Name: 1 F O ATPアーゼ小胞の準備とテクニック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぶF1FO ATPアーゼ小胞の分離法。ラット脳からミトコンドリアを精製し、サブミトコンドリア小胞を調製してパッチクランプ記録によりATP合成酵素の活性を解析する手法を解説します。

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1。脳ミトコンドリア単離（ ブラウンMRらから適応。9） <ol><li>インスティテューショナルアニマルケアと使用委員会（IACUC）によって承認された方法を用いてラットを生け贄に捧げる。 </li><li>断頭により、動物の頭をカットし、皮膚をカットし、頭蓋骨を公開します。 </li><li>はさみや骨鉗子で切断してそっと頭蓋骨を開きます。脳を取り外します。 </li><li>分離バッファにおける小脳（ 表1を参照）することなく、細かく脳をミンチし、5ミリリットルガラス/テフロンホモジナイザー（機器リストを参照）に転送します。 </li><li>そっとティッシュをホモジナイズ10回（無気泡）、約5分。 </li><li> 4時10分°Cベンチトップ遠心分離機で用1,500×gでサンプルを遠心分離します。 </li><li>上清を保存（ミトコンドリアとシナプトソーム）とペレット（核物質と細胞の破片）を捨てる。ベンチトップ遠心分離機で4℃で10分間、16,000×gで遠心分離します。 </li><li>捨てるアイソレーションバッファー500μlの上清と再懸濁ペレット。細胞破砕容器（機器リストを参照）シナプトソームを乱す。急減圧が続く10分間のために1,200 PSIの圧力を適用します。 </li><li> 126500で層フィコール勾配上に混合物（ 表2参照）、SW-50.1ローターと遠心で行わ×gで4℃で20分間遠心°におけるC（機器リストを参照してください）。ペレットを精製ミトコンドリアで、フィコールの異なる密度の間の層は未破砕シナプトソームです。 </li><li> 4時10分°ベンチトップ遠心分離機でC用16,000×gで分離バッファに遠心分離によってペレットを洗浄。 </li></ol> 2。亜ミトコンドリアの小胞（SMV）アイソレーション（チャンら 10から適応） <ol><li> 1％ジギトニン等量と組み合わせる200μlのアイソレーション·バッファ内のミトコンドリア再懸濁、15分間氷の上に座ることができます。 </li><li>より多くのアイソレーションバフを追加16,000でERと遠心×4 gで10分間°ベンチトップ遠心分離機でC。これを2回行う。 </li><li> 200μlのアイソレーションバッファーでペレットを再懸濁すると10％Lubrol PX（C12E​​9）2μlのを追加します。混ぜ、15分間氷上で座ることができます。 </li><li>分離バッファ上に層混合物、182,000でSW-50.1ローター遠心×4のG℃で1時間で場所。 </li><li> 4℃で10分間16,000で分離バッファで卓上遠心×gでの遠心分離することにより最終的に得られたペレットを洗浄します</li></ol> 3。電気生理学的記録<ol><li>典型的な電気生理学リグは、増幅器、pClamp10.0ソフトウェア、マニピュレータ、顕微鏡、防振台、ファラデーケージと一緒にDigidata 1440Aアナログ - デジタル変換器インタフェースを備えたPCのコンピュータを含む。 </li><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブはフレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーモデルP-87に挿入されます。ピペットプラープログラムに最適化されていますMΩ80〜100の間に抵抗とピペットを生成します。 </li><li> SMVs生理的細胞内液（ATP、記録中に適切な時間に加算されます）（ 表3）に配置されます。パッチクランプピペットは、同じ溶液（無ATP）が充填されている。レコーディングを室温でSMVsにギガオームシールを形成することによって作られる。小胞はニコン又はツァイス倒立顕微鏡と位相差顕微鏡によって可視化される。 </li><li>膜電位は、-100 mVでから10秒の期間で+は100mVの範囲の電圧で維持される。録音はアンプ回路を使用して5 kHzでフィルタリングされます。 1未満の浮遊pAの電気的又は非特異的なノイズのレベルが成功記録のために望ましい。 </li><li>データは、単一チャネル·イベントの周波数と振幅を決定するために、例えばClampfit 10.0ソフトウェアを使用して分析される。電圧依存性は、直流電圧の関係をプロットすることによって決定される。 </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

この方法によってphenotypes.SMVspurified細胞の区別なく全脳から、手順2の後にここに、ステップ1の終了時に純粋なミトコンドリアの分離を可能にし、亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）に記載された方法は、に示されているように他の細胞内小器官による汚染の本質的に自由である図1に、私たちの前の仕事（Alavian KN ら 8）、凍結前にその構造と機能の整合性を保持します。凍結融解後、孤立したミトコンドリアやSMVsはレコーディングや生化学的アッセイのためにではなく、呼吸器の研究に使用されています。 この方法は、さらに、同じ手順を使用して肝臓からミトコンドリアを単離することができる。ミトコンドリアとSMVsは電気生理学的記録室に播種したときにクラスターを形成する傾向があるため、注意が過剰凝集や過度の希釈として、サンプルのロードに与えられるべきでpossibiliを減少させることができるシール形成のTY。また、注意が分離を開始する前に、いくつかの技術的な詳細に与えられるべきである。それはきれいなツール...

