ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

この手順の全体的な目標は、網膜プロテーゼの安全性の評価を改善することです。これは、最初に最適に固定された眼球の表面を組織染料で標識して、埋め込まれた電極の位置を示すことによって達成されます。第2ステップでは、電極アレイを取り外し、眼組織をストリップに解剖します。

次に、ストリップを寒天で安定化し、パラフィンに包埋します。最後のステップでは、マークされた関心領域を切片化し、染色のためにスライド上に収集します。最終的には、各電極に隣接する埋め込み領域の健康状態は、明視野顕微鏡と免疫蛍光顕微鏡によって評価できます。

この技術の主な利点は、固定関連のアーチファクトと層間剥離を最小限に抑え、電極の隣接する組織領域を大きなサンプルで正確に追跡できることです。また、他の眼疾患に対する新しいインプラントの安全性の評価にも使用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、網膜が層間剥離しやすく、サンプルの取り扱いに高いレベルの器用さが必要なため、難しいと感じるでしょう。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、壊れやすい組織のマーキングと取り扱いを学ぶのが難しいため、重要です。この研究に先立ち、脈絡膜上電極アレイを移植した後、目は以前に星で示されているように最適ではない技術を使用して処理されていました。この最初の画像は、電極アレイキャビティを通る代表的な直交セクションを示しています。

網膜が外側の眼組織から剥離していることに注意してください。これは、矢印で示されているように、埋め込まれた領域の下に特に顕著です。また、網膜のどの部分がアレイの各個々の電極に隣接していたかを決定することは不可能であることにも注意してください。

この高倍率では、矢印で示されているように、網膜層にはいくつかの規則的な放出ベースのアーティファクトがあり、ネコ科の目の反射層である魚雷層からの大きな剥離もあります。さらに拡大すると、光受容体の外側セグメント、および色素沈着した上皮は無傷のままであることが観察でき、これは、以前に観察された分離または処理の人工的な副作用が、in vivoの外傷または病理に起因するのではなく、プロセシングの副作用であることを示唆しています。したがって、これらの固定関連のアーティファクトと層間剥離を最小限に抑えるために、次の手法が実装されました。

眼球を核形成して固定した後、まずエタノールから移植された眼球を取り出し、結膜や腱嚢などの余分な組織を慎重に切除します。視神経を2〜3ミリメートルの長さにトリミングします。電極アレイは、半透明の強膜を通して見えます。

次に、先端の細い絵筆を使用して組織学的染料を組織に慎重に塗布し、事前に定義されたカラーコードで電極にラベルを付けます。染料を汚さないように注意してください。追加の染料マーキングを行って、関心のあるポイントを定義したり、セクションを整列させたりすることができます。

ここでは、最大限に刺激された電極に緑色でラベルが付けられています。他のアクティブ電極は赤でラベル付けされています。直径の大きいリターン電極は黄色に着色され、追加のガイドや解剖学的マーキングには青色の染料でラベルが付けられています。

5分間の風乾後、グローブを70%エタノールに戻して染料を脱水します。次に、先ほど示したように、植え付けられていないコントロール眼球から余分な組織をトリミングした後、核形成および固定ステップで取り付けられた8本のナイロン縫合糸を使用して、コントロールと移植された眼を鏡面ペアとして位置合わせします。次に、電極アレイと同じ寸法のシリコンテンプレートを、埋め込まれた眼のアレイの位置に対応するコントロールIのミラーリングされた位置に配置します。

次に、コントロールグローブを示したとおりにラベル付けして、埋め込まれた各電極部位が解剖学的に比較可能な位置にコントロールペアを持つようにします。次に、インプラントアレイを目から取り外し、次に角膜、虹彩、水晶体を含む目の前面を取り外します。次に、残りのアイカップから硝子体液を取り除きます。

次に、埋め込まれた目を複数の2ミリメートルの厚さのストリップに解剖します。それぞれに、ダイマークされた領域のサブセットが含まれています。ストリップの向きは、インプラントに対する組織応答のさまざまな側面の評価を支援するために選択する必要があり、将来の参照のためにサンプル上のダイマーキングの位置を慎重に文書化する必要があります。

次に、最初にカットする側を下に向けてストリップを液化寒天の浅いプールに置きます。寒天が固まったら、サンプルの周りをカットし、フォームインサートで支えられたティッシュカセットに入れます。コントロールアイを解剖して包埋した後、カセットを中性緩衝ホルミンに入れ、標準的な自動12時間パラフィン処理技術で一晩処理します。

