マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

本手順の目的は、フローサイトメトリー（fluorescence activated cell sorting）を用いて、ヒトリンパ管奇形および前皮のリンパ管を構成する高純度のリンパ管内皮細胞を単離することである。まず、患者の組織サンプルを酵素的に消化させる。次に、得られた単一細胞懸濁液を培養し、リンパ管内皮細胞の数を増強させる。

サンプル中で、細胞は目的の細胞表面マーカーに対する抗体で標識され、マルチパラメーター蛍光活性化細胞分取（FACS）を用いて分取されます。最終的に、前皮およびリンパ管奇形由来のリンパ管内皮細胞は、さらなるダウンストリーム解析のために細胞培養で増殖させることが可能です。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、フローサイトメトリー（FACS）による細胞分取で99%以上の純度の細胞が得られ、混入細胞の過増殖によるリンパ管内皮細胞の喪失に伴う問題を回避できることです。まず、抗生物質・抗真菌剤溶液を添加した10 mLの培地を含む50 mLチューブを計量します。次に、リンパ管奇形または前腕皮膚のサンプルをチューブに移し、再度チューブを計量して組織の重量を決定します。

次に、クラス2バイオセーフティキャビネット内で、滅菌済みのピンセットを用いて組織と培地を100 mmの組織培養皿に移し、滅菌済みのハサミで切断します。最後に、組織を1 mm³の大きさに細切にします。その後、これらの断片を、10 mLの新鮮な抗生物質・抗真菌剤入り培地が入った50 mLチューブに移します。

チューブを数回かき混ぜて組織を再懸濁させた後、サンプルを遠心分離します。上清を除去し、細切した組織100 mgあたり1 mLの予熱した消化液を加え、37 °Cのインキュベーター内で200 RPMで定速振盪しながら組織をインキュベートします。リンパ管内皮細胞を効率的に濃縮させるためには、細胞がコラゲナーゼおよびDNase反応に十分にさらされ、かつ分離工程で生存できる適切なタイミングを判断することが極めて重要です。

これは、組織消化プロセスを慎重にモニタリングし、ほとんどの組織が微細な断片に消化された時点で反応を停止させることで達成されます。インキュベーションの終了時に、ほぼすべての組織が小さな断片に消化されていることを確認し、組織スラリーを70 micronストレーナーでろ過して、滅菌済みの50 milliliterチューブに回収します。次に、ゴムプランジャー付きの3 milliliterシリンジピストンを使用して、細胞外マトリックスのわずかな痕跡しか観察されなくなるまで、残った組織をすり潰します。

次に、解離酵素培地と同量の血管内皮細胞培地でセルストレーナーを洗浄し、細胞を遠心分離して回収します。検体の大きさに応じて、最大20 mLの血管内皮細胞培地でペレットを懸濁させます。その後、細胞数をカウントし、フィブロネクチンでコーティングした150 cm²のフラスコに、血管内皮細胞培地最終容量20 mLで2 × 10⁶個の細胞を播種し、一晩培養します。

翌朝、抗生物質・抗真菌剤溶液を添加したPBSで3回洗浄し、未結合の細胞を除去します。次に、リンパ管内皮細胞の数を増やすため、新鮮な内皮細胞培地を細胞に添加し、コンフルエント率が約80%になるまで5～7日間培養します。その後、マルチパラメーター蛍光活性化細胞分取（FACS）によるソーティングに向けて、細胞を染色します。

まず、細胞培地を除去し、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、37°Cで5～7分間インキュベートした後、剥離液7 mLを添加します。解離した細胞を回収し、3倍量の血管内皮細胞培地で酵素を不活化させ、細胞懸濁液を滅菌チューブに移します。

細胞を3回遠心分離し、2回目と3回目の遠心後のペレットを5 mLのPBSで洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを5 mLの新鮮なPBSに再懸濁し、トリパンブルー排除法により生存細胞数を計測します。細胞計測後、

無菌的に細胞をフローサイトメトリー用染色チューブに移し、遠心分離して細胞を沈殿させ、非特異的結合をブロックします。細胞を5%F-B-S-P-B-Sに再懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。ブロッキング後、遠心分離を行い、上清を除去して再懸濁します。

ペレットをCD 34、CD 31 potaninおよびVEGF receptor three抗体カクテルに懸濁します。氷上で20分間静置した後、細胞を2 mLのF-B-S-P-B-Sで3回洗浄して未結合の抗体を取り除き、再懸濁します。ペレットを氷上で300 µLのF-B-S-P-B-S溶液中のプロピジウムイオダイドに懸濁します。

最後に、精製したヒトリンパ管内皮細胞をマルチパラメータ蛍光活性化細胞分取装置でソートします。次に、ソートした細胞を遠心分離し、細胞培養の播種に適した培地でペレットを再懸濁します。ここでは、podoplaninに対する抗体で標識された正常なヒトリンパ管およびリンパ管奇形血管が示されています。ヒトリンパ管奇形血管内における著しい拡張と、管腔サイズの大きな変動に注目してください。

実際、分画していないサンプルにおいて、最初の組織消化および24時間の培養後、ほとんどのリンパ管奇形には、小型または微小嚢胞状および大型または大嚢胞状の両方の異常な嚢胞構造が含まれています。ソーティング後さらに24時間細胞培養を行うと、線維芽細胞様細胞や平滑筋細胞に加えて、明確な血管内皮細胞コロニーが観察されます。しかし、CD 34低発現、CD 31陽性、VEGF受容体3陽性のポドプラン陽性細胞は、培養容器に付着し、これらの画像で観察される典型的な石畳状の形態を示します。

このビデオを視聴することで、蛍光活性化細胞分取（FACS）を用いて、ヒトリンパ管奇形および皮膚のリンパ管を構成するリンパ管内皮細胞を高純度で単離する方法について深く理解することができます。ヒト一次組織の取り扱いは、人体に有害な感染剤が含まれている可能性があるため、危険を伴う場合があることに留意してください。本手順を実施する際は、手袋、保護メガネ、白衣の着用など、標準的な予防策を常に講じてください。