蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

この手順の目的は、正常な線維芽細胞と癌に関連する線維芽細胞を新鮮な組織から分離することです。これは、最初に乳腺を解剖することによって達成されます。第2のステップは、乳腺、単一細胞懸濁液、線維芽細胞特異的抗体で支持された次の細胞、および他の細胞集団に特異的な抗体を調製することです。

最後のステップは、蛍光活性化細胞のソーシングまたはファクトを実行することです。最終的に、ソーティングされた細胞集団で発現された特定のマーカーのQ-R-T-P-C-R発現プロファイリングを使用して、ソーティングされた細胞集団の純度を評価します。この技術が既存の線維芽細胞単離法と比較した場合の主な利点は、免疫細胞または上皮細胞による汚染を最小限に抑えながら、線維芽細胞の遺伝子発現プロファイルを変化させる可能性のある組織培養ステップを回避しながら、組織線維芽細胞の大部分を単離できることです。

この技術の意味するところは、分子標的を理解し特定することで、乳がんの進行と闘い、患者の生存期間を延ばし、最終的には個別化された治療オプションの改善と調整に役立つ可能性のある新しいCombinatorアプローチを提供できる可能性があるため、すべての乳がん治療にまで及びます。あなたの目に加えて、Dr.Lena一人で、ラボマネージャーがこの手順を開始する手順をデモンストレーションします。安楽死させた雌のマウスを発泡スチロールの表面に仰向けに置き、25ゲージの針を使用して4本の手足すべてをしっかりと固定します。

鉗子を使用してマウスに70%エタノールをたっぷりとスプレーします。腹部の皮膚を正中線で引き上げ、切開部から鋭利なハサミで小さな切開を行います。腹部の胸腔に穴を開けないようにしながら、動物の首まで皮膚を切ります。

正中線の切開部から脚に向かって後脚の皮膚を切り取り、Y字型にします。次に、マウスの体から皮膚を引き離し、皮膚の下側に付着している乳腺を露出させるようにピンで留めます。この手順で最も問題となることの1つは、筋肉組織を採取することを避けることです。

この問題を回避するために、筋肉組織に近接している2番目ではなく、4番目と5番目の乳腺のみを採取します。Q-tipsを使用して、小さな鋭利なハサミで結合組織を切断しながら、記憶腺をマウスの背骨に向かって分離し、見つかった壊死領域を取り除きます。解剖した記憶腺を氷上のPBSに置きます。

脱毛をせずに皮膚組織を採取する最も簡単な方法は、マウスの耳を使用することです。鋭利なハサミを使用して、安楽死させたマウスから両耳を切り取ります。氷上に少量のPBSが入った消化ジャーにすぐに耳を置きます。

乳腺単細胞懸濁液を調製するには、湾曲したハサミを使用して、氷上に少量のPBSを含む消化ジャーで乳腺を完全にミンチし、ミンチ組織に20ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を加えます。この量のコラゲナーゼ溶液は、最大15匹のマウスから約5グラムの記憶または腫瘍組織と耳を効率的に解離します。直ちに摂氏37度の水浴中の攪拌板に置き、中速で攪拌しながら15分間インキュベートし、30ミリリットルの冷たDMEMと10%FCSで反応を停止します。

次に、50ミリリットルの円錐管の上に置かれた70ミクロンのセルストレーナーを介して、組織と培地の混合物を濾します。円錐管を摂氏4度でGの450倍で5分間遠心分離します。マウスが犠牲になる前にPBSで心臓灌流されていなかった場合、サンプル中の赤血球は免疫染色の前に嘘でなければなりません。

細胞は、線維芽細胞や他の細胞集団を標識する前に、内因性FCに対してブロックする必要があります。Resusは、1〜3ミリリットルのファックスバッファー1に細胞を懸濁し、次にFCブロックを1〜50希釈で氷上で10〜20分間インキュベートします。FCブロックトランスファー100マイクロリットルの細胞アリコートを洗い流して、未染色のコントロールや単色コントロールとして使用するためにオーフチューブをイードする必要はありません。

