ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

本手順の総合的な目的は、網膜プロステーシスの安全性の評価を改善することです。まず、最適に固定された摘出眼の表面を組織染料で標識し、インプラント電極の位置を示します。次に、電極アレイを取り除き、眼組織をストリップ状に切片化します。

次に、ストリップをアガーで安定化させ、その後パラフィンに包埋します。最終ステップとして、標記した関心領域を薄切し、染色のためにスライドガラス上に回収します。最終的に、各電極に隣接する植込み領域の健全性を、明視野顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡によって評価することができます。

この手法の主な利点は、固定に伴うアーティファクトや剥離を最小限に抑えつつ、大きなサンプルにおいて電極隣接組織領域を正確に追跡できることです。また、他の眼疾患に対する新しいインプラントの安全性を評価する場合にも利用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、網膜が剥離しやすく、サンプルの取り扱いに高度な器用さが求められるため、困難に感じることがあります。

脆弱な組織のマーキングと取り扱いの習得は困難であるため、本手法を視覚的に提示することは重要です。本研究以前は、脈絡上電極アレイを植え込んだ後、星印で示されるように不適切な手法で眼の処理が行われていました。最初の画像は、電極アレイ空洞を通過する代表的な直交断面を示しています。

網膜が外眼組織から剥離していることに注意してください。これは、矢印で示されているように、移植領域の下で特に顕著です。また、網膜のどの部分がアレイの各電極に隣接していたかを特定することは不可能であることにも注意してください。

この高倍率像では、矢頭で示されているように、網膜層に放出に基づいた複数の定形アーティファクトが見られるほか、ネコ眼の反射層であるtorpedo layerからの大きな剥離が認められます。さらに倍率を上げると、光受容体の外節および色素上皮は依然として無傷であることが観察され、以前に観察された剥離は、生体内の外傷や病理によるものではなく、処理過程で生じたアーティファクト的な副作用であることが示唆されます。したがって、これらの固定に関連するアーティファクトや層間剥離を最小限に抑えるため、以下の手法を導入しました。

眼球の核抽出と固定後、エタノールから植え込み済みの眼球を取り出し、結膜や腱鞘を含む余分な組織を慎重にトリミングします。視神経を2～3 mmの長さに切り詰めます。電極アレイは、半透明の強膜を通して確認できます。

次に、細筆を使用して組織に組織学的染料を慎重に塗布し、あらかじめ定義したカラーコードで電極を標識します。このとき、染料を塗り広げないように注意してください。関心領域を定義したり、切片の整合性を高めたりするために、追加の染料によるマーキングを行うことができます。

ここでは、最大限に刺激された電極を緑色で標識しました。その他の活性電極は赤色で標識しています。より直径の大きいリターン電極は黄色に彩色し、追加のガイドや解剖学的標識は青色染料で標識しました。

5分間自然乾燥させた後、染料を脱水させるために眼球を70% ethanolに戻します。次に、先ほど実演したように、非移植コントロール眼から余分な組織をトリミングし、核出および固定ステップで取り付けた8本のナイロン縫合糸を使用して、コントロール眼と移植眼を鏡像ペアになるように整列させます。その後、電極アレイと同じ寸法のシリコンテンプレートを、移植眼のアレイの位置に対応するコントロール眼の鏡像位置に配置します。

次に、デモンストレーションした通りにコントロール用の眼球にラベルを貼り、各電極植え込み部位に対して解剖学的に同等の位置にコントロールペアが配置されるようにします。続いて、眼球からインプラントアレイを取り外し、角膜、虹彩、水晶体を含む眼球前面を除去します。次に、残った眼球カップから硝子体液を除去します。

次に、インプラントを埋入した眼を、厚さ2 mmの複数のストリップ状に切断します。各ストリップには、マーキングした領域の一部が含まれるようにします。ストリップの方向は、インプラントに対する組織反応のさまざまな側面を評価しやすいように選択し、後の参照のために、サンプル上のダイマーキングの位置を注意深く記録してください。

次に、最初に切断する面を下にして、ストリップを液状アガロースの浅いプールの中に置きます。アガロースが固まったら、サンプルの周囲を切断し、フォームインサートで固定した組織カセットに入れます。対照眼の解剖と包埋を行った後、カセットを中性緩衝ホルマリンに入れ、標準的な自動12時間パラフィン処理法を用いて一晩処理します。

翌日、処理した組織を、切断する面を下にしてパラフィンに埋没させます。次に、パラフィンブロックを5 µmの厚さで薄切します。その後、染色領域ごとの切片をスライドガラスに貼付します。

