Name: 胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: 学ぶ Xenopus胚の割球単離培養法による細胞運命決定機構。内在性因子と外在性シグナルの寄与を区別し、発生生物学の基礎を解明する重要な実験手法です。

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著者はモナヘロルドのサポートのためのPaaquaグラントとGWUルーサーライスフェローシップのサポートのためGWUハーラン·フェローシップを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団助成MCB-1121711によってサポートされていました。

1。器具、培地や料理の準備<ol><li>アルミナ研磨フィルムを使用して4鉗子を強めています。チップサイズを監視するために解剖顕微鏡下でこれを行います。先端が処置中に損傷している場合には鉗子1組のバックアップとして機能します。すべての4つの鉗子をオートクレーブ滅菌した容器に保管してください。 </li><li> （; 15のレシピどちらMarcの修正リンガー[MMR]または改変バルトの生理食塩水[MBS]）とフィルター滅菌500ミリリットル0.1Xと1.0X培地のそれぞれを確認します。我々は日常的にMBSを（; 1のKCl、0.7 mMのCaCl 2、1mMののMgSO 4、5mMのHEPES [pHが7.8]、2.5 mMのNaHCO 3を 1X = 88 mMのNaCl）を使用します。ヶ月間の14から18℃で保存する。 </li><li>培養液中の2％アガロース溶液（スクリューキャップのガラスボトルで100ミリリットル1X培地で2グラム電気泳動グレードアガロース）を作る。アガロースを溶解するためにオートクレーブ。これは、月間4℃で保存し、それが次の必要なときにアガロースを液化するために電子レンジにすることができます。 </li><li>アガロースは液体ですが、滅菌24穴培養プレートの各ウェルの底に約0.5ミリリットルを注ぐ。これはプラスチックに付着する外植片を防ぐことができます。 </li><li>アガロースは液体ですが、二から三60ミリメートルペトリ皿の底に約2-3ミリリットルを注ぎ、そして渦巻きは優しく底が覆われていることを確認する。これらは、解剖皿となるとその膜が除去された後、アガロースは、プラスチックに付着胚を防ぎます。 </li><li>アガロースを冷却し、硬化、火炎6 &quot;パスツールピペットの先端を、それがボールに溶けるまで、軽く培養プレートの各ウェルにおけるアガロースの表面に接触させてください。これは、先の浅いうつ病が作成されたとき植が配置されます。 </li><li> 1X無菌培養培地で培養プレートの各ウェルを埋める。 </li><li>アガロースが冷却し、硬化したときに、割球分離を容易にするために希釈された培養液（0.1X MMRまたは0.1X MBS）と解剖皿を埋める。 </lI&gt; </ol> 2。胚の選択<ol><li>受精卵を取得し、標準的なプロトコル15に従ってゼリーコートを除去する。 100ミリメートルペトリ皿に0.5X培地に移す。 </li><li>胚は2細胞期に達すると、最初の分裂溝が別の皿に動物半球（ 図1）で軽く色素沈着面積を二等分したものをソートする。これらは、外植片のドナーになります。外植片を上演する兄弟コントロールとして機能するための手順を通してドナー胚の隣に別の皿に残りの2細胞期胚を保管してください。 </li></ol> 3。外植片の作製<ol><li>解剖皿に5月10日胚を置くのではなく、一度に1つの胚に取り組んでいます。 </li><li>透明卵黄膜が見られるように、最初の胚を置き、それは、胚の動物極の表面上に透明な空間（腔）で区切られています。尖った力を利用して1のサブドミナントの手（1が右利きされている場合は左手）のps、腔上記の卵黄膜を把握する。一方で削った鉗子を使用して、最初の鉗子先端に近い膜を持ち、静か膜剥がれ反対方向に引っ張る。標的細胞は、膜の除去の際に破損していないので、解剖するセルからの距離で初期把握を行います。一つは、胚が平らになるため、膜が除去されたことを伝えることができます。 </li><li>サブドミナント手にピンセットで1隣接セルをつかんで、解剖すべきセルが直接触れないように &quot;ハンドル&quot;としてこのセルを使用しています。一方で鉗子で、優しく希望の割球から離れて残りの隣接セルを引っ張る。同じ運命を共有して正中線細胞は、標的にされている場合は、それらがペアとして一緒に削除することができます。最後に、 &quot;ハンドル&quot;のセルを離れて解剖する。 </li><li>滅菌済みの割球（または割球ペア）、拾う、ガラスパスツールピペット、気泡や過度の吸引を避ける。ピペットは、細胞に損傷を与えることができますが、我々が日常的にこれをしないシャープなエッジを除去するために火を研磨することができる。外植片培養皿のウェル中の培地の表面の下にパスツールピペットの先端を置き、静かに割球を追放。それは、重力によって浅いくぼみにスライドしなければなりません。複数の胚から割球は、同じ単植に結合することができます。 </li><li>一つずつ、解剖皿の残りの胚では、この手順を繰り返します。約10胚の後、解剖皿細胞の残骸で満たされるでしょう。この現象が発生した場合、新鮮な解剖皿に変更します。 </li><li>すべての解剖が行われた後、外植片が浅いくぼみにあるかどうかを確認。しない場合、それらは静かに乾燥させ、70％エタノールと空気中で滅菌された毛のループを使ってうつ病に押し込むことができます。 </li><li>最後の郭清後の約一時間、デブリsurrouを削除滅菌、ガラスパスツールピペットで癒さ植片をnding。 </li><li>兄弟、制御の胚を含むペトリ皿に14から20°Cの隣での培養外植片の板を。兄弟の胚は、割球の外植片の発展段階を示すでしょう。 </li></ol> 4。分析のための収穫植<ol><li>兄弟姉妹が希望発達段階に到達したときに外植片を回収します。細胞の一部が崩壊した場合でも、これらの外植片はかなりうまく生き残る。文化の中で曇りの質量が十分に存在する場合、したがって、健康な植が内に埋設されているかどうかを判断するために毛のループまたは鉗子でそれを探る。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いて培養液を少量の外植片を拾うと、優しく行われるアッセイのための適切な固定剤または溶解バッファにそれらを追放する。 </li></ol>

