プラナリアで瞳の再生を研究するための外科切除アッセイ

この手順の全体的な目標は、脳や周囲の組織を乱すことなくプラナリア光学カップを確実に取り外す方法を実証し、この技術をあらゆる教育レベルの研究者や学生が実施できるようにすることです。この方法は、in vivoでの内因性眼幹細胞の維持と分化を調節するメカニズムの決定など、再生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が他の組織の障害を最小限に抑えて眼組織だけを除去できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人が適切な量の組織を確実に除去し、周囲の組織のアブレーションを避けながら目全体を切除する前に、練習が必要です。まず、少なくとも1週間給餌されておらず、長さが少なくとも5〜7ミリメートルのワームを選択します。15〜30個のワームを、3分の2がワーム水で満たされた100ミリメートルのペトリ皿に移し、すぐにカバーを交換します。

白い頭や尾など、欠落している組織や色素沈着していない組織がないかワームを観察して、損傷がなく、最近再生していないことを確認します。まず、ワークスペースと解剖顕微鏡ベースを70%エタノール溶液で拭き取り、完全に乾かします。選択したワームが入った皿を顕微鏡の左側に置きます。

次に、顕微鏡の右側に、5番の鉗子のペア、31ゲージの5/16インチインスリン針、1ミリリットルの注射器、清潔なトランスファーピペット、およびアブレーションされた線虫を収集するためのラベル付き12ウェルプレートを置きます。糸くずの出ないティッシュペーパーの箱、新鮮なワーム水で満たされたプラスチック製の洗浄ボトル、および追加のトランスファーピペットを置いて、手術中に簡単にアクセスできるようにします。ペルチェプレートを解剖顕微鏡ベースの中央に配置し、ペルチェプレートの表面がワームを固定するのに十分なほど冷たくなるように、出力をDC電源に設定します。

あるいは、ペルチェプレートの代わりに氷入りのシャーレを使用することもできます。手術面を準備するには、まず5センチ×10センチメートルのプラスチックパラフィンフィルムをカットし、ペルチェプレートの中央に置きます。次に、糸くずの出ないティッシュペーパーを約2cm角に折り、フィルムの上に置きます。

次に、折りたたんだワイプを所定の位置に保持し、ワーム水で湿らせ、トランスファーピペットでワイプを平らに転がします。最後に、1.5〜2cm四方の白い濾紙を切り取り、ワイプの上に置きます。手術を開始するには、トランスファーピペットを使用して、ワームの背側を上にして濾紙の上に置きます。

ライトをオンにして、そのビームをワームに焦点を合わせます。解剖顕微鏡の焦点と倍率を調整して、ワームの目がはっきりと見えるようにします。パラフィンフィルムを回転させて、ワームの頭が研究者の方を向き、右に30〜40度の角度になるようにワームの位置を調整します。

線虫が腹側を上に向けて配置され、咽頭の開口部が見える場合は、鉗子の鈍い側を使用して、目が見えるように線虫の位置を背側を上にしてゆっくりと変更します。顕微鏡の設定を再調整して、目にはっきりと焦点が合うようにします。また、目と周囲の頭部組織の両方が視野に入っていることを確認してください。

右手の親指と人差し指の間に清潔な注射器を持ちます。シリンジの下部を左手の親指で支え、ペルチェプレートに支えます。顕微鏡を覗いて、針の斜角が見えていることを確認します。

左手の人差し指を手術面に置き、左手の親指と40度の角度になるようにして、手術中に表面が安定するようにします。針の斜角を上に向けて、針を目に対して90度の角度で配置します。針の先端で、目の視カップを覆う組織の薄い層に優しく浸透し、白い色素沈着していない領域として見えます。

右から左にすくい取り、眼鏡カップ内にある黒い色素沈着組織とすべての白い組織を非常に優しく取り除きます。ダブルアイアブレーションを行う場合は、ここで2番目の目をアブレーションします。手術終了後、ピペットに少量のワーム水を戻し、ワームに水を放出して濾紙から持ち上げます。

すぐにワームをトランスファーピペットに引き込みます。ワームをラベル付けされた12ウェルプレート(3分の2が新鮮なワーム水で満たされている)に移動します。すべてのワームが移されたら、井戸からの水を新鮮なワームの水に置き換えてそれらを洗います。

光から保護された線虫を摂氏20度のインキュベーターでインキュベートし、再生過程を監視します。生きたワームを犠牲にするには、プレートからワームの水を取り除き、70%エタノールと交換します。ワームを3〜5分間インキュベートし、ワームが溶解して灰色に変わるかどうかを観察します。

ここに示されているのは、外科的処置の前、4日後、および2週間後に撮影された、二重眼アブレーションおよび単一眼アブレーションを受けた扁形動物の写真です。画像は、時間の経過に伴う再生の進行状況を示しています。アブレーションされた線虫の眼の再生は、アレスチンおよび新たに開発された視細胞ニューロンの免疫組織化学的染色によっても確認されました。

ダブルアイアブレーション後の扁形動物における視覚系の回復は、光に対する野生型の羞明反応に基づく機能アッセイでも研究されました。アブレーションの24時間後、アイレスワームは光を避けず、光点を通過します。羞明は手術後7日までに回復し、再生された視覚系が機能していることを示しています。

習得すると、1つのワームのダブルアイアブレーションの手順を約3分で行うことができます。アブレーションを行うときは、目の間の組織を傷つけたり、後で組織を引き裂いたりしないように注意しながら、目の色素沈着組織と非色素組織をすべて切除することが重要です。この手順に続いて、特定の遺伝子の役割とその再生プロセスを調べるために、免疫組織化学やRNA干渉などの他の方法を実行できます。

さらに、再成長後の眼の機能をテストするために、行動アッセイを実施することができます。このビデオを見た後、周囲の組織を乱さずにプラナリアの目を切除する方法をよく理解しているはずです。針を使った作業は危険な場合があるため、手袋を着用したり、針を自分から離して保持したりするなどの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。