ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析
August 14th, 2013
私たちは、網膜剥離のトランスクリプトーム解析のために網膜切除から網膜のサンプルを使用していました。我々は外科ブロックと実験室間のRNA保全を可能に手順を開発しました。我々は精製されたRNAはマイクロアレイ解析に適していることを保証するために、塩化セシウム遠心法によってRNAを精製するための標準化されたプロトコル。
この手順の全体的な目標は、網膜剥離におけるトランスクリプトーム分析のために、ヒト網膜外科標本からRNAを精製することです。ジャーナルを使用して、手術標本の収集に必要な試薬と材料を実験室で準備し、病院に送ります。外科的処置中、検体は収集され、ラボに戻されます。
次に、標準化された塩化セシウムグラジエント手順を使用してRNAを精製し、精製したRNAの品質を評価します。最近。mRNAの発現解析により、主要遺伝子の発現変化が示す網膜剥離には、炎症と視細胞変性の両方が関与していることが明らかになりました。トランスクリプトーム分析によって特定されたこれらのプロセスでは、抽出からのGTINクロル(oleとも呼ばれる)などの既存のオルナ精製に対するジャーナルの主な利点は、オルナがDNAで汚染されていない結果です。
この技術の応用は、新しいアジュバント療法を開発するための技術的手段を提供するため、網膜剥離の治療にまで及びます。採取するサンプルごとに、RNAフリーピペットを使用して、5ミリリットルの滅菌ポリエチレン丸底チューブに2.4ミリリットルの6モルRNAフリー塩化ギネ溶液を充填します。アルゴンガスを使用してチューブの上部を充填します。
次に、キャップをしっかりと押してすばやく置き、密閉されていることを確認します。これにより、手術用キャビネットでの数年間の保管中に塩化ギネが酸化されるのを防ぐことができます。次に、5ミリリットルのチューブのそれぞれを50ミリリットルの滅菌ポリプロピレンの円錐形の底部チューブに入れます。
ティッシュを追加し、キャップをねじ込んだ後、50ミリリットルのチューブをポリスチレンラックに入れます。次に、ラックと準備した封筒、および準備した配送フォームを病院の段ボール箱に入れます。段ボール箱を手術用キャビネットから手術室に持って行きます。
手術中は、網膜標本を量と塩化物溶液で満たされたチューブに入れます。チューブをしっかりと閉じます。チューブを軽く混ぜます。
次に、チューブを血液チューブロッカーに10分間置きます。添付のサンプルフォームに、患者識別、手術日、および追加の備考を記入してください。次に、対応する番号の付いた50ミリリットルのチューブに識別番号を書き込みます。
次に、手術用標本の入った5ミリリットルのチューブを50ミリリットルのチューブに入れます。ペーパーティッシュを交換し、チューブにキャップをします。次に、50ミリリットルのチューブとサンプルインテークフォームを適切なパッド入りの封筒に入れ、密封します。
サンプルがラボに受け入れられたら、poly tron TMホモジナイザーを使用して、チューブを上下に動かしながら、poly tron TMホモジナイザーで最大設定で5ミリリットルのチューブ内で試料を均質化します。サンプルが均質化されたら、多糖類を抽出するために、270マイクロリットルの2モル酢酸カリウムを加え、チューブを水平位置のシェーカーに置きます。10分間激しく振とうし、次いで摂氏20度で6, 500Gで10分間遠心分離する。
スピン後、ピペットを使用して、ペレットを乱さずに可溶性画分を慎重に吸引します。上清を14ミリリットルの滅菌RNAフリーチューブに移します。上清の隣に、5.3ミリリットルの1%と100のローレルサルコシン、ミリモラートリ、および3.2グラムの塩化セシウムを追加します。
サルコシンは膜を可溶化し、塩化セシウムを使用して勾配を生成します。チューブを1分間ボルテックスして混合します。1.8ミリリットルの塩化セシウムEDTAを滅菌11ミリリットルのポリマー遠心分離チューブに加えます。
次に、10ミリリットルの滅菌パストピペットで、RNA溶液を塩化セシウムEDTA溶液に重ね合わせ、チューブの内面を流れ落ちさせます。チューブを遠心分離機に入れます。必要に応じて、網膜のないバッファーを含む2本目のチューブをバランスとして使用し、摂氏20度で225,000Gで24時間回転させます。
翌日。スピン後、チューブの上部に脂質層が形成されます。DNAは中央にあり、RNAはチューブの底にペレット化されます。
滅菌ペーストピペットを使用して、2つ目の滅菌ペーストピペットで上部脂質層を慎重に除去し、廃棄します。粘性DNAが吸引されるまで溶液を徐々に除去します。溶液とDNAを廃棄します。
次に、3番目の滅菌牧師ピペットを使用して、残りの溶液を取り出して廃棄します。RNAペレットを乱さないように注意してください。次に、炎滅菌したメスを使用して、ここに示すようにチューブを切断し、上部を廃棄します。
残りの部分を逆さまにして滅菌ガーゼの上に置きます。チューブを反転させ、ピペットを使用して160マイクロリットルの塩化ギネで繊細にすすぎます。ペレットを10分間乾かします。
ペレットが乾いたら、150マイクロリットルのトリス、E-D-T-A-S-D-Sに再懸濁します。次に、150マイクロリットルのトリス、EDTA、および30マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムを加え、次にボルテックスしてRNAを沈殿させます。900マイクロリットルの氷冷、100%エタノールを追加します。
チューブを渦巻きにして、溶けた氷の上に30分間置きます。その後、チューブを摂氏4度で18, 000 Gで30分間遠心分離します。スピン後、小さな白いペレットが見える場合と見えない場合があります。
ペレットが見えるかどうかは、上澄みを繊細に吸引して捨てます。次に、余分な塩分を除去するために、500マイクロリットルの室温、70%エタノール、ボルテックス、チューブ遠心分離機、チューブを摂氏4度で18, 000Gで20分間追加します。70%エタノールの洗浄と回転を繰り返した後、P 200ピペットを使用して残っているエタノールを除去します。
