水中での超分子ポリマーのサイズ、形状と安定性を制御する

次の実験の全体的な目標は、水中の超分子動的ナノ粒子のサイズ、形状、および安定性を制御することです。これは、分子構造が引力と反発性の両方の相互作用のためにコーティングされている自己組織化または重合二値増幅の設計によって達成されます。これにより、フラストレーションが溜まる成長メカニズムが生じ、制御された球形の自己組織化ナノ粒子が水中で生成されます。

第2のステップとして、水溶液の塩濃度が増加し、ディスコアンフィの分子構造にコードされる反発性相互作用が弱まります。これにより、球体からロッドへの遷移、温度依存性の円型クロウ主義またはCD分光学的調査が誘発されるか、この球体からロッドへの遷移の根底にあるメカニズムを明らかにするために実行されます。さらに、極低温透過型電子顕微鏡などの分析技術と核磁気共鳴を使用して、1つのタイプの凝集体から他のタイプの凝集体への遷移を測定および視覚化すると、球体からロッドへの遷移が超分子重合の強化された協同組合で表されることを示す結果が得られます。

これは、制限されたサイズのナノ粒子における反協調プロセスから、非常に大きな超分子ポリマー(この場合は動的ナノロッド)につながる完全に協調的な核形成伸長メカニズムへの移行に由来します。CD分光法、小動脈、X線散乱、DO MRなどの分光技術とクライオなどの顕微鏡技術を組み合わせる主な利点は、水中の超分子ポリマーの遷移を測定および視覚化できることです。これらの動的ポリマーは、温度の変化、OnX強度の変化、pHの変化などの外部刺激に応答できます。

これらの方法の組み合わせは広く適用可能であり、分子化学および自己組織化ナノ材料の分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、低分子ビルディングブロックの自己組織化によって形成される凝集体の次元と、その根底にある形成メカニズムとの間の相関関係を調べることができます。この方法論の意味は、バイオナノ技術の幅広い応用にまで及びます。

私たちは特に、生物医学イメージングの分野と、凝集安定性、高コントラスト、および自己組織化造影剤を排泄する能力との間の微妙なバランスが臨床使用での成功にとって最も重要な、自己組織化ナノ粒子造影剤の開発に関心を持っています。私たちが最初にキャラクタライセンシング技術を組み合わせるというアイデアを思いついたのは、自己組織化ビルディングブロックの分子構造の微妙な変化が、超分子重合のメカニズムに根本的な違いをもたらす可能性があることに気づいたときでした。この手順を実演するのは、トロバン工科大学の専門家であり、クライオ10施設の責任者であるポール・ボーモントです。

このプロトコルは、書面によるプロトコルに記載されているように、100ミリモルのクエン酸緩衝液にA BTAガドリニウムDTPA溶液を調製することから始めます。このビデオに添付して、1cmのUV Q獣医に溶液を充填します。獣医を円形Dクロウ主義分光計のqveホルダーに挿入します。

230〜350ナノメートルのCDスペクトルを測定します。次に、363ケルビンから283ケルビンまでの最大強度のCDバンドで、1分あたり1ケルビンの速度でCD冷却曲線を測定します。次に、同量の2モル塩化ナトリウム緩衝液をBTAガドリニウムDTPAのクエン酸緩衝液に加えます。

これにより、イオン強度が1モルの塩化ナトリウムに増加し、ディスコが濃度の半分に希釈されます。イオン強度の増加に続いて、イオン強度が増加した溶液を40秒間ボルテックスし、CDスペクトルを230〜350ナノメートルに再測定します。次に、363ケルビンから283ケルビンまでの最大強度のCDバンドで、1分あたり1ケルビンの速度でCD冷却曲線を測定します。

生のCDデータをorigin 8.5にエクスポートします。スペクトルを正規化するには、測定された最高温度での CD 効果を 0 に等しく、測定された最低温度での CD 効果を 1 と定義します。CD 効果の大きさは凝集の程度に比例するため、正規化された CD 曲線は凝集の程度に比例します。正規化されたデータは、温度依存の自己組織化モデルを使用して、origin Pro 8.5の非線形曲線フィットオプションを使用してフィットされます。

