マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

この手順の全体的な目標は、蛍光活性化細胞選別を使用して、ヒトリンパ奇形および包皮のリンパ管を覆う高純度リンパ内皮細胞を単離することです。これは、まず患者の組織サンプルを酵素的に消化することによって達成されます。第2ステップでは、単一細胞懸濁液を培養して、リンパ管内皮細胞の数を濃縮します。

サンプルで。次に、細胞を目的の細胞表面マーカーに対する抗体で標識し、マルチパラメーター蛍光活性化細胞ソーティングを使用してソーティングします。最終的に、包皮およびリンパ奇形、リンパ内皮細胞を細胞培養中で増殖させ、さらに下流の分析を行うことができる。

この手法が既存の方法よりも優れている点は、蛍光活性化セルソーティングにより細胞の純度が99%を超え、細胞の汚染による過剰増殖によるリンパ内皮細胞の損失に伴う問題を回避することです。まず、10ミリリットルの培地が入った50ミリリットルのチューブに抗生物質の抗真菌薬溶液を補充します。次に、リンパ奇形または4つの皮膚サンプルをチューブに移し、チューブを再度計量して組織の重量を決定します。

次に、クラス2のバイオセーフティキャビネットで、滅菌鉗子を使用して、滅菌ハサミを使用して組織と培地を100ミリメートルの組織培養皿に移します。最後に、組織を1立方ミリメートルの小片に刻みます。次に、10ミリリットルの新鮮な抗生物質抗真菌薬が入った50ミリリットルのチューブに小片を移します。中程度。

チューブを数回回転させて組織を再懸濁し、サンプルをスピンダウンします。上清を除去した後、ミンチ組織100ミリグラムあたり1ミリリットルの予熱消化液を加え、200RPMで絶えず振とうしながら摂氏37度のインキュベーターで組織をインキュベートしますリンパ内皮細胞の濃縮に成功します。細胞がコラゲナーゼ反応と空間異常反応に十分に曝露されたことを認識して、単離を生き残ることが重要です。

これは、組織消化プロセスを注意深く監視し、ほとんどの組織が微細な断片に消化されたときに反応を停止することによって達成されます。インキュベーションの終了時に、ほぼすべての組織が小さな断片に消化されたことを確認し、組織スラリーを70ミクロンのストレーナーでろ過して滅菌済みの50ミリリットルチューブに入れます。次に、ゴム製プランジャー付きの3ミリリットルのシリンジピストンを使用して、細胞外マトリックスの小さな痕跡のみが観察されるまで残りの組織を粉砕します。

次に、解離酵素培地の容量と同等の容量の内皮細胞培地で細胞ストレーナーを洗浄し、細胞reusをスピンダウンします。ペレットを最大20ミリリットルの内皮細胞培地に懸濁します(標本サイズにもよりますが)。次いで、種子を計数した後、フィブロネクチンで予めコードされた150平方センチメートルのフラスコに10〜6個の細胞を2回10回、最終容量20ミリリットルの内皮細胞培地で一晩培養する。

翌朝、抗生物質の抗真菌薬溶液を補充したPBSを3回すすいで、結合していない細胞を洗い流します。次に、リンパ内皮細胞の数を増やすために、新鮮な内皮細胞培地を細胞に加え、培養物が約80%コンフルエントになるまで5〜7日間培養物をインキュベートします。マルチパラメータ蛍光活性化細胞ソーティングによるソーティングのために細胞を染色します。

まず、細胞培地を取り出し、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、摂氏37度で5〜7分間インキュベートした後、7ミリリットルの剥離溶液を追加します。解離した細胞を回収し、3容量の内皮細胞培地で酵素を不活性化し、細胞懸濁液を滅菌チューブに移します。

細胞を3回遠心分離し、ペレットを5ミリリットルのPBSで洗浄し、最後の洗浄後の2回目と3回目のスピンを行います。ペレットを5ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、トライアンブルーの排除によって生細胞の数を数えます。細胞カウントに続いて。

細胞をフローサイトメトリー染色チューブに無菌的に移し、細胞をスピンダウンして非特異的結合をブロックします。細胞を5%F-B-S-P-B-Sに再懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。遠心分離機をブロッキングした後、細胞は上清を取り除き、蘇生します。

ペレットをCD 34、CD 31ポタニンおよびVEGF受容体3抗体カクテルに懸濁する。氷上で20分後、細胞を2ミリリットルのF-B-S-P-B-Sで3回洗浄し、未結合の抗体を除去して蘇生します。ペレットを氷上のF-B-S-P-B-S溶液中の300マイクロリットルのヨウ化プロピジウムに懸濁します。

最後に、精製したヒトリンパ内皮細胞をマルチパラメータ蛍光活性化細胞選別装置で選別します。次に、選別した細胞をスピンダウンし、ペレットを細胞培養播種に適した培地に懸濁します。ここでは、正常なヒトリンパ管およびリンパ奇形血管をポットデプレーンに対する抗体で標識した血管が示されており、ヒトリンパ奇形血管内の顕著な拡張およびかなりの内腔サイズの変動に注意してください。

実際、ほとんどのリンパ奇形には、最初の組織消化と未分画サンプルでの24時間の培養後の小さなまたは微小の嚢胞性および大きなまたは大嚢胞性の異常な嚢胞性構造の両方が含まれています。選別後、さらに24時間後に、線維芽細胞様細胞および平滑筋細胞に加えて、明確な内皮細胞コロニーが観察されます。しかし、CD34は、低CD31陽性VEGF受容体3つの陽性ポド面および培養容器に付着した陽性細胞であり、これらの画像で観察される典型的な丸石の形態を示す。

このビデオを見れば、蛍光活性化細胞ソーティングを使用して、ヒトリンパ奇形および全皮膚リンパ管の内側を覆うリンパ内皮細胞を高純度で単離する方法を十分に理解できるはずです。一次ヒト組織を扱うことは、人間の健康に有害な感染性物質が含まれている可能性があるため、危険である可能性があることを忘れないでください。この手順を実行するときは、手袋、保護メガネ、実験用ガウンの着用などの標準的な予防措置を常に講じる必要があります。