<ol><li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li>
<li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li>
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<li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li>
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<li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li>
<li>Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs%3A+an+early+step+in+embryonic+axis+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li>
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<li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ほとんどの個々の割球の培養に成功するための重要なステップは次のとおりである：1）正常に関心の割球を識別する、2）滅菌した、健全な文化を維持すること、3）細胞周期の正しい部分の解剖細胞、​​4）必要なマニュアルを開発解剖や文化への転送だけでなく時の損傷を防止するための器用さ。 特定の割球を操作するには、カーディナルの軸を識別できることが不可欠です。 アフリカツメガエル胚では、背側には、3つの方法によって同定することができます：（1）生体色素18,19と精子のエントリポイントをマーキングし、（2）in vitroでの転倒が卵を受精し、片側18、19をマーク、または（3）第一分裂溝が動物半球20,21で軽く着色された地域を二分した2細胞期胚の間を選択する。我々は正確に自然にfertilizから割球を識別する第3の方法を使用します例20、21の約90％のED 16細胞期胚。受精時、動物半球の色素沈着は、背動物領域が胚の大部分（ 図1）...

アフリカツメガエルの胚は、その卵が顕微鏡のアプローチを可能にするのに十分な大きさであるため、胚細胞がその特定の運命を獲得するメカニズムを識別するために広く利用されてきた。各セルには固有エネルギーストアを提供卵黄血小板の豊富な細胞内の供給が含まれているため、さらに、彼らは、培地の栄養補給を必要とすることなく、外部から開発しています。 1、2、3、4、5、6 -細胞の運命が決定されるメカニズムを研究するための重要な資産は、（32セルステージ2〜から）卵割期の割球の運命マップの包括的なセットです。これらのマップは、組織が標識された子孫が移入され、開発の後半にある単一の識別可能な割球および監視に検出可能な分子をマイクロインジェクションすることにより構築した。胚の枢機卿軸は確実に多くのエンブリーで同定することができるため、一貫性のある運命のマップが可能ですOS。植物半球ではないのに対し、第一に、すべての野生型胚において動物半球は、色素沈着です。第二に、受精時の精子のエントリは、将来の腹側に向かって動物半球の色素沈着の収縮を引き起こし、多くの胚では色素沈着の差が故に背側と腹側の側面を区別するために使用することができます。第三に、第一分裂溝は、ほとんどの胚における半ば矢状面を近似し、その結果胚の左右を識別するために使用することができます。運命マップも胚の大規模な人口全体の各割球が識別できるように規則的なパターンで自然に受精卵が頻繁に開裂するという事実に依存しています。内および色素沈着および切断パターンに関する卵のクラッチの間にばらつきがあるが、本明細書に記載の選択手順を使用すると、所定の運命を有する細胞が約90％の精度で識別することができます。 細胞の運命が決定することができますいくつかのメカニズムで胚発生時の採掘。そのような差別的継承細胞質mRNAまたはタンパク質などの本質的な要因は、早期のパターニングのいくつかの側面に貢献しています。たとえば、特定の母性mRNAは細胞は、生殖系列に寄与する内胚葉になったり、背側体軸（7日）に寄与するかを決定します。