Name: ポリメラーゼ連鎖反応：基本的なプロトコルプラスのトラブルシューティングと最適化戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぼうポリメラーゼ連鎖反応の基本プロトコルとトラブルシューティング戦略。DNA増幅の最適化手法と反応条件の調整方法を解説し、分子生物学研究における実用的なスキルを習得できます。

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試薬を設定し、ゲルを注ぐとカリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）エリン·サンダースにインスピレーション、ガイダンス、およびサポートのために、原稿を校正するためのカリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）クリスReddiに感謝します。私もGAL3遺伝子を増幅するために酵母ゲノムDNAとプライマーを供給するためのジャンカルロCostagutaとグレゴリー·S.ペインに感謝したいと思います。 4 - 私もラボ機器および図2を作るために使用する試薬の写真を撮るためにBhairav​​シャーに感謝します。このプロジェクトの資金は、HHMI（ハワードグラント番号52006944）によって提供されていました。

<ol><li>Albert, J., Fenyo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+sensitive%2C+and+specific+detection+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+clinical+specimens+by+polymerase+chain+reaction+with+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564 (1990).</li>
<li>Baskaran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+amplification+of+a+mixture+of+deoxyribonucleic+acids+with+varying+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content.</a> Genome Res. 6, 633-638 (1996).</li>
<li>Blanchard, M. M., Taillon-Miller, P., Nowotny, P., Nowotny, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+buffer+optimization+with+uniform+temperature+regimen+to+facilitate+automation%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">PCR buffer optimization with uniform temperature regimen to facilitate automation.</a> PCR Methods Appl. 2, 234-240 (1993).</li>
<li>Borer, P. N., Dengler, B., Tinoco, I. Jr, Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+ribonucleic+acid+double-stranded+helices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.</a> J. Mol. Biol. 86, 843-853 (1974).</li>
<li>Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+DNA+duplex+stability+from+the+base+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Predicting DNA duplex stability from the base sequence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3746-3750 (1986).</li>
<li>Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+pre-PCR+mis-priming+and+primer+dimerization+improves+low-copy-number+amplifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications.</a> Nucleic Acids Res. 20, 1717-1723 (1992).</li>
<li>Coleman, W. B., Tsongalis, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColeman%2C+WB+%22Diagnostics+for+the+clinical+laboration%22">Diagnostics for the clinical laboration</a>. , Humana Press. (2005).</li>
<li>D'Aquila, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+sensitivity+and+specificity+of+PCR+by+pre-amplification+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3749(1991).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Touchdown%27+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4008(1991).</li>
<li>Erlich, H. A., Gelfand, D., Sninsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the polymerase chain reaction.</a> Science. 252, 1643-1651 (1991).</li>
<li>Frey, U. H., Bachmann, H. S., Peters, J., Siffert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-amplification+of+GC-rich+regions%3A+%27slowdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">PCR-amplification of GC-rich regions: 'slowdown PCR.</a> Nat. Protoc. 3, 1312-1317 (2008).</li>
<li>Haqqi, T. M., Sarkar, G., David, C. S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+amplification+with+PCR+of+a+refractory+segment+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specific amplification with PCR of a refractory segment of genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 16, 11844(1988).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR Protocols: A guide to methods and applications</a>. , Academic Press, Inc. San Diego. (1990).</li>
<li>King, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+N+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 630, Humana Press. (2010).</li>
<li>Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+polynucleotides.+XCVI.+Repair+replications+of+short+synthetic+DNA%27s+as+catalyzed+by+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.</a> J. Mol. Biol. 56, 341-361 (1971).</li>
<li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nat. Protoc. 3, 1452-1456 (2008).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Appendix 3, 1-14 (2001).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, Appendix 4J(2002).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Kwok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+immunodeficiency+virus+sequences+by+using+in+vitro+enzymatic+amplification+and+oligomer+cleavage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection.</a> J. Virol. 61, 1690-1694 (1987).</li>
<li>McConlogue, L., Brow, M. A., Innis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-independent+DNA+amplification+by+PCR+using+7-deaza-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2'-deoxyguanosine.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9869(1988).</li>
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<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction+in+an+anemic+mode%3A+how+to+avoid+cold+oligodeoxyribonuclear+fusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion).</a> PCR Methods Appl. 1, 1-4 (1991).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Paabo, S., Gifford, J. A., Wilson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+sequences+from+a+7000-year+old+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9775-9787 (1988).</li>
<li>Rees, W. A., Yager, T. D., Korte, J., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+can+eliminate+the+base+pair+composition+dependence+of+DNA+melting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting.</a> Biochemistry. 32, 137-144 (1993).</li>
<li>Roux, K. H., Hecker, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optimization+using+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One-step optimization using touchdown and stepdown PCR.</a> Methods Mol. Biol. 67, 39-45 (1997).</li>
<li>Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Sambrook, J. A. R., David, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+JAR+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual</a>. 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Sarkar, G., Kapelner, S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formamide+can+dramatically+improve+the+specificity+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formamide can dramatically improve the specificity of PCR.</a> Nucleic Acids Res. 18, 7465(1990).</li>
<li>Smit, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+codon+12+mutations+occur+very+frequently+in+pancreatic+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas.</a> Nucleic Acids Res. 16, 7773-7782 (1988).</li>
<li>Wilson, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+facilitation+of+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 3741-3751 (1997).</li>
<li>Wu, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 218, Academic Press, Inc. San Diego. (1993).</li>
</ol>

