胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚のシナプス特性と興奮性特性を記録することです。これは、最初にゼブラフィッシュの胚を解剖して後脳の腹面を露出させることによって達成されます。2番目のステップは、解剖した調製物をパッチクランプ顕微鏡のステージに置き、細胞内の口を特定することです。

次のパッチ。適切な記録モードを使用してM細胞に固定し、シナプス活性と興奮性特性を記録します。最後のステップは、記録されたデータを分析して、シナプスまたは興奮性の特性を確認することです。

最終的に、これらの細胞からのパッチクランプは、発生中の生物のシナプス受容体の特性を示すために使用されます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、主に2つの困難領域を抱えています。1つ目は解剖です。

ギグシーンの2つ目の形成は、難しいものです。私が最初にこの方法のアイデアを持っていたのは、後脳が脊髄に付着したゼブラフィッシュの調製に取り組むことを決めたときで、その手順を実証するのは、私の研究室の博士課程の大学院生であるBurram Roy氏で、Sardが並ぶ解剖皿を準備することから始めます。まず、ワッシャーをグリースでスライドに固定します。

次に、ワッシャーの中央に液体のサードを追加します。サルドは通常一晩硬化し、スライドガラスの上に小さな円形のベッドを形成し、それが解剖皿のベースになります。スライドにカバースリップを置いた後、スライドを記録チャンバーに入れて、解剖のベースとして機能します。

その後、必要な解決策を準備します。細胞外溶液は室温で放置し、細胞内溶液は無菌に保つ必要があります。また、細胞内溶液に0.1%の黄色のルースを添加することで、実験の最後にM細胞の形態の可視化を行い、細胞の同一性を確認することができます。

次に、野生型のゼブラフィッシュの胚を28.5°Cの卵水で育て、前回の発表に従って採集してステージングします。解剖のためには、記録室を兼ねる解剖皿に胚を移します。その後、7〜10分間麻酔をかけます。

生理食塩水に近似する麻酔食塩水では、穏やかな尻尾のつまみに対する反応を調べることで、適切に麻酔されているかどうかを判断できます。その後、胚をノーアコードに通し、0.001インチのタングステンワイヤーでSILガードラインディッシュに25倍の倍率で解剖顕微鏡で固定します。解剖スコープの倍率を40〜50倍に調整して解剖を行います。

次に、細い鉗子を使用して顎の目と前脳を取り除きます。リンパ節と脳の間の鉗子を慎重に動かして、後脳を下にあるリンパ節コードからそっと剥がします。次に、腹面が上を向くように後脳をそっと裏返します。

この配置により、M細胞への良好なアクセスが可能になり、M細胞は通常、若い胚では腹面から5〜10マイクロメートル以内、高齢の幼虫では20〜50マイクロメートル以内にあります。次に、パッチクランプ実験を行うことができる記録セットアップに試料を慎重に移します。M細胞は微分干渉コントラストで可視化されますが、パッチクランプの準備には他のイメージングモードも使用できます。

まず、薄肉のケイ酸ホウガラスを使用したパッチCLAピペットを引っ張ります。水平プルピペットでは、火研磨後の直径は約0.2〜0.4マイクロメートルで滑らかなエッジに、シャンクテーパーは約4ミリメートルの長さです。ピペットチップを細胞内液に浸して、ピペットチップに細胞内溶液を充填します。

次に、シリンジ針をピペットに挿入し、シリンジから細胞内溶液を静かに排出します。ピペットの充填を完了するには、ピペットをアンプヘッドステージに取り付けます 電気生理学のセットアップでは、ヘッドステージを水平軸に対して約45度の角度に保つことが重要です。これにより、ピペットがバス溶液に下降する直前に、セル内の口で高耐性シールを形成するのに適したピペットの進入角度が確保されます。 ピペットに少量の陽圧を加えて、チップが詰まる可能性を減らします。ピペット内で少量の陽圧でM細胞に近づき続けます。

陽圧は細胞を左右に穏やかに押し、細胞のすぐ上に配置されると、細胞膜上に小さなくぼみを形成します。次に、ピペットを数秒間そのままにして細胞表面を優しく洗浄し、ピペットとメンブレンとの間に強力なシールを形成できるようにします。次に、ピペット内の陽圧を解放してシールを開始します。

少量の負圧と負のピペット電位が相まって、数秒以内にギガシールが形成されます。その後、アンプの保持電位をマイナス60ミリボルトに変更します。一連の短い吸引パルスで細胞膜を破裂させます。

その後、すぐに膜電位を記録し、キャパシタンスのアーチファクトを最小限に抑えます。細胞の静電容量とアクセス抵抗を70〜85%補正するアクセス抵抗は30秒から1分ごとに監視し、20%以上の変化がある場合は実験を中止します。実験が終了し、十分なデータが取得されたら、一対の鉗子で後脳を切除して胚を犠牲にします。

この図は、48個のHPF胚から得られた興奮性A MPAおよびNMDA受容体電流の代表的な記録を示しています。以下は、マイナス 60 ミリボルトの保持電位で M セルから記録された自発的な A MPA ME PSC です。そして、これが平均的なME PSCです。

これは、40 ミリボルトの保持電位で M 細胞から記録された自発的な A MPA および NMDA me PSC です。そして、これは、活動電位をブロックするために1マイクロモルTTXの存在下で記録された平均ME PSCsであり、5マイクロモルの厳密な9および100マイクロモルのリトキシンがグリシンとGの発生をブロックすることが示されています。これは、マイナス 60 ミリボルトの保持電位で M 細胞から記録された自発的な MI PSC です。

また、平均 MI PSC MI、PSC は、活動電位をブロックするために 1 マイクロモル TTX の存在下で記録されました。グルタミン酸受容体活性をブロックする1ミリモルのキメラ酸と、GABAの発生をブロックする清による10マイクロモルのキメラ酸。これらは、この特定の細胞のM細胞から記録された活動電位です。

0.48ナノアンペアのSRA閾値刺激はいくつかの活動電位を誘発しましたが、閾値への刺激は単一の活動電位の生成をもたらすだけです。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば2〜4時間で完了します。このビデオを見た後、ゼブラフィッシュの胚のM細胞や他の網様体脊髄ニューロンからクランプレコードをパッチする方法をよく理解しているはずです。