレームアウトトリガー信号を用いてデータ収集ソフトウェアを起動させることで、電気生理学的データとイメージングデータの取得を同期させることができます。同期を確保するもう一つの方法は、カメラポート内部にLEDを取り付けることです。このLEDは記録セッションの開始時に短時間点灯し、これにより同期マークを提供します。典型的な実験では、短時間の電流パルスを注入することで、シナプス前ニューロンに活動電位を誘発させます。この例では、特定の仮説を検証するために、スパイクバーストとそれに伴うカルシウム信号の上昇を示します。カルシウム信号を操作し、シナプス伝達への影響を決定することが可能です。例えば、カルシウムキレート剤であるEGTAなどの薬剤を、シナプス前終末に注入するか、灌流システムを通じて投与します。データ解析は、イメージングソフトウェアからテキストファイルにエクスポートし、その後、電気生理学的データの取得に使用したソフトウェア（本研究ではCambridge Electronic Design社のspike two）に取り込むことで行います。独自に作成したスクリプトを使用して、ROIの強度値と膜電位の対応する変化をプロットし、バックグラウンドROIから得られたバックグラウンド信号を差し引き、示した数式で相対的な変化を算出することで、カルシウム信号の変化を定量化します。F zeroは刺激直前の蛍光強度であり、Fは刺激中の蛍光強度です。ここでは、特定されたニューロンB 21におけるカルシウム蛍光の変化をイメージングした実験結果を示します。撮像した領域をAに示します。B 1では、B 21においてスパイクバーストを誘発させたところ、B 8にポストシナプス電位が誘発され、カルシウム信号に変化が生じました。B 2は、カルシウムキレート剤であるEGTAを注入した際の影響を示しています。B 21におけるスパイクによって、カルシウム蛍光の広範な上昇はもはや誘発されず、ポストシナプス電位の振幅が減少しています。結論として、細胞内カルシウム濃度を同時にモニタリングし、シナプス伝達の有効性を評価するために使用できる手法を実演しました。これらの手法は、ほとんどの機能的イメージングと比較して必要とされる設備がわずかであり、習得が簡単かつ迅速です。

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の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

海洋カタツムリ のアプリシアカリフォルニカ は、細胞および分子ベースの行動に関する研究のための神経生物学モデルとして広く使用されている。ここでは、同定された神経回路の単一ニューロンの電気生理学的および分子的分析のための Aplysia...

アプリジア 単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

このプロトコルでは、線虫みみずの動作における神経活動の変更を記録する遺伝子にエンコードされた Ca2...

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。...

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。...

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

学ぶアメフラシを用いた細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率の同時モニタリング法。Calcium Orange蛍光イメージングと鋭電極細胞内記録を組み合わせ、シナプス可塑性のメカニズムを解明する神経科学研究に応用可能です。

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ

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軟体動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