<table><tbody><tr><td>PTFEペステルの付いたPotter-Elvehjem組織ホモジナイザー</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf遠心分離機 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>4639 細胞破砕容器</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート製遠心チューブ</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>SW-50.1ローター </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-70M超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp 10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown マイクロピペットプラー Model P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</sub亜ミトコンドリアの小胞膜のパッチクランプ記録を実行するための&gt; atpアーゼ小胞の準備とテクニック

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

ミトコンドリア代謝、生存1、開発および、カルシウムシグナリング2を含む多くの重要な細胞機能に関与している。最も重要なミトコンドリア機能の二つはATP、酸化的リン酸化による細胞のエネルギー通貨、およびプログラムされた細胞死3つの信号の調停を効率よく製造に関連している。 ATPの生産を主に担当する酵素はまた、ATP合成酵素と呼ばれる4-5 F1FO-ATP合成酵素である。近年では、アポトーシスおよび壊死細胞死におけるミトコンドリアの役割は、かなりの注目を集めている。アポトーシス細胞死では、このようなBaxのようなBCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリア外膜を入力してオリゴマー化し、サイトゾル6にプロアポトーシス因子を放出し、外膜を透過性。古典的な壊死性細胞死で、このような神経細胞における虚血や興奮毒性、ラーグによって生成されるようにeは、マトリックスカルシウムに難規制増加は、内膜の細孔の開口部、ミトコンドリア透過性遷移孔またはMPTPに貢献しています。これは、内膜を脱分極と外膜の破裂、プロアポトーシス因子の放出、代謝機能不全に貢献する、浸透シフトを引き起こす。のBcl-xLの7を含む多くのタンパク質は、その機能を調節する、F1FO ATP合成酵素と相互作用する。 BCL-XLはF1FO ATP合成酵素のβサブユニットと直接相互作用し、この相互作用はF1FO ATPase活性8中F1FOによってH +の正味の輸送を増加させる、F1FOATPasecomplex内に漏れコンダクタンスを減少させ、それによってミトコンドリアの効率を高める。 ATP合成酵素の活性及び変調を研究するために、我々はF1FO ATPアーゼを含む齧歯類の脳亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）から分離された。 Alavian らに示されているようにSMVsはF1FO ATPアーゼの構造および機能の完全性を維持する。ここでは、方法が記載さ我々は、ラット脳からSMVsを単離するために正常に使用していると我々はSMVsのチャネル活性を分析するためのパッチクランプ法（イオンリークコンダクタンス）を描くこと。

我々のプロトコルの最初のステップは、 図1のウェスタンブロットにより示されるようにミトコンドリアの単離精製を可能にする。 図2に脳由来亜ミトコンドリアのベシクルパッチ記録の一例を示している。インサイドアウトパッチ構成を用いて、我々は、ATPによって変調されたチャネルの活性を示す。コントロール（CTL）記録（左）は平均で600 psのピークコンダクタンスを持つマルチコンダクタンスチャネル活性を示す。それはすぐにお風呂に1mMのATPを添加すると低下した。 ATPの全体的な効果は、濃度依存的にSMVsパッチのコンダクタンスを減少させることである。 SMV-除外H +インジケータACMAの蛍光強度の減少を測定し、 図3に示すように、単離後F1FO ATPアーゼの効率を測定するために、我々はATP加水分解に応答してSMVsへのH +イオンの移動を測定した。 ATP感受性H + SMVsへのイオンの隔離は、追加した後に強化されていATPのition。このアッセイは、H +イオン封鎖の効率を測定するために使用することができる。あまり効率SMVsはH...

ラット脳からF1FO ATP合成酵素複合体に富む亜ミトコンドリアの小胞を単離する方法が記載されている。これらの小胞はパッチクランプ記録の技術を使用してF1FO ATPアーゼ複合体の活性の研究とその変調を可能にする。

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub亜ミトコンドリアの小胞膜のパッチクランプ記録を実行するための&gt; ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

ミトコンドリアは、代謝、生存1、発生、およびカルシウムシグナル伝達2を含む、多くの重要な細胞機能に関与しています。最も重要な2つの...