私は、開示することは何もありません。

PCRは、生物科学兵器で欠かせないツールとなっています。 PCRは、さらに生化学的な分析のためのゲノムと多様性だけでなく、単にクローニング遺伝子の洞察を得て、生物学者はゲノムを支配する力を得て、具体的かつ正確な臨床試験を可能にする、新たな機能を備えたハイブリッド遺伝子を加えることができ、科学のコースを変更した。 PCRアプリケーションは、その力を行使する科学者の想像力によって制限されます。そこにPCRの新しい特殊な使用法を説明し、多くの書籍や論文があり、多くは生物科学の次の世代にわたって開発されます。しかし、関係なく、予想されるアプローチは、基本的なフレームワークが変わっていません。 PCRは、そのすべての壮大さには、in vitroでのアプリケーション内の DNAの特定のセグメントを大量に生成することです。 PCR実験を設計する思想と忍耐を必要とします。図3に示す結果は、主要なチャンネルの一つを例示PCRの最適化戦略を設計する際にallenges。 PCRの1つのパラメータが変更されているつまり、それは相互に影響を与える可能性があります。例として、初期のPCRは最適なMgを2でサブ最適なアニーリング温度（58℃）で実施された場合、2.0 mMの+濃度、その結果は図3cに見られるように塗抹標本を生成します。塗抹標本を解決しようとすると、2.0 mMのMgCl 2を含む反応とPCR条件を設定し、61℃にアニール温度を調整伴うかもしれないしかし、図3aに示すように、これは任意の生成物を得ませんでした。したがって、むしろ誤った結果のトラブルシューティングを行うときに、単一の反応に1つの濃度を追加することなく、試薬を滴定することをお勧めします。また、PCR実験を最適化するために必要とされる最も一般的な調整は、Mg 2 +濃度を変更し、アニール温度を修正することです。ただし、これらの変更は最小限に抑えたり、異常な結果を廃止、additiの滴定しない場合VESおよび/または表2-6に説明したようにサイクリング条件のプロトコルを変更するには、問題を軽減することがあります。他のすべてが失敗した場合は、プライマーを再設計して、もう一度試してみてください。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Taqポリメラーゼ Polymeras </td><td>シグマ</td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td>キアゲン</td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2ミリリットル薄壁チューブPCRチューブ</td><td>バイオラッド社</td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2ミリリットル薄壁管のキャップ</td><td>バイオラッド社</td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TEバッファー： </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA二ナトリウム塩二水和物</td><td>シグマ</td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HClを</td><td>シグマ</td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td>カスタムファージ入門</td><td>インビトロジェン</td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td>カスタムファージ入門</td><td>インビトロジェン</td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td>カスタム酵母入門</td><td>統合されたDNAの技術</td><td colspan="2">のSacI-Gal3（-256）ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td>カスタム酵母入門</td><td>統合されたDNAの技術</td><td colspan="2"> Gal3（1848）をSacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>バイオラッド社</td><td> 170-9703 </td><td>私のサーマルサイクラー</td></tr><tr><td>アガロース</td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動</td><td> Hoeffer科学機器</td><td>モデルHE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 kbのDNAラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td>バイオラッド社パワーパック</td><td>バイオラッド社</td><td> 164-5050 </td><td> PowerPacは基本的な</td></tr><tr><td>ゲルドクシステム</td><td> Fotodyne株式会社</td><td colspan="2"> FOTO /アナ捜査FXワークステーション</td></tr></tbody></table>

