Name: 蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶFACSを用いてマウスおよびヒトの新鮮組織から正常線維芽細胞と癌関連線維芽細胞を高純度に分離する方法。PDGFRαを表面マーカーとして使用し、免疫細胞や上皮細胞の汚染を最小限に抑えつつ、培養による遺伝子発現変化を回避できます。

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我々は、FACSソーティングと彼らの助けのために博士Yitzchak Oschry博士と点の他鷺-アシフに感謝します。この研究は、助成合意nの下欧州連合第7次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）から°[276890]、イスラエル癌学会（＃20110078）から、イスラエルがん研究基金（ 研究からNEへの補助金によって支えられてキャリア開発賞 ）。

1。マウスから乳腺や皮膚組織を解剖する<ol><li>マウスから所望の組織を切開する前に、次の消耗品と試薬を準備します。 備品： <ul><li>手術ツール（洗剤で洗浄した後、70％エタノールに浸漬）。 </li><li>発泡スチロールの表面には、解剖時にマウスを休ませる。 </li><li>解剖時にマウスを保持するためにピンや針。 </li><li>磁気攪拌棒（オートクレーブ）を含む消化のために蓋付きのガラスの瓶、。 </li><li> 37℃水浴℃、撹拌プレート上で休んでいる間、潜水マグネチックスターラーと水没消化jarをするのに十分な水を含む。 </li></ul>試薬： <ul><li> FACS緩衝液I：（4℃）：ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、CMF（カルシウムマグネシウム無料）+0.5％BSAをバッファ</li><li>コラゲナーゼ溶液（使用直前に作られる）： 0.05グラムコラゲナーゼII 0.05グラムコラゲナーゼIV 0.01グラムのデオキシリボヌクレアーゼ 20ミリリットルFACS緩衝液Iを使用するまで氷上でコラゲナーゼ溶液を保管してください。 </li><li> PharmLyse（塩化アンモニウムの溶解試薬）。 </li><li> FACS緩衝液II：ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、CMF + 1％FCSをバッファ。 </li></ul></li><li> 乳腺の解剖 （また、17を参照）。 <ul><li>二酸化炭素（CO 2）の吸入を使ってメスのマウスを安楽死させる。 </li><li>発泡スチロールの表面に、その背中の上にマウスを置き、しっかりと25ゲージ針（ 図1A）を使用して、すべての四肢をピン。 70％エタノールで寛大にマウスを吹き付けます。 </li><li>ピンセットを用いて、正中線で腹部の皮膚を引き上げて、鋭いハサミで小さな切開を加える。 </li><li>腹部または胸部の空洞に穴をあけることを回避しながら切開から始まり、動物の首に皮膚をカット。 </li><li> &quot;Y字&quot;で、その結果、足に向かって正中切開から後脚の皮膚を切り取ります。 </li><li>マウス本体から離れて皮を引き、突き止める、露光乳腺は皮膚の下側（ 図1B）に接続されている。 </li><li>マウスの背に向かって乳腺を区切るには小さな鋭いハサミで結合組織を切断するときに優しく、皮膚から乳腺を区切るには綿棒を使用しています。 </li><li>腹部腺（＃4、5）はこのプロトコルのために最適です。また、第2 回乳腺を使用していますが、これらの腺は、解剖学的に混合した組織由来の細胞で、その結果、分離するのは難しいかもしれません胸筋に近接して配置されていることを念頭に置くことができます。 </li><li>注：腫瘍組織を切開する際には、壊死領域を削除することを推奨します。 </li></ul></li><li> 皮膚組織の解剖：脱毛に対処することなく、皮膚組織を取得する最も簡単な方法は、マウスの耳を使用することです。組織の大規模な量が必要な場合は、マウスの胴体から毛を剃ると肌を分析することができます。 <ul><li> CO 2吸入を使用してマウスを安楽死させる。 </li><li>鋭いはさみを使用して、氷の上でのPBS少量（〜0.5ミリリットル）を含む消化瓶に直ちに耳と場所の両方を遮断する。 </li></ul></li></ol> 2。乳腺/肌単一細胞懸濁液の調製<ul><li>氷の上でPBSの小さなボリュームを含む消化瓶に乳腺/肌を置きます。組織はその後、PBSで洗浄血まみれX2れている場合、そして過剰のPBSを捨ててください。 </li><li>湾曲したハサミで徹底的にミンチ。 </li><li> 20mlのコラゲナーゼ溶液（注​​：コラゲナーゼ溶液のこの量は、効率的に15匹までから乳腺または腫瘍組織と耳の約5グラムを解離する）を追加します。 </li><li> 37にプレートをかき混ぜる時にすぐ℃の水浴を置き、中間速度で攪拌しながら15分間インキュベートする。 </li></ul> 注：他の組織を消化し ​​た場合、最適なインキュベーション時間は変わる場合があります。 <ul><li>反応を停止し、30 mlの冷DMEM + 10％FCSを追加します。 </li><li>組織/メディア混合througを痛める50 mlコニカルチューブの上に置かれヘクタール70μmのセルストレーナー。 </li><li> 4℃で450×gで5分間コニカルチューブを遠心</li></ul> 3。赤血球の溶解 注：それらを屠殺する前にマウスをPBSで心臓潅流した場合は、この手順は必要ありません。 <ul><li>細胞ペレットを乱すことなく、真空に取り付けられたガラスピペットを用いて、上清を吸引します。 </li><li>室温で5分間、10mlのPharmLyse液とインキュベートでRBC、再懸濁した細胞ペレットを溶解する。 </li><li> FACS緩衝液Iの約40ミリリットルを添加して溶液を中和PharmLyse </li><li> 4℃、450×gで5分間細胞でコニカルチューブをスピン</li><li>上清を吸引します。 </li></ul> 4。内因FCのブロッキング<ul><li>オプション：次のステップのために適切なボリュームを確認するには、Count細胞。 </li><li> 1〜3ミリリットルFACS緩衝液Iに細胞を再懸濁します（o応じn個の細胞数、および使用する抗体の量）。 </li><li> 1:50希釈液（10μg/ ml）で到達し、10月20日 &#39;、氷上でインキュベートしFcBlock（抗マウスCD16/CD32）を追加します。 いいえFcBlockを洗い流しする必要はありません。 </li></ul> 5。染色<ul><li>非ステンド制御と単一色コントロール（使用する蛍光抗体の数に応じて）として使用するエッペンドルフチュー​​ブに100μlのアリコートを取り出します。 </li><li>ラベルの線維芽細胞に：1:50（10μg/ ml）を希釈に（フルオロフォアに直接結合）抗PDGFRα追加します。 </li><li>他の細胞集団（ 例えば、免疫細胞、マクロファージ、内皮細胞など）を標識するために：1:50希釈し、表面マーカーに適切な蛍光標識抗体を加える。 </li></ul> 注：PDGFRαは、線維芽細胞のための堅牢なマーカーであるが、それは任意の二重陽性を排除するために免疫細胞や上皮細胞の抗体を含むことが推奨され集団およびこうして孤立した線維芽細胞の純度を高める。 <ul><li>単色コントロールエッペンドルフチュー​​ブのそれぞれに各抗体の2μlを添加する。 </li><li>暗闇の中で氷上で1時間抗体で細胞をインキュベートします。 </li><li>洗浄するには、次のようにFACS緩衝液Iでチューブを記入し、4℃で450×gで5分間スピン</li><li>約2×10 6細胞/ ml、またはいずれかの利用可能なFACS選別機で選別するための最も適切な濃度の濃度になるように私をバッファリングし、FACSで上清を、再懸濁した細胞を吸引します。 </li></ul>オプション：細胞をソーティングの持続時間のために、FACS緩衝液IIに再懸濁させてもよい。これは、細胞の生存率を向上させることができる。しかしながら、血清中の因子への曝露は、テストされ、考慮されるべき効果の遺伝子発現を有することができる。 <ul><li>細胞塊を防止するためのチューブにフィルター細胞：フィルタートップとFACSチューブに標識された細胞を転送します。 </li><li>死細胞を除外するには、7AAD（0.5μg/ ml）を追加したり、プロップサンプルにidiumヨウ化物（PI）（非ステンドコントロールを除く）。 </li></ul>注：セルを無駄にしないように、あなたは、FACSで録音した後、未染色試料に7AAD/PIを追加し、7AAD専用コントロールとして再び使用することができます。 <ul><li>分析しながら、サンプルを氷上で保管してください。 </li></ul> 6。 FACSによる細胞の分離 （注：プロトコルのこの部分は、以前のFACSソーターを動作させるの知識、 例えば BD FACS AriaII、または熟練した技術者の支援が必要です）。 <ul><li> FACSソーターソフトウェア（BD FACSDiva）を使用して、前方散乱（FSC）、側方散乱光（SSC）、7AAD、FITC、PEおよびラベル細胞（ 図2）に使用される任意の他の蛍光色素分子を分析するために、適切な解析プロットを準備します。 </li><li>セルソーターに各サンプルをロードする前に、渦は簡単に細胞を再懸濁する。 </li><li> CELからゲートに、全細胞集団のためのゲーティングを設定するために、無染​​色試料を分析することから始めリットルの破片、および自家蛍光やバックグラウンド染色を決定する。 </li><li>全細胞集団からの生細胞の集団を決定し、ゲートに染色されていないサンプル+ 7AADを分析します。 </li><li>このような補償などのパラメータを決定して、キャリブレーションする各単一カラーコントロールを分析します。 </li><li>並べ替えのためにゲートの位置を定義するために染色されたサンプルを分析します。 </li><li>いったん所望の細胞集団のパラメータとゲートが設定されている、エッペンドルフチュー​​ブまたは培養培地またはRNA溶解緩衝液（例えば、RLTバッファーまたはトリゾールなど）を含む15mlのコニカルチューブにラベルされた細胞集団を選別開始。 </li></ul>注：多数のセルをソートする場合、それは細胞が溶解緩衝液を希釈し、収量を減少させるでしょうに伴うシース液の大きなボリュームとしては、RNA溶解用緩衝液に直接ソートすることは推奨されません。 <ul><li>デ、新鮮な培地またはRNA溶解用緩衝液にソートが終了した直後に、転送ダウン細胞をスピンあなたの実験の目的で保留中。 </li><li>文化単離された細胞への順序でソートする場合は、無菌のソートを実行します。細胞のよりよい回復のために、代わりにFACS緩衝液IIのフェノールレッド不含DMEM +5％FCSを使用し、20％FCSを含む培地に細胞を回収します。 </li><li>培養は、線維芽細胞をソートしたときは、それらの遺伝子発現の変化につながる線維芽細胞の活性化では、この結果として、プラスチックの上にコラーゲンコートしたプレート上alwaysplate、決して直接。 </li></ul>