胚の情報伝達の中心から隣接セル以上の遠縁でローカルに提供外因性の要因は、ほぼすべての臓器系の特定の組織の種類とパターン形成を誘導するための責任を負うものとします。シグナリングセンターの例には、神経外胚葉と中胚葉のパターンを誘発原腸胚におけるオーガナイザー/ノード、および肢芽のパターンは前後軸という活動を偏光の帯があります。運命マップが異なる器官の前駆体を識別し、正常な胚でその子孫によって取ら発達経路を明らかにするが、それらは本質的な区別はできませんそして、それらの細胞に外因性の影響。彼らはまた、子孫胚の複雑な信号環境において分化細胞の完全な発達の可能性を明らかにしない。で培養した胚に由来する細胞の除去または2）;小説胚の場所に）1細胞の移植：2つの実験的なアプローチは、細胞の運命は、内因性の要因によって決定されたか、後に外部の要因によって影響されているかどうかをテストすることができます外因性シグナルの不在。 細胞が手動で分離するのに十分な大きさであるため、両方の実験的なアプローチは、 アフリカツメガエルで実現可能となっている。たとえば、多くの研究は、運命の変更（7日、8、9）をテストするために宿主胚における新規の場所に胚（細胞間相互作用を変更する場合）または移植された細胞からの単一細胞を削除しました。さらに、胚の異なる領域から細胞の数が少ないexplantingの第二のアプローチIアフリカツメガエル胚の細胞は、細胞内の栄養素ストア、卵黄血小板で埋められるため、外因性因子の非存在下で誘導組織の相互作用を解明するNTOの培養が可能です。したがって、彼らは、培地の栄養や成長因子の補充なしで定義された塩培地で数日間培養することができる。私たちは、その背の動物の球が母性遺伝mRNAが10、11に起因する神経と背側中胚葉組織を生成するために自律的能力を持っており、他は32細胞割球と中胚葉の仕様では、内因性及び外因性情報12の両方に依存して認められた表示するには、このアプローチを使用していた。外植体として、細胞を培養することの利点は、媒体は、外植セル12、13、14の運命に影響を及ぼす可能性のある細胞間の通信経路を決定するために定義されたシグナル伝達因子を補充することができることである。また、1割球はPRを注入することができます内因性mRNAの翻訳を防止するために過剰発現するmRNAの遺伝子を持つ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​用いた文化にIOR。これらは、ゲインとロス·オブ·機能解析は、自律的に発現して運命のために必要とされる分子を識別することができます。外植片の運命を分析するには、特定の細胞種の同定は標準の遺伝子発現（ 例えば、in situハイブリダイゼーション 、RT-PCR）と免疫細胞化学的ア ​​ッセイにより行うことができる。このプロトコルは、胚細胞が特定の組織に発展する方法を制御内因性および外因性のメカニズムを区別するための簡単​​かつ強力な方法を提供します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-38 </td><td>鉗子先端部の大規模修繕のためのコース（12μm）であり、 </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-46 </td><td>鉗子先端のシャープ罰金のための媒体（3μm）を、 </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-54 </td><td>鉗子先端の研磨のためのファイン（0.3μm）を、 </td></tr><tr><td>鉗子：デュモン、Dumoxel Biologie＃5 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> ＃11252から30 </td><td>これらは、最初の購入時に鮮鋭化を必要としない微細なヒントがあります。耐腐食性、彼らがそうすることができるので、オートクレーブする。 </td></tr><tr><td>ゲンタマイシンソリューション</td><td>シグマ</td><td> G1397 </td><td>使用と同じ日に培地に入れる</td></tr></tbody></table>