DY領域を特定するために、顕微鏡下でスライドを定期的に確認してください。強膜の各染色スポットに直接接している領域が、アレイの対応する電極に最も近かった部位となります。最後に、必要に応じて切片を染色してください。

ハイダイナミックレンジ。デイビッドソン固定液で固定し、アレイを除去する前の、脈絡膜上電極アレイを留置したネコの摘出眼のマクロ写真を示す。強膜が半透明であるため、アレイ内の個々の電極を視認することができる。

矢印で示されているように、電極にはあらかじめ定義された染料の色スキームで印が付けられています。解剖学的指標から等間隔に配置されたこれらの染料によるマーキングは、実験間での一貫性を維持するために使用されます。電極アレイを取り除いた後、眼球を手作業でサンプルストリップ状に解剖します。

矢印は、強膜上の電極隣接部位の2箇所を示している。破線は、前図のサンプルを切り出した代表的な切片における切断面を示しており、サンプルストリップの全体的な形状は、組織の不均等なアーティファクトを最小限に抑えて保持されている。矢印で示されるように、強膜上の2つの染料標識は依然として確認できる。

緑色の染料は赤色よりも耐性がありましたが、染料の位置は電極の配置を示しています。したがって、隣接する網膜組織について、電気刺激によって生じた損傷（もしあれば）を評価することができます。この倍率で観察すると、前像で見られた緑色染料に隣接する網膜層は実際には剥離しておらず、ここでは網膜の形態が維持されていました。本プロトコルに従って処理した網膜組織切片の代表的な特殊染色および免疫組織化学染色の結果を、この最初の画像に示します。

ヘマチンは細胞核を青色に染色し、エオシンは細胞質、コラーゲン、および支持組織をさまざまな色調のピンク色に染色しました。この画像では、ルクサルファストブルーが髄鞘を青色に染色しています。クリスタルバイオレットの対比染色は、ペリセルブルー内のニッスル小体を染色し、周囲の衛星細胞を強調することで、神経節細胞を同定するために使用されました。このメイソン・トリクロームブルー処理を施した切片では、BRICスカーレット酸フクシン溶液が筋線維を赤色に染色し、リンブルーがコラーゲンを青色に染色しました。

本例において、この切片の強膜はPAS（過ヨウ酸シッフ）染色されており、基底膜の糖タンパク質成分および結合組織成分が紫色に、ヘマトキシリン対比染色の細胞核が青色に染まっています。この画像に示されている強膜下切片では、出血部位にパールス・プルシアンブルー染色を施しています。分解された赤血球からのヘモジデリンの形成および鉄複合体の放出により、紫色を呈しています。

この画像では、ニュートラルレッドの添加によりリソソームが赤色に染色され、グルタミン合成酵素が染色されています。ミュラー細胞に存在するこの神経伝達物質分解酵素は緑色に染色されており、内顆粒層にあるミュラー細胞体から、内境界膜を形成するミュラー細胞の終末足に至るまで、両方向に伸びています。ニューロフィラメントタンパク質の染色において、この重鎖細胞骨格タンパク質は緑色でラベル付けされており、細胞体および突起に存在します。ニューロフィラメントタンパク質は、他のニューロフィラメントと架橋することでニューロンの構造を維持しています。

神経節細胞層および神経線維層では、神経節細胞とその軸索が観察でき、猫の網膜において内顆粒層の外縁に位置する水平細胞の軸索は緑色に görün 보인다。最後の画像では、細胞骨格タンパク質であるグリア線維性酸性タンパク質が赤色で示されている。このタンパク質はグリア症の際にミューラー細胞やアストロサイトで増殖し、神経線維層に沿って配置されるとともに、ミューラー細胞が内層から外層の網膜層にかけて細い突起を形成している様子が確認できる。青色のDPIによる対比染色は、網膜層の可視化を可能にする。

この手順を試みる際は、サンプルワークフローを三次元的に視覚化し、手順全体を通してサンプルの向きを定期的に確認することが重要です。この手順を完了した後、開発後の安全性に関するさらなる疑問に答えるために、あらゆる組織学的手法を用いることができます。この技術は、人工視覚の開発に携わる研究者が、視覚障害を持つ患者に対する長期的な安全刺激レベルを評価するための道を開きました。

このビデオを視聴することで、バイオニックアイ・インプラントの安全性を評価する方法について十分に理解することができます。