このモデルでは、核生成と伸長領域が区別されます。まず、伸長領域の凝集度を合わせます。この式では、Tは可変温度を表します。

PHI Nは凝集度に比例する正味のヘリシティ、HEは伸びの分子エンタルピーです。T TEは伸び温度を表し、これは自己組織化が熱力学的に有利になり始める温度です。正規化係数フィアットは、フィアット上のファイNがユニティを超えないようにするために導入されますが、これはアグリゲーションの次数が超えることができないという制約から導き出されます。

ユニティフィッティングは、モルあたりの宝石数での伸びエンタルピーと、特定の濃度に対する分子の自己組織化を特徴付けるケルビンでの伸び温度を抽出することができます。この方程式は最初の方程式を適合した後の伸び領域でのみ有効であるため、TEより低い温度での凝集度のみを適合させるという制約に従うと、核生成領域方程式の唯一の未知のパラメータは、超分子重合の協同組合を表す活性化定数kaです。活性化定数の適合を見つけるために、実験的に見つけたのは、核生成領域におけるTEを超える温度の凝集度です。

まず、本文に記載されているように、電子顕微鏡用の溶液を準備します。100ミリモルのクエン酸緩衝液と、5モルの塩化ナトリウムを溶解する100ミリモルのクエン酸緩衝液、BTAガドリニウムDTPAを調製した各緩衝液の0.1ミリリットルに2つの緩衝液を簡単に調製して、1ミリモルのデコ濃度を達成します。次に、5ミリアンペアで40秒間動作するC Resington 2 0 8カーボンコアを使用して、量子箔カーボンコーティンググリッドをプラズマ処理します。

ガラス化手順は、で生成された光沢のあるISISの薄層がTAM分析に適していることを保証するため、クライオの重要なステップです。水溶液は、自動化されたFEI vitroボットによるガラス固化中にグリッド上に適用されます。これには、グリッド上にサンプルを塗布し、余分な液体をブロッティングしてグリッド上に水溶液の薄膜を作成し、その後、グリッドを液体イーサンに非常に迅速に浸すことによりガラス化することが含まれます。

ガラス固化後、処理したグリッドを液体窒素に移して保存し、サンプルグリッドを液体窒素で冷却したオートローダーカセットに手動で移します。次のステップは、カセットをTUEクライオタイタン、TEMオートローダーに挿入することです。TUE Cryo Titanには、300キロボルトで動作する電界放出型電子銃が装備されています。

TAM画像の記録には、経験と迅速な処理が必要です。これは、イメージング中に高エネルギーの電子ビームが試料に損傷を与えるため、ポストカラムガチンエネルギーフィルターを装備したCCDカメラで画像を記録します。ガドリニウムは常磁性が高く、陽子信号が大幅に広がるため、ガドリニウムを反磁性イットリウムとBTアトリウムの溶液で置換した別のディスコが使用されました。

DTPAをご用意しております。1ミリモルの目標濃度を達成するためには、分子量2,979グラム/モルのBTアトリウムDTPAが何ミリグラム必要かを計算します。得られた溶液の0.6ミリリットルをウィルム、LABAs NMRチューブにピペッティングした後、決定された量のBTアトリウムDTPAを50ミリモルのディレーティングコハク酸緩衝液に溶解します。

Varian の 5 mm I-D-P-F-G プローブを装備した Nova 500 分光計の 1 種類の Unity にサンプルを挿入します。90度のパルスを適応させた標準的な陽子NMRを記録し、それに応じて混合時間を最適化した後、本文で説明したようにDOI実験を行います。DOIワンショットパルスシーケンスは、卵巣参照プローブにおけるHDOの自己拡散を決定した後に使用され、サンプルでは凝集体の拡散係数が決定され、そこから流体力学的半径を計算できます。

最後に、球状粒子の拡散について、ストークス・アインシュタイン関係を使用して、集合体の流体力学的半径RHを計算します。末梢ガドリニウムDTPA錯体のイオン性は、そのコアが凝集体のような細長いロッドに重合するように設計されているディスコモノマーの一次元成長にフラストレーションをもたらします。引力と反発の相互作用のバランスが、凝集体のサイズと形状を制御します。