ポリメラーゼ連鎖反応：基本的なプロトコルプラスのトラブルシューティングと最適化戦略

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

生物学の発見の黄金時代に規律をカタパルト技術の進歩がありました。例えば、微生物学の分野は​​、科学者が初めての原核生物を可視化することができアントン·ファン·レーウェンフックの顕微鏡の出現で形質転換した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の開発は、その影響は生物学で無数のsubdisciplinesにまたがると分子科学のコースを変更された技術革新の一つです。理論的なプロセスは1971年にKeppeや同僚で概説された、完全なPCR手順はシータス社の1985年の間にキャリーマリスによって記述され、実験的に適用されるまで、しかし、それは別の14年であった。この手法の自動化と洗練は、細菌サーマスのアクア 、結果的に名前のTaq DNAポリメラーゼの熱安定性DNAポリメラーゼの導入により、進行した。 PCRは、ポウです。出発材料の少量（すなわち、鋳型DNAまたは標的配列）のみからのDNAの特定のセグメント（すなわち、アンプリコン）の十分な供給を生成することができますrful増幅技術。単純な、一般的にトラブルフリーながら、誤った結果を生成する反応を複雑に落とし穴があります。 PCRが失敗したとき、それはアガロースゲル上のバンドのラダーまたはスメアとして現れ、さまざまなサイズの多くの非特異的なDNAの製品につながることができます。時々ない製品は全く形成されない。突然変異は意図せずにPCR産物の不均一な集団で、その結果、増幅産物に導入されたときに、別の潜在的な問題が発生します。忍耐と慎重なトラブルシューティングが整理し、問題（s）を解決するために採用されていない限り、PCRの失敗は、イライラになることができます。このプロトコルは、PCRの基本原理を概説し、ほとんどの標的配列の増幅をもたらす方法論を提供し、反応を最適化するための戦略を提示。このPCRガイドは、stに従うことにより、udentsのことができるようになります。 <ul><li>従来のPCR実験のための反応と熱サイクル条件を設定</li><li>様々な反応成分の機能とPCR実験で彼らの全体的な効果を理解する</li><li>任意のDNAテンプレートのPCR実験の設計と最適化</li><li>失敗したPCR実験のトラブルシューティング</li></ul>

PCRは、多くの分子生物学の研究室で一般的な手法として登場しました。いくつかの従来のPCRプロトコルへのクイックガイドですここで提供される。各反応はユニークな実験であるため、製品を生成するために必要な最適な条件は異なります。反応の変数を理解することは非常に所望の結果を得ることができる機会を増やすことは、トラブルシューティングの効率を向上させます。