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

胚の細胞のすべてをトレース系統から構築運命マップは、組織は、胚の各セルから派生しているが明らかになった。運命マップは臓器の前駆体を識別するための、子孫細胞は正常な胚に、その臓器を移植それによって発達経路を解明するために非常に有用であるが、それらは、前駆細胞の完全な発達の可能性を説明したりするメカニズムを特定することはありませんその運命が決定される。細胞運命のコミットメントをテストするためには、実験的操作後に発現したものと無傷の胚（運命マップ）に子孫の細胞の正常なレパートリーを比較します。細胞の運命は、周囲の細胞環境にかかわらず、（コミット）が固定され、またはそのネイバーが提供する外部要因によって、それに影響を与えていますか？ アフリカツメガエル胚の包括的な運命マップを使用して、我々が識別する方法について説明し、隔離し、文化の単一卵割期の前駆体、blasto呼ばミアズ。このアプローチは、1つは、これらの初期の細胞は、彼らがそれらの隣接細胞との相互作用を必要とし、無傷の胚内でそれらの通常の環境で取得運命にコミットしている、または他のタイプの信号にさらされた場合、代替の運命を表現するために影響を受ける可能性があるかどうかを評価することができます。

正確に細胞の発生能を評価するために、このアッセイの能力は運命マップ1、2、3、4、5、6に基づいて、適切な割球を解離に依存している。したがって、それは続いて、 図2に示すように、定期的な切断パターンに準拠し、 図1に示すように、2細胞期に正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択することが重要です。一つは、彼らが必要な切断段階に達するようにソート胚を観察し、不規則な開裂を示す胚を分離した場合、精度が大幅に向上します。 図2に示すように、定期的な開裂はしばしば唯一胚の片側に起こります。ドナー細胞は、 &quot;通常&quot;側から発信された場合、これらの胚は、ドナーとして使用することができます。あなたが解剖するつもりのようなので定期的な切断パターンは、多くの胚を5倍程度の細胞分裂が進行し、ソートのような少数の胚で発見されています。当然Fertilized卵は体外受精卵よりも定期的な開裂を持っている傾向がある。切断パターンは、卵のシングルクラッチ内でかなり変化しますが、1は、操作のこの...

