胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

このビデオで示されている方法は、卵割期のopus embryoの運命マップを利用して、単一のblaserの培養物を分離して同定し、胚性硫酸塩が内因性または外因性の指示によって決定されるかどうかを評価します。最初の2つの細胞胚が収集され、最初の切断溝が動物の半球の軽く色素沈着した領域を二分します。これらの胚は、胚が16〜32細胞に達したときに培養され、次にビテル膜が除去され、隣接する細胞が選択された細胞から分離されます。説明のために、解剖されたブラスターは、オーガーコーティングされた培養物のくぼみに移され、よく培養されます。

explanが目的の段階に達すると、in situハイブリダイゼーションQPCRまたは免疫組織化学を使用して遺伝子またはタンパク質の発現を評価するために回収されます。この技術が他の技術よりも優れている点は、例えば、胚細胞や臓器の大規模なグループをログイン時に培養するなど、系統追跡研究から発生の運命がわかっている単一胚の冒涜者を、成長因子を添加したり、隣接する細胞の存在なしに培養できることです。したがって、細胞に固有の因子が、その冒涜が特定の組織の前駆体になるよう指示しているのか、それとも周囲の細胞からのシグナルが必要なのかを直接テストできます。

ブレアの解剖と培養ウェルへの移動には実体顕微鏡下での繊細な操作が必要なため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。このビデオでは、この方法を使用して、母体由来のmRNAが細胞を神経運命に偏らせるかどうかを示します 解剖顕微鏡下で作業する。イルミナ研磨フィルムを使用して4セットの鉗子を研ぎます。

1組の鉗子は、処置中に先端が損傷した場合のバックアップとして機能し、4つの鉗子すべてをオートクレーブして滅菌容器に保管し、0.1 xと1.0 xの修飾バルス生理食塩水またはMBSをそれぞれ500ミリリットル作り、それらをろ過滅菌します。これらの溶液を14〜18°Cでガラススクリューキャップボトルに数ヶ月間保存し、100ミリリットルの1つのX培養物に2%電気泳動グレードのarosを調製します。アロスマイクロ波を溶解し、次に必要なときにアロスを液化するための中型オートクレーブで、アロスが液体である間にアロスを液化します。

滅菌済みの24ウェル培養プレートの各ウェルの底に約0.5ミリリットルを注ぎます。これにより、インプラントがプラスチックにくっつくのを防ぐことができます。次に、2〜360ミリメートルのペトリ皿の底に約2〜3ミリリットルを注ぎ、穏やかに渦巻いて分配します。

これらは解剖皿として機能し、arosは胚がプラスチックにくっつくのを防ぎます。それらの膜が取り除かれると、arosが冷えて炎を硬化させたとき、6インチの牧草地ピペットの先端がボールに溶けるまで。ボールを少しリフレーミングしてから、培養プレートのウェルにあるアロスの表面に軽く触れます。

これにより、X explanが配置される浅い窪みが作成されます。プレートの各ウェルについて繰り返します。次に、培養プレートの各ウェルに1 x 1 x滅菌培地1ミリリットルを充填します。

次に、解剖皿に0.1 XMBSを充填して、ブラスターの分離を促進します。解剖皿が準備されたら、ゼリーコートを取り除いた受精卵を0.5 x培地を含む100ミリメートルのシャーレに移します。すぐに使用しないものは摂氏14度で培養でき、最初の皿は2つの細胞胚について調査されます。

プラスチックトランスファーピペットを使用して解剖顕微鏡を使用して最初のペトリ皿の胚を調査し、約101個の細胞と2個の細胞胚を0.5 x Cultureで満たされた別の皿に移します。中程度。ペトリ皿を摂氏14度のインキュベーターに入れます。このアッセイが細胞の発生可能性を正確に評価できるかどうかは、運命マップに基づいて正しい冒涜を解剖することにかかっています。

したがって、2つの細胞段階で正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択し、その結果、通常の切断パターンに準拠することが重要です。ここに示すように。定期的な卵割は、多くの場合、胚の片側でのみ発生します。

これらの胚は、ドナー細胞が通常の側に由来する場合、ドナーとして使用できます。胚が2つの細胞段階に達したら、最初の切断溝が動物の半球の軽く色素沈着した領域を二分するものを別の皿に選別し、解剖される胚の約5倍を選別します。これらはexplanの寄付者になります。

残りの2つの細胞胚は、手順全体を通してドナー胚の隣にある別の皿に保持し、説明をステージングするための兄弟コントロールとして機能します。胚を選別して解剖した後、インキュベーター内の皿に戻り、さらに1つの細胞と2つの細胞の胚を見つけます。1細胞の胚が分裂するのに約90分かかるため、これは卵子採取後最大2時間で行うことができます。

explanを準備するには、解剖皿に5〜10個の胚を入れます。次に、透明なビテル膜が鉗子でつかまれるように最初の胚を配置します。通常は見ることができませんが、胚の表面の上の透明なペラルスペースで区切られている動物の極でつかむことができます。