このデモンストレーションで使用される蛍光抗体の数に応じて、2つの蛍光抗体を使用して、抗PDGF受容体αで線維芽細胞を標識します。これは、1〜50の希釈で蛍光剤に直接結合され、ソートサンプルだけでなく、他の細胞集団を標識するための単色コントロールにも使用されます。適切な蛍光標識抗体を表面マーカーにも1〜50希釈で添加します。

免疫細胞および上皮細胞に対する抗体を含む抗体を適切な単色制御チューブにも追加することは、二重陽性集団を排除し、単離された線維芽細胞の純度を高めるために推奨されます。次に、1時間洗浄した細胞を、チューブにファックスバッファー1を充填し、4°CでGの450倍で5分間回転させることにより、暗所の氷上で抗体と1時間インキュベートし、USアスピレートセートおよびレンズベンド細胞をファックスバッファー1で再利用し、使用するファックスソーターでソーティングするのに最も適した濃度に曲げる。標識された細胞をフィルタートップ付きのファックス管に移し、細胞をチューブにろ過して細胞の凝集を防ぎ、死んだ細胞を除外します。

未染色のコントロールを除くすべてのサンプルに対するDPI。ファックス分析中はサンプルを氷上に保管します。この手順を開始するには、ファクトソーターソフトウェアを使用して、蛍光灯設定、取得設定、および流体力学的液滴設定を準備します。

各サンプルを短時間ボルテックスして細胞を再懸濁してから、セルソーターにロードします。まず、未染色のサンプルを分析することから始め、全細胞集団のゲーティングを設定して細胞破片をゲートアウトし、自家蛍光染色またはバックグラウンド染色を決定します。次に、未染色サンプルとDPIを分析して、全細胞集団から生細胞の集団を決定し、ゲートします。

各カラーコントロールを分析して、補正などのパラメータを決定および調整します。染色サンプルを分析して、ソーティング用のゲートの位置を定義します。目的の細胞集団のパラメータとゲートを設定したら、標識した細胞集団を、培地またはRNA溶解バッファーを含むephチューブまたは15ミリリットルのコニカルチューブへのソーティングを開始します。

選別が終了したらすぐに、細胞をスピンダウンし、新鮮な培地またはRNA溶解バッファーに移します。実験の目的にもよりますが、選別された場合、線維芽細胞は必ずコラーゲンでコーティングされたプレートにプレートし、プラスチックに直接プレートを当てないでください。PDGF受容体αを線維芽細胞のマーカーとして使用すると、組織線維芽細胞の集団が分離され、高度に濃縮されます。

この例では、マウス乳腺の単一細胞懸濁液をPDGF受容体αおよびF four 80抗体で染色しました。ファクトソーティングプロットは左のパネルに表示され、P 2 は線維芽細胞ゲート、P 4 はマクロファージゲートです。ソース後の分析を行い、右のパネルに示した選別した線維芽細胞と中央のパネルに示したマクロファージの純度を決定しました。

次の図は、Q-R-T-P-C-R による線維芽細胞、免疫細胞、上皮細胞の細胞特異的制御遺伝子のソーシング純度の解析を示しています。結果は、ga、DH、mgusの2つのハウスキーピング遺伝子に正規化され、相対発現はgapに正規化されました。DHは、そのような分析が通常0.1〜0.6%の汚染を示すことを示しています。

このレベルの純度により、単離された線維芽細胞の高品質なトランスクリプトームプロファイリングが可能になります。未分類の乳腺線維芽細胞集団におけるPDGF受容体α発現の定量化は、乳腺の全組織線維芽細胞の約85%がPDGF受容体α陽性であることを示しています。私は孤立しました。

線維芽細胞は選別後すぐに培養できますが、回復には数日かかる場合があります。一次線維芽細胞は増殖中に老化を受けるため、低マッサージ細胞でさらなるすべての実験を行うことが不可欠です。文化では、一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば4時間で行うことができます。

3番目の細胞が培養対象に指定されている場合、無菌条件下ですべての手順を実行することを忘れないように輸入されます。今回の撮影では、無菌の選別は行わなかった。このビデオを見た後、新鮮な組織から高度に濃縮された線維芽細胞の集団を分離する方法を十分に理解しているはずです。