<ol><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li>
<li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).</li>
<li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
<li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research & therapy. 12, R83Forthcoming.</li>
<li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+mitotic+clock+or+culture+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation%3A+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li>
<li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19(2008).</li>
<li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

組織培養で行われた実験は、有益であるとin vivoで検証することができる機能的な原則を提案することができますが、それは文化11,12中の細胞の遺伝子発現に大きな変化が起こることが知られている。線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの作成時手順組織培養を避けるために、私たちは新鮮なマウスやヒト組織から通常の分離、ならびに癌関連線維芽細胞を可能にするプロトコルを開発しました。このプロトコルは正常マウスとヒトから9時から皮膚、膵臓、乳房組織に適用した。 FACSソーティングにより線維芽細胞の分離は、表面マーカー、ラベルの線維芽細胞を必要とします。我々は、PDGFRαは、線維芽細胞9の高度に濃縮された集団の単離を可能にする堅牢な表面マーカーであることを確立した。また、PDGFRαは、このように公平な分離とプロファイリング組織の線維芽細胞ではなくfocusiを許し、正常組織の線維芽細胞の両方でとCAFSに発現しています特定の亜集団でNG。 線維芽細胞は、マーカー分子の発現に関してだけでなく、その起源とシグ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong試薬の&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント（オプション）</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt;ギブコ</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt;生物産業</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;コラゲナーゼII</td&gt;<td&gt;ワージントン</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;コラゲナーゼIV</td&gt;<td&gt;ワージントン</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;デオキシリボヌクレアーゼ</td&gt;<td&gt;ワージントン</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;セルストレーナー70μmの</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;精製された抗マウスCD16/CD32</td&gt;<td&gt; BDファーミンジェン</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;を介してプローブ（7AAD）</td&gt;<td&gt;電子バイオサイエンス</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アンチマウスCD140a-PE（PDGFRA）</td&gt;<td&gt;電子バイオサイエンス</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アンチマウスF4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM W / Oフェノールレッド</td&gt;<td&gt;ギブコ</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; I型コラーゲン</td&gt;<td&gt; BD Biosciences社</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

