ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析

この手順の全体的な目的は、網膜剥離におけるトランスクリプトーム解析のため、ヒト網膜の手術検体からRNAを精製することです。この目的を達成するため、手術検体の採取に必要な試薬および材料を研究室で準備し、病院へ送付します。手術中に検体が採取され、研究室へと返送されます。

その後、標準的な塩化セシウム密度勾配法を用いてRNAを精製し、精製されたRNAの品質を評価します。最終的に、mRNA発現解析を行うことで、主要な遺伝子の発現変化から、網膜剥離には炎症と視細胞変性の両方が関与していることが示されます。トランスクリプトーム解析によって特定されたこれらのプロセスにおいて、既存のRNA精製法（GTINクロロホルム抽出、別名グアニジニウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出など）に対する本手法の主な利点は、得られるRNAにDNAが混入しないことです。

本手法の応用は、新たな補助療法の開発に向けた技術的手段を提供するため、網膜剥離の治療へと展開されます。採取するサンプルごとに、RNA-freeピペットを使用して、5 mLの滅菌ポリエチレン製ラウンドボトムチューブに2.4 mLの6 M RNA-freeグアニジン塩酸塩溶液を満たします。アルゴンガスを用いてチューブの上部を充填してください。

その後、すぐにキャップをしっかりと押し付けて密閉します。これにより、手術用キャビネットで数年間保存しても塩化グアニジンの酸化を防ぐことができます。次に、5 mLチューブをそれぞれ50 mLの滅菌済みポリプロピレン製コニカルチューブに入れます。

組織を加え、キャップを締め付けた後、50 milliliterチューブをポリスチレン製ラックに配置します。次に、ラックと準備した封筒、および記入済みの配送伝票を、病院内の段ボール箱に入れます。外科用キャビネットから段ボール箱を外科手術室へ運びます。

手術中、網膜検体をquantityおよび塩化物溶液で満たしたチューブに入れます。チューブの蓋をしっかりと閉めます。チューブを軽く混ぜ合わせます。

その後、チューブを血液チューブロッカーに載せ、10分間回転させます。付属のサンプルフォームに、患者識別情報、手術日、および追加の備考を記入してください。次に、対応する番号が振られた50 milliliterチューブに識別番号を記入します。

次に、外科検体が入った5 mLチューブを50 mLチューブに入れます。ペーパータオルを詰め直し、チューブに蓋をします。その後、50 mLチューブと検体受付票を適切な緩衝材付き封筒に入れ、封印します。

サンプルをラボで受け取ったら、Polytron™ホモジナイザーを用い、チューブを上下に動かしながら最大設定で1分間、5 mLチューブ内で検体をホモジナイズします。サンプルのホモジナイズ後、多糖類を抽出するために2 M酢酸カリウムを270 µL加え、チューブをシェーカーに水平に設置します。10分間激しく振盪させた後、20 °Cで6,500 Gにて10分間遠心分離します。

遠心分離後、ピペットを用いて、ペレットを乱さないように可溶性画分を慎重に吸引します。上清を14 mLの滅菌済みRNaseフリーチューブに移します。上清に、100 mM Tris中の1%ラウリルサルコシンを5.3 mL、および塩化セシウムを3.2 g加えます。

サルコシンで膜を可溶化し、塩化セシウムを用いて勾配を作製します。チューブをボルテックスミキサーで1分間混合します。滅菌済みの11 mLポリマー遠心チューブに、1.8 mLの塩化セシウムEDTAを加えます。

次に、10 mLの滅菌パストールピペットを用いて、RNA溶液をチューブの内壁に沿わせて滴下し、塩化セシウムEDTA溶液の上に層状に重ねます。チューブを遠心機にセットします。必要に応じて、レチナを含まないバッファーを入れた別のチューブをバランスとして使用し、20 °Cで225,000 Gにて24時間遠心分離を行います。

翌日。遠心分離後、チューブの上部に脂質層が形成されます。DNAは中間層に位置し、RNAはチューブの底にペレットとして回収されます。

滅菌済みのパスターピペットを使用し、上層の脂質層を慎重に除去して、別の滅菌済みパスターピペットで廃棄します。粘性のあるDNAが吸引されるまで、徐々に溶液を取り除きます。その後、溶液とDNAを廃棄します。

次に、3本目の滅菌済みパストールピペットを用いて、残りの溶液を除去して廃棄します。この際、RNAペレットを乱さないように注意してください。続いて、火炎滅菌したメスを使用して、ここに示すようにチューブを切り、上部を廃棄します。

残りの部分を滅菌ガーゼの上に逆さまに置きます。チューブを反転させ、ピペットを使用して160 µLの塩化グアニジンで慎重に洗浄します。ペレットを10分間乾燥させます。

ペレットが乾いたら、150 µLのtris-EDTA-SDSに再懸濁します。次に、150 µLのtris-EDTAと30 µLの3 M酢酸ナトリウムを加え、ボルテックスしてRNAを沈殿させます。氷冷した100%エタノールを900 µL加えます。

チューブをボルテックスし、溶けかかった氷の上に30分間置きます。その後、4°Cで18,000 Gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、ごく小さな白いペレットが確認できる場合と、確認できない場合があります。

ペレットが目視できるかどうかにかかわらず、上清を慎重に吸引して除去します。次に、過剰な塩を除去するため、室温の70% ethanolを500 µL加えてボルテックスし、チューブを4°C、18,000 Gで20分間遠心分離します。70% ethanolによる洗浄と遠心分離を繰り返した後、P 200ピペットを用いて残っているethanolをすべて除去します。

ペレットを10分間自然乾燥させます。ペレットを50 µLの脱イオン水で再懸濁し、ボルテックスミキサーで2分間激しく混合します。その後、サンプルを45 °Cのウォーターバスに15分間置きます。

RNAを完全に再懸濁させます。最後に、260ナノメートルにおける吸光度でRNA濃度を決定し、プロトコルに従ってゲル電気泳動によりRNAを分析します。付属文書において、網膜剥離のトランスクリプトームを調べるため、雑誌の procedure を用いて、網膜剥離患者18名および死後網膜を用いて調製した年齢相応の対照群18名から網膜RNAを回収し、分析を行いました。

その後、RNAを精製し、本報告に記載した通りゲル電気泳動およびRT-PCRを用いて解析しました。ここに示されているレーダーグラフは、単球化学遊走因子M CP-1遺伝子であるCCL2の発現を表しています。図の右側にあるRDと表記された部分は網膜剥離患者由来のRNAに、左側のNと表記された部分は対照群由来のRNAに対応しています。ここからわかるように、左側の対照群と比較して、右側のほとんどのRD検体で高いCt値が示されており、網膜剥離によってCCL2がアップレギュレートされることが示唆されています。

ここに見られるように、この増加は網膜剥離患者における炎症を示しています。桿体光受容体導入遺伝子であるGNAT 1の発現は、CCL 2とは対照的に減少しており、右側のRD検体において値が低くなっています。また、短波長錐体オプシンであるOPN 1SWおよびホメオ遺伝子CRXの発現減少も観察され、網膜剥離患者における桿体と錐体の両方の光受容体変性が示唆されました。この手法を用いることで、網膜剥離後の遺伝子発現の変化に関する知見を得ることができます。また、遺伝性網膜変性などの動物モデルにおける他の網膜病理にも応用可能です。

この手法に不慣れな方は、核酸の知識が必要となるため苦労する可能性があります。認定後のRNAの取り扱いには困難が伴うため、この手法の視覚的なデモンストレーションを復習として行うことが極めて重要です。