片手で鋭利な鉗子を使用して、ブラスターの損傷を避けるために解剖するブラスターから離れた場所でつかみます。次に、鋭利な鉗子で、もう一方の手で、他の鉗子の先端に近いメンブレンをつかみ、反対方向にそっと引っ張ってメンブレンを剥がします。膜が取り除かれると、胚は平らになります。

次に、鉗子で隣接する細胞をつかみ、この細胞をハンドルとして使用して、解剖する細胞がもう一方の手で鉗子に直接触れないように、残りの隣接する細胞を所望の冒涜からそっと引き離します。同じ運命を共有する正中線細胞を標的とする場合は、ペアとして一緒に除去できます。最後に、ハンドルセルを解剖します。

冒涜またはアメアペアを滅菌ガラスのパストピペットで拾い上げ、気泡や過度の吸引を避けます。パスチャーピペットの先端をX explan培養皿のウェル内の培地の表面の下に置き、ブラスターを静かに排出します。重力によって浅い窪みに滑り込むはずです。

複数の胚からの冒涜者は、それらを培養物の同じくぼみに沈着させることにより、単一のエクスプランに結合することができます。解剖皿に残っている胚でこの手順を1つずつよく繰り返します。約10個の胚が生まれた後、解剖皿は細胞の破片で満たされます。

その場合は、次の解剖皿に交換してください。すべての解剖が完了したら、エクスプランが浅いくぼみにあるかどうかを確認します。そうでない場合は、70%エタノールで滅菌されたヘアループで窪みにそっと押し込み、最後の解剖から約1時間後にベンチで室温でインプラントを風乾インキュベートすることができます。

治癒したエクスプランの周囲の破片を滅菌ガラスの牧草地ピペット培養で取り除きます。摂氏14度から20度のexplanのプレートは、兄弟制御胚を含むペトリ皿の隣にあります。兄弟胚は、冒涜のexplanの発達段階を示します。

培養に約1〜2時間かかると、摘出された割球は約4回分裂し、損傷した隣接する細胞から残った破片のほとんどを剥がし去ります。20時間後、それらは細胞の小さな頑丈な球を形成します。兄弟が目的の発達段階に達したら、エクスプランを収穫します。

これらのエクスプランは、一部の細胞が崩壊しても、非常によく生き残ります。したがって、培養物に曇った塊がある場合は、ヘアループまたは鉗子でそれをよく探索して、健康な説明が中に埋もれているかどうかを判断します。少量の培養液でexplanをグラスでピペットにかけ、アッセイに適した固定液または溶解バッファーに静かに排出します。

2つの背側冒涜者または2つの腹側冒涜者を16細胞段階で解剖し、兄弟胚が初期の神経板段階に達するまで、摂氏14度の1つのXMBSで培養しました。各サンプルは、接合神経板の発現についてアッセイされました。Gene Sox two by in situハイブリダイゼーションは、青色の反応生成物として見られます。

このアッセイの結果は、神経板の前駆体である背側の動物の冒涜者の大多数が、SOX 2を自律的に発現できることを示しています。これは、胚の他の領域からの追加のシグナル伝達がないことです。SOX 2を発現しない説明は、解剖時に誤って識別された可能性があります。

対照的に、腹側表皮の前駆体である腹側動物の冒涜者はいずれもSOX 2を発現していません。これらのデータは、背側の動物の冒涜者が神経組織を形成する固有の能力を持っているのに対し、腹側の動物の冒涜者は気づかないことを示しています。背側外偵の一部は、背側中胚葉の形成を示す形態も引き伸ばしています。

これらの割球はまた、無傷の胚でヌールを形成するために色あせされ、explan培養物は、母性発現神経遺伝子の内因性レベルを変更する効果をテストするためにヌールマーカータンパク質を発現します。Fox D 5 mRNAを8つの細胞腹側前駆体冒涜者に注入した。ここに示すように、腹側インプラントの大部分はSOX2を発現していました。

逆に、アンチセンスモルフオリゴヌクレオチドを8細胞背側前駆体ブラスターに注入することにより、Fox D 5の内因性レベルが低下したとき、SOX 2を発現した背側エクスプランはごくわずかでした。これらの実験は、フォックスDファイブの母性発現が、この手順に先立って背側冒涜者が神経運命を獲得する固有の能力に関与していることを示しています。他の方法、例えば、機能獲得のためのmRNAまたは機能喪失のためのアンチセンスモルフォオリゴヌクレオチドのいずれかを解剖するためにブレアに注入するなどして、追加の疑問に答えることができる。

例えば、細胞が特定の発生運命を生じさせる固有の能力には、どのような遺伝子が関与しているのでしょうか。さらに、精製された因子を培地に添加することにより、既知のシグナル伝達因子を試験することができます。このアプローチは、個々の冒涜者を無傷の胚の新たな場所に移植するためにも使用できます。

このテストは、移植された細胞がその元の発生上の運命にコミットされているかどうか、この情報は、多能性胚細胞が定義された組織の前駆体になることに関与するようになる細胞メカニズムを定義するために重要です。