生物科学においては、この分野を黄金の発見時代へと飛躍させた技術的進歩がありました。例えば、...の分野では

本手順の全体的な目的は、少量の出発物質から特定のDNA断片を大量に増幅させるために用いられるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の一連の手順を実演することです。まず、PCR反応に使用する試薬と材料を準備し、次に4種類のデオキシリボヌクレオチド、DNAテンプレート、プライマー、およびDNAポリメラーゼを含む反応混合液を調製します。その後、サーマルサイクリング条件をプログラムし、PCR反応を実行します。この後、結果を確認し、反応が成功したかどうかを判断します。最終的に、ポリメラーゼ連鎖反応によって、目的の産物サイズの特異的なアンプリコンが得られるはずです。一般的に、このプロトコルを初めて行う方は、各可変試薬の計算設定に多少苦労することがあります。また、ピペッティングや正確な分注量、特にグリセロールを含むポリメラーゼの取り扱いに困難が生じる場合があります。実験は、氷を新しく満たしたアイスバケットを用意して開始してください。反応液のコンタミネーションを防ぐため、必ず手袋を着用してください。混合液および試薬。PCRコンポーネントを氷上に配置し、完全に解凍させます。これらには、DNAテンプレート、プライマー、DNAポリメラーゼ、塩化マグネシウムを含むまたは含まない10 x 反応バッファー、デオキシヌクレオチド、滅菌水、および塩化マグネシウムが含まれます。塩化マグネシウムを含まないバッファーを使用する場合は、塩化マグネシウムが必要です。0.2 mLの薄壁PCRチューブを保持するために、96ウェルプレートをアイスバケットに入れます。次に、ワークベンチにPCRチューブとキャップを用意します。PCRチューブラック、エタノール耐性マーカー、およびマイクロピペットセット。常に、最終容量を50 µLにするために滅菌蒸留水を用いた反応混合物の試薬表を作成してください。例えば、マグネシウム不含バッファーを5 µL、10 mM dNTPsを1 µL、および最適化された4.0 mM マグネシウムを使用します。20 µMの各プライマーを1 µL、2 ng/µLのテンプレートを0.5 µL、そしてポリメラーゼを0.5 µL加え、残りの33 µLを滅菌水で満たします。10xバッファーに含まれていない場合や、PCRの最適化に必要な場合は、塩化マグネシウムを添加してください。エタノール耐性マーカーを用いて、各反応チューブにPCRチューブのラベルを貼ります。まず、計算した量の滅菌水を加え、次に10 x bufferと10 millimolar DN NTPsを加えます。この反応では、塩化マグネシウムを用いたタイトレーションを行います。マグネシウム濃度が一定ではないため、塩化マグネシウムを個々のPCRチューブに添加し、滅菌水で10 µLに定容します。これにより、最終的なマスターミックス40 µLを各PCRチューブに添加することになります。50 µLの反応液量および塩化マグネシウム量を完結させるため、続いてDNAテンプレートとプライマーを添加します。最後に、1.8 mLマイクロ遠心チューブを用いて、50 µLの反応あたり0.5〜2.5 unitのDNAポリメラーゼを添加します。コントロールおよびピペッティング時の損失分を考慮した十分な量のマスターミックス溶液を調製します。マイクロピペットを全溶液量の約半分に設定し、ピペッティングして穏やかに混合します。各テストサンプルに対し、マスターミックスをPCRチューブに分注します。次に、鋳型DNAを含まないネガティブコントロールとして、すべての試薬を添加し、不足しているDNA量分を滅菌水で補います。続いてポジティブコントロールとして、実験用PCRサンプルと同じ条件下で既知の断片を増幅させる鋳型DNAとプライマーのセットを使用します。PCRサーマルサイクラーにより反応液が急速に加熱および冷却されることで、二本鎖の熱変性、DNA鋳型のプラス鎖およびマイナス鎖へのプライマーのアニーリング、そしてPCR産物の伸長が行われます。サイクル時間は、テンプレートのサイズおよびDNAのGC含有量に基づいた一般式に従って設定します。まずテンプレートの初期変性を行い、次に3ステップの温度サイクルプログラムを25〜35回繰り返します。これらのサイクルの第1ステップでは、DNAテンプレートを変性させます。次に、プライマーのアニーリング温度をプライマーの予測融解温度より約5°C低く設定し、続いてポリメラーゼをDNAテンプレートに結合させPCR産物を合成する伸長ステップをプログラムします。ここでサイクル数を入力してください。次にプログラムします。アンプリコンの合成を完了させるため、伸長ステップを延長します。最後に、混合液を4°Cまで冷却する停止ステップを設けます。標準的なPCR条件で目的のアンプリコンが得られない場合は、より良い結果を得るためにPCRの最適化が必要です。したがって、初回に反応が進まなかった場合は、反応のトラブルシューティングを試みる必要があります。まず、問題がヒューマンエラーによるものでないかを確認してください。これは、ピペッティングのミスや、試験管への試薬の添加忘れなどが原因で起こる可能性があります。次に、条件の厳密性をいくつか変更してサーモサイクラーの設定を調整するか、あるいは別の方法としてマグネシウム濃度を変更することを検討してください。また、問題解決のために試薬に添加剤を加えることも有効です。あるいは、初期変性時間を大幅に延長する汎用性の高い修正方法として、ホットスタートPCRを検討してください。次に、AROSゲル電気泳動を用いて、S seiaのゲノムDNAからGAL three遺伝子をPCR増幅し、この試薬セットにおける最適なマグネシウムイオン濃度を決定します。注意点として、期待されるサイズである2098 base pairsのPCR産物は、マグネシウム濃度2.5 millimolarから現れ始め、4 millimolarで最適となります。異なるDNAテンプレートを用いて目的のPCR産物を単一のバンドとして増幅させるには、2 millimolarのマグネシウムが必要です。反応の厳格さを下げて実質的に不十分な増幅条件にすると、非特異的産物のスメアが生じます。さらに、反応の全体的な厳密性を下げることで、アンプリコンを形成するために必要なマグネシウムイオン量を少なくすることができます。したがって、各変数を考慮してPCRを最適化することで、目的の単一産物を得ることが可能です。このビデオを視聴することで、ポリメラーゼ連鎖反応のセットアップと準備方法について十分に理解できたはずです。目的は、各PCRの変数を理解し、目的のアンプリコンを作成するためにそれらをどのように操作できるかを把握することです。

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