ペレットを10分間自然乾燥させます。ペレットを50マイクロリットルのデイ処理水に再懸濁し、2分間ボルテックスして激しく混合します。次に、サンプルを摂氏45度のウォーターバスに15分間置きます。
RNAを完全に再懸濁します。最後に、260ナノメートルの吸光度によってRNAの濃度を決定し、プロトコルに従ってゲル電気泳動によってRNAを分析します。添付の文書「網膜剥離のトランスクリプトームを調べるために」では、ジャーナルの手順を使用して、網膜剥離の患者18人と死後の網膜を使用して調製した年齢一致対照18人から網膜RNAを回収および分析しました。
続いて、本報告書に記載されているように、ゲル電気泳動およびレッチノ塩基を用いてRNAを精製し分析したのは、単球走化性M CP 1遺伝子CCL 2の発現を表すレーダーグラフである。RDとラベル付けされた図の右側は網膜剥離患者からのRNAに対応し、Nとラベル付けされた左側は、ここで見られるようにコントロールからのRNAです。網膜剥離は、左側の対照群と比較して、右側のほとんどのRD標本で高いC値で示されるように、CCL 2のアップレギュレーションをもたらします。
この増加は、ここで見られるように、網膜剥離の患者の炎症を示しています。桿体光受容体形質導入遺伝子GNAT1の発現はCCL2とは逆に減少し、右側のRD標本の値は低く、短波錐体オプシンO PN one SWの発現の減少、およびホメオ遺伝子CRXも観察され、網膜剥離患者の桿体と錐体の両方の光受容体変性を示唆していますこの方法により、網膜剥離後の遺伝子発現変化についての洞察を得ることができます。また、遺伝性網膜変性症などの動物モデルにおける他の網膜病理にも適用できます。
この方法に不慣れな人は、核酸の知識が必要なため、苦労するかもしれません。この方法の視覚的なデモンストレーションは、認証後のRNAが難しい改修として重要です。
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概要
この研究は、網膜剥離症例におけるトランスクリプトームを分析するために、ヒトの網膜手術標本からRNAを精製することに焦点を当てています。さらなる分析のためにRNAの品質を確保するために、標準化されたセシウム塩化物勾配法が使用されています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 網膜生物学
- トランスクリプトミクス
背景
- 網膜剥離は重大な視力喪失につながる可能性があります。
- 遺伝子発現の変化を理解することは治療戦略の開発に不可欠です。
- RNAの品質は正確なトランスクリプトーム分析に不可欠です。
- 既存のRNA精製方法は汚染につながる可能性があります。
研究の目的
- 網膜サンプルからの信頼できるRNA精製方法を開発すること。
- 網膜剥離に関連するmRNA発現を分析すること。
- 炎症と光受容体変性の関与を評価すること。
使用された方法
- 網膜切除中に網膜サンプルを収集すること。
- RNA抽出のための試薬と材料の準備。
- RNA精製のための標準化されたセシウム塩化物勾配法。
- マイクロアレイ分析のためのRNA品質の評価。
主要な結果
- 網膜剥離に関連する主要な遺伝子発現の変化の特定。
- トランスクリプトーム分析における炎症と光受容体変性の証拠。
- 新しい方法がDNA汚染を防止することを示すこと。
- マイクロアレイ分析に適したRNA品質の向上。
結論
- 開発されたRNA精製方法は網膜サンプルに効果的です。
- トランスクリプトーム分析は網膜剥離のメカニズムへの洞察を提供します。
- 将来の研究はこの方法を網膜疾患のさらなる研究に活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Retinal detachment triggers concurrent inflammation and photoreceptor degeneration, creating a complex pathophysiological environment that complicates therapeutic development. The jouRNAl method enables high-fidelity transcriptomic profiling of surgically discarded human retinal specimens, providing a scalable source of disease-relevant tissue for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by linking molecular signatures to clinical phenotypes, informing go/no-go decisions in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous detection of inflammatory and degenerative pathways in human retinal tissue.
- Operational Value: Transforms discarded surgical specimens into validated biological systems, reducing reliance on animal models for early target assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing human-derived expression data on CCL2, GNAT1, OPN1SW, and CRX as biomarkers of RD progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers DNA-free RNA suitable for microarray and RT-PCR, ensuring assay specificity for gene expression readouts.