個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。

胚のすべての細胞の系譜追跡から構築される運命地図は、胚の各細胞からどの組織が分化するかを明らかにします。運命地図は…

このビデオで示す方法は、卵割期のウニ胚の運命地図を利用して、単一の胞胚細胞を単離培養し、胚の分化が内因的な指令によるものか外因的な指令によるものかを評価するものです。まず、最初の卵割溝が動物極半球の淡色領域を二分している2細胞期の胚を回収します。これらの胚を培養し、胚が16〜32細胞期に達した時点で、卵膜を除去し、選択した細胞から隣接する細胞を解剖して取り除きます。その後、解剖した胞胚細胞をアガロースコーティングされた培養ウェルの窪みに移し、培養します。外植片が目的の段階に達したら、これを回収し、in situ ハイブリダイゼーション、QPCR、または免疫組織化学を用いて遺伝子またはタンパク質の発現を評価します。培養や、大量の胚細胞あるいはオルガノイドを用いた他の手法と比較したこの技術の大きな利点は、リネージトレーシング研究によって分化運命が判明している単一の胚芽細胞を、増殖因子の添加や隣接細胞の存在なしに培養できる点にあります。したがって、細胞固有の因子がその細胞を特定の組織の前駆細胞へと誘導するのか、あるいは周囲の細胞からのシグナルが必要なのかを直接的に検証することが可能です。Blairsの解剖および培養ウェルへの移送には、実体顕微鏡下での繊細な操作が必要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。本ビデオでは、母性由来のmRNAが細胞を神経分化へと誘導するかどうかを検証するために、この手法を用いて実体顕微鏡下での操作を実演します。Illumina社製研磨フィルムを用いて、4組のピンセットを研磨してください。ピンセット1ペアは、手順中に先端が損傷した場合の予備として使用します。4本のピンセットすべてをオートクレーブし、滅菌容器に保管してください。0.1xおよび1.0xの修正バース生理食塩水（MBS）をそれぞれ500 milliliters作成し、フィルター滅菌します。これらの溶液は、ガラス製のスクリューキャップボトルに入れ、14 to 18 degrees Celsiusで数ヶ月間保存してください。100 millilitersの1X培地を用いて、2%の電気泳動グレード agarose を調製します。オートクレーブで agarose を溶解させ、次に使用する際は、agarose が液状である間に電子レンジで液状化させてください。滅菌済みの24ウェル培養プレートの各ウェルの底に、約0.5 millilitersを注ぎます。これにより、インプラントがプラスチックに付着するのを防ぎます。次に、2〜360 millimeterのペトリ皿2枚の底に約2〜3 millilitersを注ぎ、軽く回して均一に分散させます。これらは解剖皿として使用し、アガロースによって胚がプラスチックに付着するのを防ぎます。胚の膜を除去した後、アガロースが冷却され固まったら、6インチのパスツールピペットの先端を炎で加熱して球状に溶かします。その球状部分を短時間再加熱し、培養プレートのウェル内にあるアガロースの表面に軽く触れさせます。これにより、X explanを配置するための浅い窪みが形成されます。プレートの各ウェルでこの操作を繰り返します。次に、培養プレートの各ウェルに、1 x 滅菌培養液を1 mLずつ満たします。次に、胚盤胞の分離を容易にするため、解剖皿に 0.1 X MBS を満たします。解剖皿の準備が整ったら、ゼリーコートを除去した受精卵を 0.5 x 培養液を含む 100 millimeter ペトリ皿に移します。すぐに使用しないものは、最初の皿で 2 細胞期胚を確認している間に 14 degrees Celsius で培養しておくことができます。解剖顕微鏡を用いて1枚目のペトリ皿内の胚を観察し、プラスチック製転送ピペットを使用して、約10個の1細胞期および2細胞期の胚を0.5x培養液を満たした別の皿に移します。ペトリ皿を14°Cのインキュベーターに入れます。このアッセイで細胞の発達能を正確に評価できるかどうかは、運命地図に基づいて正しい胚芽を切り出せるかにかかっています。したがって、その後の正常な卵割パターンに従うことになる、2細胞期で正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択することが極めて重要です。ここに示されているように、正常な卵割はしばしば胚の一方の側でのみ起こります。ドナー細胞が通常の側から由来している場合は、これらの胚を依然としてドナーとして使用できます。胚が2細胞期に達したとき、動物極にある淡色領域を最初の卵割溝が二分しているものを別のディッシュに分取します。この際、解剖する予定数の約5倍の胚を分取してください。これらが外植片（explan）のドナーとなります。処置の間、残りの2細胞期胚をドナー胚の隣の別のディッシュに保持し、切除組織のステージングのための兄弟コントロールとして使用します。胚の選別と解剖が完了した後、インキュベーター内のディッシュに戻り、さらに1細胞期および2細胞期の胚を確認してください。1細胞期胚が分裂するまでに約90分かかるため、この操作は採卵後2時間まで行うことができます。外植片を準備するために、5〜10個の胚を解剖皿に入れます。次に、透明な卵黄膜をピンセットで把持できるように最初の胚を配置します。