翌日、最初に切断する側を下に向けて、処理した組織をパラフィンに埋め込みます。次に、パラフィンブロックを5ミクロンのセクションにカットします。次に、染色された各領域の切片をスライドに取り付けます。

DY領域を特定するために、顕微鏡でスライドを定期的にチェックしてください。強膜の各染色スポットに隣接する領域は、アレイの対応する電極に最も近い領域になります。最後に、必要に応じて切片を染色します。

ハイダイナミックレンジ。軟骨上電極アレイをin situで固定した後、アレイを取り外す前に、軟骨上電極アレイを有する除核したネコ科の眼のマクロ写真が示されています。半透明の強膜により、アレイ内の個々の電極を視覚化できます。

矢印で示されているように、電極には事前定義された染料の配色がマークされています。解剖学的ランドマークから一定の間隔で配置されたこれらの色素マーキングは、実験間で一貫性を維持するために使用されます。電極アレイを取り外すと、眼を手でサンプルストリップに解剖します。

矢印は、強膜の電極に隣接する2つの部位を示しています。破線は、前の図からサンプルを切断して得られたこの代表的なセクションの切片化の平面を示しており、サンプルストリップの全体的な形状は、最小限の差動組織アーティファクトで保存されました。矢印で示されているように、両方の染料のマーキングは強膜にまだ見えます。

緑色の色素は赤色の色素よりも弾力性がありましたが、色素の位置は電極の位置を示しています。したがって、隣接する網膜組織は、この拡大で見られるように、電気刺激によって引き起こされた損傷がある場合でも評価でき、前の画像で見られた緑色の色素に隣接する網膜層は事実上剥離しておらず、網膜の形態はここで保存されていました。現在のプロトコルに従って処理された網膜組織切片の代表的な特殊染色および免疫組織化学をこの最初の画像に示します。

ヘマチンは細胞核を青く染色し、エオインは細胞質、コラーゲン、支持組織を染色し、さまざまな色合いのピンク色を染色しましたこの画像では、ルクサルファストブルーがミエリンブルーに染色しました。クレスタルバイオレットカウンターステインは、ミサイル本体をペリックブルー内で染色し、周囲の衛星細胞を強調することにより、神経節細胞を特定するために使用されました。この石工のトリオンブルー処理されたセクションでは、BRICスカーレット酸融合液が筋繊維を赤く染め、リンブルーがコラーゲンを染色しました。

この場合、過ヨウ素酸で染色されたこの切片の強膜青色は、基底膜の糖タンパク質成分と結合組織成分を嗅ぎ分けて紫色に見え、ヘマットトイン対比染色細胞核は青色に見えます。この画像に示されている強膜下切片は、出血部位をパールのプルシアンブルーで処理しました。分解された赤血球からのヘモシデリンの形成と鉄錯体の放出により、紫色が生じました。

この画像のリソソームを中性赤色に染色したリソソームを添加し、抗グルタミン合成液を染色した。ミューラー細胞に緑色の緑色で見られるこの神経伝達物質分解酵素は、ミューラー細胞体が内核層内にあり、ミューラー細胞末端供給がニューロフィラメントタンパク質の染色のための内部制限膜を形成しながら両方向に広がっています。この重鎖細胞骨格タンパク質は、細胞体細胞に見られる緑色に標識され、ニューロンの構造を維持するために、ニューロフィラメントタンパク質が他のニューロフィラメントと架橋するのを処理

神経節細胞とその軸索は神経節細胞層と神経線維層で観察でき、ネコ網膜の内核層の外側境界に位置する水平細胞の軸索は緑色に見えます。この最終画像では、グリア線維性酸性タンパク質が赤で示され、この細胞骨格タンパク質は、神経膠症中にミューラー細胞と星状細胞で増殖し、神経線維層をミューラー細胞で裏打ちし、内側から外側の網膜層への薄い伸長を形成しているのを見ることができます。青色のDPIによる対比染色により、網膜層の可視化が可能になります。

この手順を試行する際には、サンプルワークフローを3次元で視覚化し、手順全体でサンプルの向きを定期的に考慮することが重要です。この手順に続いて、すべての組織学的方法を使用して、その開発後の安全性に関する追加の質問に答えることができます。この技術は、バイオニックアイ開発の研究者が、失明患者の安全な刺激レベルを長期的に評価する道を開きました。

このビデオを見れば、バイオニックアイインプラントの安全性を評価する方法について十分に理解できるはずです。