- Operational Value: Standardized cesium chloride gradient protocol ensures reproducibility across batches and sites, enabling scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified RNA quality validated by gel electrophoresis and absorbance, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by using human retinal specimens to validate findings in animal models of inherited retinal degeneration.
- Biomarker Alignment: Identifies CCL2 upregulation and photoreceptor gene downregulation as translatable signatures for therapeutic monitoring.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic insight into RD progression, informing biomarker-stratified clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The jouRNAl method integrates into the discovery continuum from early target identification through preclinical validation, enabling human tissue-based de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inflammation and degeneration pathways via transcriptomic analysis of human retinal specimens.
- Screening: Delivers standardized, quantitative RNA outputs suitable for high-throughput gene expression profiling.
- Analytics: Generates measurable readouts (e.g., CCL2 upregulation, GNAT1 downregulation) that allow cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects human specimen data to preclinical continuity by enabling comparative analysis in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA extraction from surgical tissues, applicable across retinal pathologies and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct human tissue transcriptomics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cesium chloride purification, minimizing batch variability in multi-site studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-derived molecular evidence, reducing late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concurrent inflammation and degeneration signatures in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and gradient ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to cesium chloride, ultracentrifuges, and RNase-free laboratory infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, pathology, and molecular biology units for specimen tracking.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of homogenization and lysis steps.
- Practical limitation: RNA yield depends on timely specimen transfer and avoidance of RNase exposure during surgical collection.