蛍光活性化細胞選別（facs）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

癌関連線維芽細胞（CAFS）は、特定の乳癌では、多くの癌の腫瘍間質内で最も顕著な細胞型であり、その卓越した存在は、しばしば予後不良の1,2に関連付けられています。 CAFSは、間質の線維芽細胞の活性化亜集団であり、それらの多くは筋線維芽細胞マーカーのα-SMA 3を発現している 。 CAFSは、地元組織の線維芽細胞からだけでなく、骨髄由来細胞から由来する腫瘍の開発に採用され、腫瘍微小環境4の影響下にCAFの表現型を採用しています。 CAFSは、腫瘍細胞増殖、血管新生、および浸潤5-8を促進し、そのシグナル伝達を介して腫瘍の開始、成長と進行を促進することが示された。我々は、CAFSは早く前腫瘍段階9時から、腫瘍促進炎症を介在することによって腫瘍の成長を高めることが実証された。腫瘍の成長を促進する上で重要な役割をCAFSプレイの増加する証拠にもかかわらず、勉強CAFSは、CAF-特異的なマーカーと腫瘍微小環境10に共存する多くのサブタイプを持つこれらの細胞の広大な異質性の欠如のために継続的な課題となっている。また、in vitroで線維芽細胞を研究し、それらの遺伝子発現プロファイルはしばしば組織培養11,12で変更されているという事実によって妨げられる。この問題に対処するために、新鮮なマウスおよびヒト組織からの線維芽細胞の公平な遺伝子発現プロファイリングを可能にするために、我々は、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）13,14は、前のプロトコルに基づいた方法を開発した。我々のアプローチは新鮮なマウスおよびヒト組織から線維芽細胞を単離するための表面マーカーとしてPDGFRαを利用に依存しています。 PDGFRαは豊富正常線維芽細胞およびCAFS 9,15両方で表される。このメソッドは、正常線維芽細胞およびCAFSの純粋な集団の単離を可能に含むが、α-SMA +活性化筋線維芽細胞に限定されません。隔離された線維芽細胞は、その後することができます特性評価および腫瘍形成時にCAFSで発生し遺伝子発現の進化の比較のために使用される。実際、我々と他の人は16を細胞選別によって単離された線維芽細胞の発現プロファイリングを報告した。このプロトコルは正常皮膚、乳腺、膵臓、肺組織からの線維芽細胞の高度に濃縮された集団を分離し、プロファイリングを行った。また、我々の手法は、機能の実験を行うため、しばしば文化CAFSしようと、大きな障害となっている腫瘍細胞による汚染を避けるために、選別された細胞を培養することができます。

組織の線維芽細胞の高度に濃縮された集団の分離における線維芽細胞の結果のためのマーカーとしてPDGFRαを使用。ポスト·ソート解析（ 図2A）によって定量化と並べ替えの後に純度のレベルは、99％であった。細胞特異的な制御遺伝子の相対的発現（ 図2B）によって、非線維芽細胞を汚染の割合を推定することは、一般的に0.1から0.6パーセントの汚染を示しています。純度のこのレベルでは、孤立した線維芽細胞の9の高品質のトランスクリプトームプロファイリングを可能にします。 乳腺では、組織における線維芽細胞の割合は、正常乳腺組織に5から20パーセント、およびMMTV-PyMT腫瘍の1〜5％の間で変化します。腫瘍組織における線維芽細胞の相対的な割合は上皮区画の大規模な拡大に起因する線維芽細胞の総数は増加したものの、前腫瘍組織の場合よりも低くなります。腫瘍組織から単離された線維芽細胞の減少％もの結果である技術的な難しさを加え、非常に壊死組織から細胞選別の効率を低下させた。 <p class="jove_c...

癌関連線維芽細胞（CAFS）は増殖、血管新生、炎症を促進し、そのシグナル伝達を介して腫瘍の開始、成長と進行を容易にします。ここでは、表面マーカーとしてPDGFRαを使用して、細胞選別により新鮮なマウスおよびヒト組織由来正常線維芽細胞とCAFSの純粋な集団を単離するための方法を説明します。

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

がん関連線維芽細胞（CAF）は、多くの癌、特に乳癌の腫瘍ストロマにおいて最も顕著な細胞型であり、その...

