1 F O ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

この手順の全体的な目標は、パッチクランプ記録を実行するために、ラットの脳からF1 F zero APAs小胞を分離することです。これは、最初にラットから脳を取り出し、均質化することによって達成されます。2番目のステップは、圧力を加えることによってシナプスゾーンを破壊することです。

次に、シナプトソームをバイアルグラデーションに重ねます。最後のステップは、ディジットトインとLでインキュベートして、パッチクランプ記録用の最終小胞を得ることです。ミトコンドリアの重要な機能は、酸化的リン酸化によるTP産生です。

TP産生に関与する酵素は、ミトコンドリアの内膜に位置するA TP合成酵素です。A TP合成酵素の機能を詳細に研究するために、SMVと呼ばれる特別なサブミトコンドリア小胞を単離します。それらは、A TP合成酵素を裏返しの構成で含んでいます。

次に、これらのSMVをパッチクランプ電極で記録し、メンブレンの漏れ具合を判断します。これは、ミトコンドリアによるTP産生の効率について教えてくれます。今日、この手順を実演するのは、イェール大学の私の研究室の博士研究員であるシルビア・ティです。

この手順では、ネズミの頭部を斬首して入手した後、皮膚を切って頭蓋骨を露出させた後、ハサミやロンで頭蓋骨を切って頭蓋骨をそっと開きます。続いて、脳を取り出し、最終的に単離して小脳のない脳をミンチし、緩衝し、次いで5ミリリットルのガラステフロンホモジナイザーに移し、組織を10回、合計約5分間穏やかに均質化する。その後、ベンチトップ遠心分離機で1,500倍Gで10分間、摂氏4度でサンプルを遠心分離します。

上清をミトコンドリアとシナプトソームで保存し、ペレットを捨てます。次に、ベンチトップ遠心分離機で16, 000回、Gを摂氏4度で10分間再度遠心分離します。次に、上清を捨て、口蓋を再懸濁します 500マイクロリットルの分離バッファーで、細胞破壊容器でシナプス体を破壊します 1、10分間200PSIの圧力を加えることにより、細胞破壊容器でシナプトソームを破壊し、続いて、破壊されたシナプスゾーンを遠心分離管に2つの異なる濃度で2つの層を形成します。

次に、チューブをSW 50.1ローターに入れ、摂氏4度で20分間、Gの500倍である126で遠心分離します。超遠心分離機では、口蓋は精製されたミトコンドリアです。フィアルの異なる密度の間の層は、中断されていないシナプトソームです。

その後、ペレットを分離して遠心分離して洗浄します。ベンチトップ遠心分離機で摂氏4度で10分間、Gの16,000倍で緩衝します。さて、Resusは、ミトコンドリアを200マイクロリットルの分離バッファーに懸濁し、等量の1%digit toinと組み合わせてください。

氷の上に15分間置きます。次に、さらに分離、緩衝液、およびGの16,000倍で摂氏4度で10分間遠心分離機を加えます。この手順を2回繰り返してから、200マイクロリットルの分離バッファーに口蓋を再懸濁し、2マイクロリットルの10%Lu bra、PXを加え、混合して氷上に15分間置きます。

その後、混合物を分離して層化し、遠心分離管に緩衝します。チューブをSSW 50.1ローターに入れ、摂氏4度でGの182,000倍で1時間遠心分離します。1時間後。

最終的なパレットを分離バッファー中で16, 000倍Gで4°Cで10分間遠心分離して洗浄します。典型的な電気生理学リグには、アンプ、digi data 1、440を搭載したPCコンピュータ、Pクランプと組み合わせたアナログ-デジタルコンバータインターフェース、10.0ソフトウェアマニピュレータ、顕微鏡、振動アイソレーションテーブル、ファラデーケージが含まれます。まず、燃えるような茶色のマイクロピペットプーラーで、Borosケイ酸塩ガラスキャピラリーチューブからピペットを引き出します。

ピペットの最適な抵抗は、80〜100メガオームである必要があります。ミトコンドリア下の小胞を生理学的細胞内溶液に加えます。次に、パッチクランプピペットに同じ溶液を入れます。

位相コントラストの下で小胞を視覚化します。SMVを室温でパッチした後の顕微鏡検査。膜電位が負の100ミリボルトから正の100ミリボルトの範囲の電圧で各期間10秒間維持されている場合の活動を記録します。

記録されたデータは、アンプ回路を使用して5キロヘルツでフィルタリングされ、クランプフィット10.0ソフトウェアで分析されます。この図は、サイトゾルとミトコンドリアから調製したライセートのブロットを示しています。上のパネルは、細胞質タンパク質GA dhに対する抗体を用いた免疫ブロットを示しています。

下のパネルは、ミトコンドリアの内膜タンパク質に対する抗体を使用したブロットを示しています。コックス4 ここでは、TPを1ミリモル追加する前後の2つの代表的なパッチクランプ録音を示します。保持電位は正の70ミリボルトです。破線は 0 ピコアンペアを表します。

各トレースは 10 秒間記録され、トレースと表示の間には 10 秒あります。これは、SMVの存在下およびTPの存在下および存在下でのA CMAインジケーターの経時的な蛍光強度変化のトレースの例です。このビデオを見れば、F1 FO 80 TP Synthesを含むサブミトコンドリア小胞であるミトコンドリアを単離する方法を十分に理解できるはずです。さらに、A TP Syntase Complexのチャネル活性を分析するために、小胞の膜上に電極を備えたフォームI耐性シールを理解する必要があります。