ポリメラーゼ連鎖反応：基本的なプロトコルプラスのトラブルシューティングと最適化戦略

この手順の全体的な目標は、少量の出発物質からDNAの特定のセグメントを十分に供給するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応またはPCRに関与するステップを実証することです。まず、PCR反応で使用する試薬と材料を組み立て、次に4つのデオキシリボヌクレオチド、DNAテンプレート、プライマー、DNAポリメラーゼなどの反応混合物を設定します。次のプログラムでは、サーマルサイクリング条件とPCR反応を実行します。

これに続いて。結果を確認して、反応が成功したかどうかを判断します。最終的に、ポリメラーゼ連鎖反応により、目的の製品サイズの特定のアンプリコンが得られるはずです。

一般的に、このプロトコールを初めて使用する人は、各可変試薬の計算設定に少し苦労し、特にグリセロールを含むポリメラーゼでは、ピペッティングや正しい容量に問題が発生することがあります。新しく満たされたアイスバケツで実験を始めます。反応を汚染しないように手袋を着用してください。

混合物および試薬。PCR成分を氷上に並べて完全に解凍します。これらには、DNAテンプレートプライマー、DNAポリメラーゼ10 x反応バッファー(塩化マグネシウムの有無にかかわらず)、デオキシヌクレオチド、滅菌水、塩化マグネシウムが含まれます。

塩化マグネシウムを含まないバッファーを使用する場合は、塩化マグネシウムが必要です。96ウェルプレートを氷のバケツに入れ、0.2ミリリットルの薄肉PCRチューブのホルダーとして使用します。次に、ワークベンチにPCRチューブとキャップを装備します。

PCRチューブラック、耐エタノールマーカー、マイクロピペッターのセットです。常に、反応混合物を量子滅菌蒸留水で詳細に説明した試薬の表を作成し、最終容量50マイクロリットルを得てください。たとえば、マグネシウムを含まないバッファー 5 マイクロリットル、10 ミリモル DN NTP の 1 マイクロリットル、および最適化された 4.0 ミリモル マグネシウムを使用します。

各20マイクロモルプライマーの1マイクロリットル、マイクロリットルテンプレートあたり2ナノグラムの0.5マイクロリットル。また、0.5マイクロリットルのポリメラーゼには、33マイクロリットルの滅菌水のみが必要です。塩化マグネシウムが10 x バッファーに存在しない場合、または PCR の最適化に必要な場合は、塩化マグネシウムを添加します。

PCRチューブにエタノール耐性マーカーを各反応チューブに標識します。まず、計算した量の滅菌水を加え、次にバッファー 10 x と DN NTP 10 ミリモルを加えます。この反応では、塩化マグネシウムで滴定を行っています。

マグネシウム濃度は一定ではないため、塩化マグネシウムをPCRチューブに個別に添加し、滅菌水で容量を10マイクロリットルに正規化し、最終マスターミックスの40マイクロリットルを各PCRチューブに添加します。50マイクロリットルの反応と塩化マグネシウムを完成させるために、DNAテンプレートとプライマーを引き続き追加します。最後に、1.8ミリリットルのマイクロフュージチューブに50マイクロリットルの反応あたり0.5〜2.5ユニットのDNAポリメラーゼを添加します。

コントロールとピペットの移し替え損失に対応するのに十分なマスターミックス溶液を準備します。マイクロピペットを全溶液量の約半分にセットし、ピペッティングで穏やかに混合します。各テストサンプルについて、雄弁なマスターミックスをPCRチューブに混ぜます。

次に、テンプレートDNAを使用しないネガティブコントロールの場合、すべての試薬を追加し、滅菌水を使用して欠落しているDNA量を補います。次に、ポジティブコントロールには、実験用PCRサンプルと同じ条件下で既知のフラグメントを増幅するテンプレートDNAとプライマーのセットを使用します。PCRサーマルサイクラーは、反応混合物を急速に加熱および冷却し、二本鎖の熱誘起変性、DNAテンプレートのプラスおよびマイナス鎖へのプライマーのDNAAニーリング、およびPCR産物の伸長を可能にします。

サイクリングタイムは、テンプレートのサイズと一般式のDNAのGC含有量に基づいています。テンプレートの最初の変性から始めて、次に3段階の温度サイクルプログラムを25〜35ラウンド開始します。これらのサイクルの最初のステップは、DNAテンプレートを変性させることです。

次に、最適になるようにプログラムし、プライマーの見かけの融解温度より約5°C低いプライマーをひざまずかせ、続いて伸長ステップでポリメラーゼをDNAテンプレートに持って行き、PCR産物を合成します。次に、サイクル数を入力します。次のプログラム。

アンプリコンの合成を完了するための延長伸長ステップ。最後に、混合物を摂氏4度に冷却する終了ステップを含めます。標準的なPCR条件で目的のアンプリコンが得られない場合、より良い結果を得るためにはPCRの最適化が必要です。

したがって、最初に反応が機能しなかった場合は、反応のトラブルシューティングを試みる必要があります。ですから、まず、問題が人為的ミスではないことを確認したいのです。これは、ピペッティングエラーが発生した場合や、試験管の1つに試薬を追加するのを忘れた場合に発生する可能性があります。

次に、サーモサイクラーのセットアップを変更できるように条件の厳格さの一部を変更してみるか、マグネシウム濃度を変更することもできます。また、問題のトラブルシューティングのために、試薬にいくつかの添加剤を追加してみることもできます。あるいは、ホットスタートPCRは、初期変性時間を劇的に増加させる汎用性の高い変更方法と考えてください。

次に、AROS ゲル電気泳動を使用して、S seia のゲノム DNA から GAL 3 遺伝子の PCR を分離し、この試薬セットの最適なマグネシウムイオン濃度を決定します。予想されるサイズの PCR 産物。2098 塩基対は、2.5 ミリモルのマグネシウム濃度から開始して現れ、4 ミリモルの最適濃度で、所望の PCR 産物の異なる DNA テンプレート増幅には 2 つのバンドが必要です。ミリモルマグネシウム。反応の厳密性を効果的に最適でない増幅条件に減らすと、非特異的な生成物が付着します。

さらに、反応還元の全体的な厳格性により、アンプリコンアイコンを形成するために必要なマグネシウムイオンの量が少なくて済みます。したがって、変数に注意しながらPCRを最適化することで、離散的な目的の製品を生成できます。このビデオを見れば、ポリメラーゼ連鎖反応のセットアップ方法と調製方法について十分に理解できるはずです。

目標は、各PCRの変数を理解し、それらを操作して目的のアンプリコンを作成する方法を理解することです。