この手順の目的は、新鮮な組織から正常および癌関連線維芽細胞を単離することです。まず、乳腺の解剖を行います。次に、乳腺の単細胞懸濁液を調製し、線維芽細胞特異的抗体および他の細胞集団に特異的な抗体を用いて細胞を回収します。最終ステップは、蛍光活性化細胞分取（FACS）を行うことです。最終的に、分取された細胞集団で発現している特定のマーカーのQ-R-T-P-C-R発現プロファイリングを用いて、分取細胞集団の純度を評価します。線維芽細胞分離の既存手法に対する本手法の主な利点は、免疫細胞や上皮細胞による混入を最小限に抑えつつ、組織線維芽細胞の大部分を分離できることであり、同時に、線維芽細胞の遺伝子発現プロファイルを変化させる可能性のある組織培養ステップを回避できる点にあります。この技術の意義は、すべての乳がん治療に及びます。分子標的を理解し特定することは、乳がんの進行を抑制し、患者の生存期間を延ばし、最終的には個別化された治療オプションの改善と最適化に寄与する、新しい複合的なアプローチを提供する可能性があるためです。ここでは、ラボマネージャーのDr. Lenaが単独で手順を実演します。この手順を開始するには、安楽死させた雌マウスをスチロールフォームの表面に仰向けに置き、25ゲージの針を使用して四肢をしっかりと固定します。ピンセットでマウスを固定し、70% ethanolを十分にスプレーします。腹部正中線の皮膚を引き上げ、鋭い鋏で切開を開始し、小さな切開口を作ります。腹腔および胸腔を穿刺しないように注意しながら、動物の頸部まで皮膚を切開します。後肢の皮膚を、正中線の切開線から脚に向かって切り、Y字型にします。次に、皮膚をマウスの体から剥がしてピンで固定し、皮膚の裏側に付着している乳腺を露出させます。この手順で最も困難な点の一つは、筋肉組織を一緒に採取しないようにすることです。この問題を避けるため、筋肉組織に近接している第2乳腺は採取せず、第4および第5乳腺のみを採取します。綿棒を用いて乳腺を皮膚から慎重に剥離させ、同時に小さな鋭いハサミで結合組織を切断して、乳腺をマウスの脊椎方向へと分離させます。壊死している領域が見つかった場合は、それらを除去してください。摘出した乳腺は、氷上のPBSに浸します。除毛の手間を省いて皮膚組織を採取する最も簡単な方法は、マウスの耳を使用することです。安楽死させたマウスから、鋭利な鋏を用いて両耳を切り取ります。切り取った耳は、直ちに氷上の少量のPBSを入れた消化ジャーに入れてください。乳腺単一細胞懸濁液を調製するには、氷上の少量のPBSを入れた消化ジャーの中で、曲剪刀を用いて乳腺を十分に細切し、細切した組織に20 millilitersのコラゲナーゼ溶液を加えます。この量のコラゲナーゼ溶液で、最大15匹のマウスから採取した約5 gramsの乳腺または腫瘍組織および耳を効率的に解離させることができます。直ちに37 °Cの恒温水槽内のスターラープレートに置き、中速で撹拌しながら15分間インキュベートします。その後、30 millilitersの冷 DMEM（10% FCS添加）を加えて反応を停止させます。次に、組織と培地の混合液を、50 mLコニカルチューブの上に設置した70 µmセルストレーナーでろ過します。コニカルチューブを4°C、450 ×gで5分間遠心分離します。殺処分前にPBSによる心灌流を行っていないマウスの場合、免疫染色の前にサンプル中の赤血球を溶血させる必要があります。線維芽細胞およびその他の細胞集団を標識する前に、内因性Fc受容体をブロッキングする必要があります。細胞を1〜3 mLのfax buffer oneに再懸濁し、Fc blockを1:50に希釈して加え、氷上で10〜20分間インキュベートします。Fc blockを洗浄して除去する必要はありません。100 µLずつ細胞分注し、未染色コントロールおよびシングルカラーコントロールとして使用するエッペンドルフチューブに移します。本デモンストレーションで使用する蛍光抗体の数に応じて、2種類の蛍光抗体を用いて線維芽細胞のanti PDGF receptor alphaをラベルします。これは1:50の希釈倍率で蛍光色素に直接標識されており、ソート用サンプルおよび他の細胞集団をラベルするためのシングルカラーコントロールに使用します。また、表面マーカーに対する適切な蛍光標識抗体も同様に1:50の希釈倍率で添加します。適切なシングルカラーコントロールチューブにも抗体を添加してください。ダブルポジティブ集団を除外して、単離される線維芽細胞の純度を高めるために、免疫細胞および上皮細胞に対する抗体の添加を推奨します。次に、抗体とともに細胞を氷上で暗所にて1時間インキュベートします。1時間後、チューブに FACS buffer 1 を満たし、4°C、450 ×g で5分間遠心分離して細胞を洗浄します。