卵黄膜は通常、目視できませんが、胚の表面の上に透明な空間があり、膜が離れている動物極において把持することが可能です。片手の鋭利なピンセットで、切開する胚盤胞を傷つけないよう、胚盤胞から離れた位置を把持します。次に、もう片方の手の鋭利なピンセットで、もう一方のピンセットの先端に近い膜を把持し、ゆっくりと反対方向に引っ張って膜を剥がします。膜が除去されると、胚は平坦になります。次に、ピンセットで隣接する細胞を掴み、この細胞をハンドルとして利用します。これにより、もう一方の手のピンセットで切除対象の細胞に直接触れることを避けながら、目的の細胞から残りの隣接細胞を穏やかに引き離します。同じ運命を共有する正中線の細胞を標的にする場合は、ペアとしてまとめて除去することができます。最後に、ハンドルとして使用した細胞を切除します。滅菌済みのガラス製パスツールピペットを用いて、気泡の混入や過剰な吸引を避けながら、ブラストメア（胚盤胞）または2細胞期胚を吸い上げます。パスツールピペットの先端をX-ploran培養ディッシュのウェル内の培地表面下に配置し、ゆっくりとブラストメアを吐出させます。これにより、重力によって浅い窪みの中へ滑り込ませます。複数の胚から採取した blastomere を、培養液の同じ窪みに配置することで、1つの explan にまとめることができます。解剖皿に残っている胚に対しても、この手順を1つずつ繰り返します。約10個の胚を処理すると、解剖皿が細胞の残渣で満たされます。この状態になった場合は、次の解剖皿に交換してください。すべての解剖が完了した後、外植片が浅いくぼみの中にあるか確認します。入っていない場合は、70% Ethanolで滅菌し風乾させたヘアループを用いて、外植片をそっとくぼみの中へ押し込みます。最後の解剖後、インプラントをベンチ上の室温で約1時間インキュベートしてください。滅菌済みのガラスパストゥールピペットを用いて、治癒した外植片の周囲にあるデブリを除去します。外植片のプレートを14〜20°Cで、対照群となる兄弟胚が入ったペトリ皿の隣に配置します。兄弟胚によって、芽基外植片の発達段階を確認します。培養開始から約1〜2時間後、摘出した割球は約4回分裂し、損傷した隣接細胞から残ったデブリの大部分が脱落します。20時間後には、それらは小さく丈夫な細胞塊を形成します。兄弟細胞が目的の発達段階に達したら、外植片を回収してください。これらの外植片は、一部の細胞が崩壊した場合でも、かなり良好に生存します。したがって、培養液中に混濁した塊がある場合は、白金耳やピンセットを用いて探索し、内部に健康な外植片が埋まっていないかを確認してください。ガラスパステルのピペットを用いて少量の培養液とともに外植片を回収し、実施するアッセイに適した固定液または溶解バッファーに静かに排出します。16細胞期の背側または腹側のblasphemersを2個ずつ摘出し、兄弟胚が神経板初期段階に達するまで、14 °CのXMBS中で培養した。各サンプルについて、in situ hybridizationにより接合子神経板遺伝子Sox2の発現を解析した。青色の反応産物がその発現を示している。本アッセイの結果は、神経板の前駆細胞である背側動物極の細胞の大部分が、SOX2を自律的に発現できることを示しています。つまり、胚の他の領域からの追加のシグナル伝達がなくとも発現可能です。SOX2を発現しなかった細胞については、解剖時に誤って同定された可能性があります。対照的に、腹側表皮の前駆細胞である腹側動物極ブラスフェマー（animal blasphemers）のいずれもSOX twoを発現していません。これらのデータは、背側動物極ブラスフェマーが神経組織を形成する固有の能力を持つ一方で、腹側動物極ブラスフェマーにはその能力がないことを示しています。また、背側エクスプラン（explan）の一部では、背側中胚葉の形成を示す形態的な伸長も見られました。これらの割球は、正常な胚において神経管を形成しますが、外植え培養を行い神経管マーカータンパク質を発現させることで、母性発現神経遺伝子の内因性レベルを変化させた際の影響を検証します。Fox D5 mRNAを8細胞期の腹側前駆割球に注入しました。ここで示されているように、腹側移植片の大部分がSOX2を発現しました。逆に、8細胞期の背側前駆細胞芽（blastomere）にアンチセンス・モルフォリノ・オリゴヌクレオチドを注入してFox D5の内在性レベルを低下させると、SOX2を発現した背側外胚葉はわずかでした。これらの実験は、Fox D5の母性発現が、背側前駆細胞芽が神経運命を獲得する固有の能力において役割を果たしていることを示しています。この手順以外にも、機能獲得のためのmRNAや機能喪失のためのアンチセンス・モルフォリノ・オリゴヌクレオチドを、後に解剖する胚に注入するといった他の手法を用いることで、さらなる疑問を解消することが可能です。例えば、細胞が特定の分化運命を辿るという固有の能力には、どのような遺伝子が関与しているのでしょうか。さらに、精製した因子を培養液に添加することで、既知のシグナル因子の機能を検証することも可能です。この手法は、個々の blastomere を完全な胚の新しい位置へ移植するためにも利用できます。この試験は、移植された細胞が元々の発生運命に固定されているかどうかを確認するものであり、この情報は、多能性を持つ胚細胞が特定の組織の前駆細胞へと分化決定される細胞メカニズムを定義する上で極めて重要です。

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