プラナリアの固定化、部分照射し、組織移植

次の実験の全体的な目標は、再生中の幹細胞と子孫の行動をin vivoで分析するために、パリアン内の幹細胞切除組織に隣接する健康な幹細胞の集団を配置することです。これは、照射されていないパリアンまたはリーフリーに照射されたパリアンを麻酔して固定し、さらなる操作を行うことによって達成されます。次に、固定化された非照射パリアンを部分的に鉛で遮蔽し、次にX線照射を行い、幹細胞を含んだままのシールド組織に幹細胞アブレーション組織を並置した無傷のパリアンを生成します。

あるいは、照射されていないドナーから採取した組織移植片を、以前に照射した宿主に移植して、幹細胞の孤立した集団を有するパリアンを作製してもよい。他の方法では幹細胞内に存在するファリー。幹細胞マーカー遺伝子の全マウントRNA in situ 2ハイブリダイゼーションにより、幹細胞アブレーション組織に隣接する単離された幹細胞集団を示すアブレーションホストの結果が得られます。

したがって、ここで説明する方法は、移植パラダイムと部分照射パラダイムの両方で幹細胞の挙動を研究することにより、再生プラナリアをよりよく理解することを目的としています。これにより、これらの幹細胞が存在する周囲の組織や局所環境が、これらのネオブラストまたは幹細胞の挙動に影響を与えるかどうかをテストできます。再生の過程で、実験の1〜2か月前に、付属の原稿に従って台座に給餌します。このデモンストレーションで目的のサイズを得るために、長さが1〜2センチメートル、幅が2ミリメートル未満の台座が選択されます。

その後、使用の3〜7日前に飢餓状態になります。次に、クロロトーン溶液を軽度の局所麻酔薬として、容量クレオンあたり0.1〜0.2%の重量をパリアン水に溶解して調製します。次に、ブンゼンバーナーで組織移植用の溶液を氷上で冷却し、内径0.75ミリメートルの毛細管を端から1〜2センチメートルで90度の角度に曲げてグラフト組織を切断します。

次に、外径0.7ミリメートルの別の毛細管を端から1〜2センチメートルの角度で90度の角度に曲げて、移植片を受け取るためのホストに穴を開けます。次に、黒い濾紙ワトマンをカットします。3つ目は、濾紙キムワイプとタバコ巻き紙を添付の原稿に記載されているサイズに応じて

その後、改質ホルトファース溶液とケイン飽和ホルトフレッター溶液を調製します。両方を摂氏4度に冷やします。次に、折りたたんだキムワイプをパラフォームの正方形に取り付けます。

ペルチェクーラープレートまたはその他の冷却装置に、解剖顕微鏡で置きます。その後、キムワイプを冷やしたホルトフレッター溶液で飽和させます。次に、キムワイプに2つの黒い濾紙の長方形を置きます。

次に、ワトマンの2番の濾紙をペトリ皿に入れます。濾紙をHolt Fretter溶液で湿らせます。次に、皿を氷の上で冷やして部分照射します。

組織移植と同様に、大きな紙ライナーを大きな皿に入れます。濾紙をHolt Fretter溶液で湿らせます。次に、皿を氷の上で冷やします。

この手順では、冷やしたクレオン溶液をシャーレに入れます。プラナリアを移植用の皿にピペットで入れます。一度に1人の宿主と1人のドナーのみに麻酔をかけます。

部分照射の場合、一度に多くの動物に麻酔をかけることができます。次に、パリアが動かなくなるまで、パリアをクレオン溶液に5〜10分間浸します。パリアを冷やしたHolt Fretter溶液で満たされた皿にピペッティングしてすすぎます。

その後、冷やしたホルトフレット溶液で飽和させた黒い濾紙にプラインエリアをピペッティングして、プライン領域を固定します。次に、一対の鉗子で腹側を下にして向きを変えます。次に、前に準備した冷やしたペトリ皿を、上部ソースX線照射器内に収まる氷のバケツに入れます。

麻酔をかけた台座の領域を、黒い濾紙を動かしてシャーレに並べます。次に、それらをトップソースX線照射器に移し、カソード管からパリアまでの距離が最小になるように氷のバケツを配置します。したがって、実効線量率を最大化します。

次に、X線の線量のために、パリアとカソードチューブの間に鉛シールドを配置します。シールドされていない領域からの完全な幹細胞アブレーションが必要な場合は、30 グレイ以上を送達します。X線放射の直後に、パリアンを冷やしたパリアン水に移します。

その後、パリアンの水を室温まで温め、動物が黒い濾紙から離れるのを待ちます。これで部分照射の施術は完了です。解剖顕微鏡下でこの手順を開始するには、麻酔をかけた宿主とドナーの台座領域を、ペルチェまたはクーラープレートですでに冷却されているキムワイプ上の別々の長方形の黒フィルターに配置します。

内径0.75mmの毛細管を使用して、ドナーからグラフトプラグを切り取ります。次に、一対の鉗子を使用して、ホストの邪魔にならない部分に配置します。次に、外径0.7ミリメートルのキャピラリーチューブを使用して、ホストからプラグを取り外します。

続いて、グラフトを穴に配置します。長方形の黒い濾紙に移植した宿主を、前に準備したペトリ皿に移します。巻紙をCaine飽和Holt Fretter溶液で濡らします。

次に、移植したホストの上に置きます。次に、飽和ホルター溶液を包んだ濾紙を4枚浸し、その後、移植したホストサブがカットの4つの塊を浸す場合、飽和ホルトフレッター溶液を包んだキムワイプします。濾紙の上に置きます。

その後、フタを閉めます。ペトリ皿を氷の上に置きます。次に、ドナーのパリアンをパリアンの水に移して、回復と再生を行います。

すべての移植が完了したら、移植したパリアンを摂氏10度のインキュベーターに一晩置きます。翌朝、パリアンの水で満たされたペトリ皿に移します。パリアンが濾紙から離れるのを待つか、鉗子でそっと取り除き、その後2〜3日ごとにパリアンの水を交換します。

照射後3日で固定された照射済みで完全に遮蔽されたコントロールパリアンにおけるその場ハイブリダイゼーションは、野生型パリアンと区別がつかない幹細胞分布を示しています。一方、部分的にしか遮蔽されていなかったパリアンの場合、前部と後部を露出させた幹細胞は、遮蔽されていない領域から切除されているように見えます。これは、移植に成功したパリアンの背側と腹側のビューを示しています。

移植の3日後、移植片は背側と腹側の両方の表面にはっきりと見え、移植片の宿主界面では特徴的な色素沈着していない組織に囲まれています。しかし、移植に失敗した場合、移植部位に目に見える移植片組織は見られません。全マウントin situハイブリダイゼーションは、移植片の位置またはその周囲にのみ幹細胞が存在することを明らかにし、これは移植が一度習得されると成功したことを示しています。

移植はそれぞれわずか5分で行うことができます。成功率は90〜100%に近づき、部分照射を大幅にスケールアップできます。照射器のフィールドサイズが十分に大きいと仮定します。