粒子と溶液のサイズと形状を決定する強力な手法は、シンクロトロン光源です。小角X線散乱または吸い込み。BTAガドリニウムDTPAをクエン酸緩衝液に溶解し、吸引プロファイルを2つの異なる濃度で記録しました。

低Q領域で傾きがゼロに近づくと、集合体に形状と等方性がないことを示し、球状の物体の存在を示唆しています。異なる濃度で測定されたデータは、計算された半径が3.2ナノメートルの均質なモノ分散球形フォームファクターを使用して適合されました。モノマーディスコ、BTAガドリニウムDTPAの計算された幾何学半径は3.0ナノメートルであり、その存在は、自己組織化されたオブジェクトの球形とナノメートルサイズのさらなる証拠を提供するために、1に近いアスペクト比で集約されます。

プロトン拡散法を順序付けてNMR分光法を実施した。DOI NMRは、超分子凝集体の拡散係数を決定し、その流体力学的半径を計算することができます。重水素化コハク酸バッファーで凝集した反磁性二分増幅の拡散係数は、ストークス・アインシュタイン関係により、10の累乗から10メートル/秒の2乗を引いた0.69倍であると決定されました。

球形サイズの離散的な物体について、2.9ナノメートルの流体力学的半径が計算されました。このサイズは、BTA ガドリニウム DTPA の SOX データから得られる値と非常に一致しています。1次元スタック長の制御が成功したことを示すさらなる証拠は、クライオTEM顕微鏡写真から得られました。

BTAガドリニウムDTPAは、1ミリモルの濃度で直径6ナノメートルに近い予想される球状物体を生成し、SOおよびDOI測定の結果を確認します。超分子ポリマーのような高アスペクト比ロッドの形成は、高イオン強度のクライオテ顕微鏡写真で明確に観察されます。静電スクリーニングは、この発見の最も可能性の高い説明です。

形状は、直径約6ナノメートルの球状の骨材から、直径6ナノメートル、長さ数百ナノメートルの細長い棒状に変化します。塩濃度が上昇したBTAガドリニウムDTPAの室温CDスペクトルを以下に示します。BTAガドリニウムDTPA濃度は、低イオン強度で10の8倍マイナス3ミリモル、高イオン強度で10の4倍マイナス3ミリモルです。

CD測定には大幅に低い濃度が適用されますが、クリアコットン効果は、マイクロモル濃度でも無傷の凝集体が存在することを示しています。CDスペクトルの形状は、塩濃度が増加すると変化しますが、これはスタックの周辺での反発性相互作用の減少とデコの充填の強化の良い指標です。さらに、同じ溶液のCD冷却曲線は、形状に明確な違いを示しています。

凝集が始まる温度は、塩分濃度が高いほど高温にシフトします。CD効果のより急激な増加を特徴とするように、ますます協調的なメカニズムも明らかになりますが、ゼロモル塩化ナトリウムでの冷却曲線は、反協調プロセスを示すISOスミック自己組織化モデルによって最もよく説明されます。1.0モルの塩化ナトリウムでの冷却曲線は、協調的な自己組織化プロセスに典型的であり、ゼロおよび1モルの塩化ナトリウムでのBTAガドリニウムDTPAの自己組織化の熱力学的パラメータを定量化する核形成伸長モデルによって記述できます。

協調モデルを使用すると、無次元の活性化であるkaの減少が明確に明らかになります。定数。KAの値が低いほど、自己組織化プロセスにおける協調性が高いことを示し、これは高度に伸びた超分子ポリマーの形成に表されます。クライオTEMで観察されたように、実証された実験技術を試みている間、実験方法の組み合わせのみが調査中の動的ナノ材料の有意義な全体的な説明につながることを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、私たちの複合実験アプローチがどれほど広く適用可能であり、自己組織化ナノ材料とスーパーポエムの分野における主要な質問に答えるのにどのように役立つかを十分に理解できるはずです。