上清を吸引し、使用する FACS ソーターでのソーティングに最も適した濃度になるよう、FACS buffer 1 で細胞を再懸濁します。ラベル化した細胞をフィルターキャップ付きの FACS チューブに移し、細胞塊を除去するためにフィルターを通してチューブに分注し、死細胞を除外します。未染色のコントロールを除くすべてのサンプルにDPIを添加します。 FACS解析中は、サンプルを氷上に保持してください。この手順を開始するには、 FACSソーターのソフトウェアを使用して、蛍光設定、取得設定、および流体力学的液滴設定を準備します。セルソーターにロードする前に、各サンプルを短時間ボルテックスして細胞を再懸濁させます。まず、未染色サンプルを解析し、細胞デブリを除去するための全細胞集団のゲーティングを設定し、自家蛍光またはバックグラウンド染色を確認します。次に、未染色サンプルにDPIを加えたものを解析し、全細胞集団から生存細胞の集団を決定し、ゲーティングします。各単色コントロールを解析し、コンペンセーションなどのパラメータを決定および校正します。染色サンプルを解析し、ソーティングのためのゲート位置を定義します。目的の細胞集団に対するパラメータとゲートが設定されたら、標識された細胞集団を、培地またはRNA溶解バッファーを入れたeppチューブまたは15 milliliterコニカルチューブにソーティングします。ソーティング終了後、直ちに細胞を遠心分離して回収し、新鮮な培地またはRNA溶解バッファーに移します。実験目的に応じて、ソーティングした線維芽細胞を培養する場合は、必ずコラーゲンコートプレートに播種し、プラスチック上に直接播種しないでください。直接播種すると線維芽細胞が活性化し、遺伝子発現が変化するためです。線維芽細胞のマーカーとしてPDGF受容体αを用いることで、組織線維芽細胞を高純度に濃縮した集団を単離できます。この例では、マウス乳腺の単一細胞懸濁液をPDGF受容体alphaおよびF4/80抗体で染色しました。左側のパネルにFACSortingプロットを示しており、P2が線維芽細胞のゲート、P4がマクロファージのゲートです。ソート後の解析を行い、右パネルに示すソート済み線維芽細胞および中央パネルに示すマクロファージの純度を決定しました。次の図は、線維芽細胞、免疫細胞、および上皮細胞の細胞特異的コントロール遺伝子をQ-R-T-P-C-Rで解析し、ソースの純度を評価した結果を示しています。結果は2つのハウスキーピング遺伝子であるga, DHおよびmgusで標準化し、gapに対する相対発現量として示しています。通常、このような解析では0.1〜0.6%の混入が認められます。この純度により、単離した線維芽細胞の高精度なトランスクリプトームプロファイリングが可能になります。未分取の乳腺線維芽細胞集団におけるPDGF受容体αの発現量を定量化したところ、乳腺内の全組織線維芽細胞の約85%がPDGF受容体α陽性であることが示されました。私は単離しました。線維芽細胞は分取直後に培養することが可能ですが、回復に数日かかる場合があります。初代線維芽細胞は継代中に細胞老化を起こすため、以降のすべての実験は低継代の細胞を用いて行うことが不可欠です。培養において、この手法に習熟し、適切に実施すれば、4時間で完了させることができます。分離した細胞を培養する場合は、すべての手順を無菌条件下で行うことが重要です。この撮影では、無菌操作は行っていません。このビデオを視聴することで、新鮮な組織から高純度の線維芽細胞集団を単離する方法について十分に理解できるはずです。

isolation-normal-cancer-associated-fibroblasts-from-fresh-tissues

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生物学

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標的ナノ粒子の研究のための乳癌の同質性マウスモデルからの原発癌関連線維芽細胞の分離

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3D多細胞肺腫瘍スフェロイドから分離された癌関連線維芽細胞におけるミトコンドリアの健康評価

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学ぶFACSを用いてマウスおよびヒトの新鮮組織から正常線維芽細胞と癌関連線維芽細胞を高純度に分離する方法。PDGFRαを表面マーカーとして使用し、免疫細胞や上皮細胞の汚染を最小限に抑えつつ、培養による遺伝子発現変化を回避できます。

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

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