本手順の全体的な目的は、パッチクランプ記録を行うために、ラット脳からF1 F zero APA小胞を単離することです。まず、ラットから脳を取り出してホモジナイズします。次に、圧力を加えてシナプス領域を破壊します。次に、シナプトソームをファイアル勾配の上に積層させます。最終ステップとして、digitoninおよびLとともにインキュベートし、パッチクランプ記録用の最終的な小胞を得ます。ミトコンドリアの重要な機能の一つは、酸化的にリン酸化によるATP産生です。ATP生成を担う酵素は、ミトコンドリア内膜に位置するATP合成酵素です。ATP合成酵素の機能を詳細に研究するため、我々はSMVと呼ぶ特殊なサブミトコンドリア小胞を単離します。これらの小胞には、ATP合成酵素が裏返しの構造（インサイドアウト構成）で含まれています。次に、これらのSMVをパッチクランプ電極で記録し、膜のリーク性を測定します。これにより、ミトコンドリアによるTP産生の効率がわかります。本日のこの手順の実演は、イェール大学の私の研究室のポストドクトラルフェローであるSylvia tiが行います。本手順では、ラットを断頭して頭部を回収した後、皮膚を切開して頭蓋骨を露出させ、ハサミまたはロンソン剪刀で慎重に頭蓋骨を開けます。続いて脳を取り出し、小脳を除いた脳組織を細切したあと、単離緩衝液で処理し、5 mLのガラス製テフロンホモジナイザーに移します。組織を10回、合計で約5分間、緩やかにホモジナイズします。その後、ベンチトップ遠心機を用い、4 °Cで1,500 ×gにて10分間、サンプルを遠心分離します。ミトコンドリアとシナプトソームを含む上清を回収し、ペレットを廃棄します。次に、ベンチトップ遠心機を用いて、4°Cで16,000 ×g、10分間、再度遠心分離を行います。その後、上清を廃棄し、ペレットを500 µLの分離バッファーで再懸濁させます。細胞破砕装置を用い、1,200 PSIの圧力を10分間かけて負荷し、その後急速減圧することでシナプトソームを破砕します。破砕したシナプトソームを、2つの層を形成する2種類の濃度のFialを含む遠心管に積層させます。次に、チューブをSW 50.1ローターにセットし、4°Cで126,500 ×gにて20分間遠心分離します。超遠心機において、ペレット部分は精製されたミトコンドリアです。異なる密度の間の層は、破壊されていないシナプトソームです。その後、単離バッファーを用いて、ベンチトップ遠心機で4°C、16,000 ×gで10分間遠心分離し、ペレットを洗浄します。次に、ミトコンドリアを200 µLの単離バッファーと等量の1% digitoninの混合液に再懸濁します。氷上に15分間置きます。次に、分離バッファーを追加し、4°Cで16,000 ×gにて10分間遠心分離します。

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

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神経科学

これは、アフリカツメガエル卵母細胞からパッチクランプ記録の紹介を目的としています。それは、卵黄膜の除去、gigaohmシール（gigaseal）の形成、および外部のアウトトポロジへのパッチの任意の変換をカバーしています。...

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。...

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

私たちは、Xenopus卵子における酵素の不均一発現と、原子吸光分光光度法による個々の細胞へのRb+またはLi+の取り込みを測定することにより、K+逆輸送P型ATPaseの活性を定量化する方法を説明しています。この方法は、放射性同位元素フラックス実験に代わる高感度で安全な方法であり、複雑な速度論的研究を容易にします。...

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

私たちは、ゼブラフィッシュ胚におけるマウスナーニューロンや他の網様体細胞からパッチクランプ記録を経由して電気的活動を記録し、監視するための完全な脳脊髄準備を開発しました。従って、我々は、発生中の胚における主要ニューロンから興奮性と抑制性シナプス電流、電位依存性チャネル活性および活動電位を記録することができる。...

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。...

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

この方法の記事では、ミトコンドリアの熱生成能力を研究するための新しいアプローチであるパッチクランプ技術を使用して、ミトコンドリア内膜を横切るH+...

ミトコンドリアの熱発生能力を研究するためのパッチクランプ技術の使用

最近の進歩にもかかわらず、多くの酵母ミトコンドリアタンパク質は依然としてその機能が全く知られていません。このプロトコルは、タンパク質の分子機能の解明の基礎であったタンパク質の局所的な局在を決定するための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。...

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

この方法は、低コンダクタンスプロトンリークに対するミトコンドリア透過性遷移細孔の寄与を利用して、野生型対照と比較して心筋細胞ミトコンドリアコエンザイムQ含量が増加した新生児脆弱X症候群マウスにおける細孔開放の電圧閾値を決定する。...

コエンザイムQ過剰の設定におけるミトコンドリア透過性転移細孔の開放確率の評価

ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。...

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

このプロトコールでは、手動のエンドリソソームパッチクランプシステムを使用して、細胞内小胞のイオンチャネル活性を直接測定する方法を詳しく説明しています。エンドリソソームを拡大し、これらの小胞を手動で単離する方法を説明します。このアプローチにより、研究者は手順を正確に再現して適用することができます。...

単一エンドリソソーム小胞分析のためのパッチクランプ技術

学ぶF1FO ATPアーゼ小胞の分離法。ラット脳からミトコンドリアを精製し、サブミトコンドリア小胞を調製してパッチクランプ記録によりATP合成酵素の活性を解析する手法を解説します。

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