Name: ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 学ぶ 組織染料を用いた固定眼球の標識とパラフィン包埋による網膜プロテーゼ安全性評価法。電極隣接組織の明視野・蛍光顕微鏡観察で組織健全性を正確に評価できます。

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著者は感謝したいと思います：さんアレクシアサンダースさんとミシェルMcPhedran実験支援のため、電極製造のため氏ヘレン風水;博士ペニーアレンおよび外科支援のため博士ジョナサン·ヨー、ロイヤルビクトリア朝の瞳と耳の病院の生物のスタッフ原稿の草案フォームで批判的なコメントのために博士とブライオニーNayagam氏とロナルド·レオン、動物のケアのための研究センター、一般的なガイダンスのために全体の教授ロブシェパード。 この作品は、バイオニクス研究所、セント·ビンセント病院、メルボルンで行われた。資金は、バイオニックビジョンオーストラリア（BVA）にバイオニックビジョン科学技術助成金で、その特別研究イニシアティブを通じてイアンポッター財団、ジョン·T·リード慈善信託、およびオーストラリアの研究評議会によって提供されていました。バイオニクス研究所は、その運用インフラストラクチャ·サポート·プログラムを通じてビクトリア州政府から受ける支援を認めるものです。

1。摘出とポスト固定このプロトコルは、被写体が脈絡膜上電極アレイと一方的に移植されていることを前提としています。 <ol><li>ガラスショットボトルにpostfixのソリューションを準備します。 <ol class="lalpha"><li>ダビッドソンの固定液、2倍の100ミリリットル<ul><li>ホルマリン2ミリリットル（37％ホルムアルデヒド） </li><li> 10ミリリットルの氷酢酸（99.7％） </li><li> 35ミリリットルのエタノール（98％） </li><li> 53ミリリットルの蒸留水</li></ul></li><li> 50％エタノール100mlの2倍</li><li> 70％エタノール100mlの2倍</li></ol></li><li> Transcardially暖かいと件名を灌流（37℃）が続いてヘパリン化生理食塩水、冷（4℃）中性（10％）緩衝ホルマリン。 </li><li>両眼の優れた縁（または脈絡膜上の配列から離れた場所）で縫合糸を結ぶ - 直筋に沿って、ランドマークとして機能する。 </li><li>摘出目、移植眼から任意の外部リードを維持。 </li><li> EACを置きHダビッドソンの固定液100ml中の目とは、室温でポストに固定するままにしておきます。 </li><li> 18後 - 70％エタノール（室温）に最終的にその後、8時間 - ダビッドソンの固定液で36時間、6、50％エタノール（室温）に転送。 </li><li> 4でサンプルを冷蔵解剖まで°Cとストア。 </li></ol>そのまま加アイ地球儀に悪影響られた組織像に影響を与えずに、3ヶ月までのため、このように格納されている。 2。同定と組織マッピング上記固定プロトコール（ステップ1）は強膜の半透明をレンダリングしており、配列は現在表示されている-個々の電極部位（ 図3）を含む。 <ol><li>エタノールから注入された地球を取り外し、慎重に結膜およびテノン嚢を含む過剰組織を離れてトリミングします。 3ミリメートルの長さ（ 図3A） - 2〜視神経をトリミング。 </li><li>組織学的染料マールキンを使用グラム方式では、染料が汚れないように注意して、事前定義されたカラーコードを電極にラベルを付ける。 </li></ol><ul><li>我々は専門的な組織学的色素（付録参照）市販のスイートを選びました。染料の少量を慎重に組織に細かい先端ペイントブラシ（Roymacサイズ00）を適用し、最大5分のために空気乾燥させた。 </li><li>他のアクティブ電極のための赤、、大径のリターン電極は黄色、（あった）であった活性電極（S）のための緑は、試験期間のため、閾値上レベルで、最大限に刺激され、：私たちの目的のために、我々は選択した追加のガイドおよび/ ​​または解剖学的距離のマーキング（ 図3Bおよび3C）のための青。 </li><li>いくつかの試行錯誤がその後の工程を通じて安定な染料を見つけるために必要とされてもよい。たとえば、 図4には、緑色色素は赤色染料よりも弾力性であったことが分かる。 70％エタノールで染料を希釈すると、脂質penetを向上させることができます配給および組織コーティング。 </li><li>これは、今後の参考のために染めた地球をスケッチしたり、撮影するのに便利です。 </li></ul><ol start="3"><li>染料を脱水するために70％エタノールに戻ります。 </li><li>注入されていないコントロールの地球のためにステップ2.1を繰り返します。 </li><li>ステップ1.3から縫合糸を使用して、ミラーリングされたペアとしてコントロール眼と移植の目の位置を合わせます。 </li><li>インプラントが移植目（NBステップ2.2から半透明の強膜と染料マーキング移植配列位置の準備が可視化を可能に配置されているような制御目にミラー化された場所にシリコーンテンプレート（電極アレイと同じ大きさの）を置き）。 </li><li>各移植電極部位が解剖学的に同等（ つまりミラーは等価一致）位置の制御のペアを持っているので、制御の目のためのステップ2.2および2.3を実行してください。 </li></ol> 3。解剖と埋め込み<ol><li>眼からインプラント·アレイを削除して、目の前を削除（角膜、虹彩及びレンズを含む。）残りのアイカップ（房）から硝子体液を削除します。 </li><li>複数の代表的なストリップ（〜厚さ2mm）染料マーク領域（ 図3D）のサブセットを含むそれぞれに注入目を解剖。ストリップの配向は、インプラント7に組織応答の様々な側面を評価するのに役立つように選択されるべきであることに留意されたい。 </li></ol>それは染料の領域は各ストリップとその相対的な位置（と色）上に存在するの記録を作るために、今後の参考のために、便利です。 <ol start="3"><li>最初下向き（ 図3E）に面しカットする側と- ;液化寒天の浅いプール（90℃80 4％）にその側にストリップを置きます。 </li><li>かつて寒天は発泡スチロール（ 図3F）でサポートされている組織カセットにサンプルと場所の周りカットし、設定している。 </li><li>制御目について、手順3.1から3.3を繰り返し - 鐸をINGは介護ミラーマッチしたストリップを解剖する。 </li><li>標準（一晩自動）パラフィン加工技術を介してすべてのカセットを処理します。 </li><li>最初下向きにカットされる側にパラフィンで処理された組織を埋め込む。 </li></ol> 4。切断および染色<ol><li>ステップ2と3からノートを定期的に参照して5μmのセクションにパラフィンブロックをカットします。 </li><li>染め領域のそれぞれからのセクションを収集し、スライド上にマウントします。 </li></ol>強膜の各染めスポットに隣接する領域は、今では、配列内の対応する電極（ 図4）に最も接近していたことを自信を持って評価することができる。 <ol start="3"><li>汚したり、必要に応じて免疫を行う。 図5に示す例では、汚れや免疫組織化学は、以下のとおりです。H &amp;E;ルクソールファストブルー（LFB）、クレシルバイオレット、マッソン三重青、過ヨウ素酸シッフ（PAS）;パールズ&#39;プルシアンブルーSTAで、反グルタミン合成酵素（GS）、抗神経フィラメントタンパク質（NF）、抗グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）および4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）。 </li><li>標準および特殊な汚れが詳述されるように行った： <ol><li> H＆E染色は、ライカmultistainer浴アレイST5020（ライカ）によって提供されたプロトコールに従って行った。 </li><li> LFBとクレシルバイオレット（11から変更）： <ol><li>キシレンの3変化（3×2分間）およびエタノール2変化脱ろう（100％、100％）（2×1分）及び（45秒）水道水ですすぐ。 </li><li> 95％エタノールに水和物のセクション。 </li><li> 37℃でLFBソリューション11プレース- 42°C（一晩）。 </li><li>過剰70％エタノールで染色洗い流してください。 </li><li>蒸留水ですすいでください。 </li><li>希薄な炭酸リチウムでプレイス（8％）（数秒）。 </li><li> 70％エタノール（数秒）で分化。 </li><li>蒸留水ですすいでください。 </li><li>必要に応じてBまでは、4.4.2.8に4.4.2.6手順を繰り返しackgroundは無色である。 </li><li> 37°C（10分）で、クレシルバイオレット酢酸作業溶液中の場所。 </li><li>水洗いしないでください。 </li><li>無水アルコールの3変化（1×30秒、2倍の20秒）で脱水し、キシレンの3変化（1×1分30秒、2倍の1分）。 </li><li> DPXとマウントとカバースリップ。 </li></ol></li><li>マッソントリクロームブルー（11から変更）： <ol><li> 4.4.2.1に従って脱ワックス。 </li><li>水（2分）にセクションを持参。 </li><li>ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン​​（2分）を使用して、核を染色。 </li><li>水道水で洗って、蒸留水ですすいでください。 </li><li>ビーブリッヒ緋色酸フクシン溶液（5分）で染色。 </li><li>蒸留水ですすいでください。 </li><li>コラーゲンは淡いピンク（6分）になるまでリン - リンタングステン酸で分化。 </li><li>蒸留水ですすいでください。 </li><li>アニリンブルー（1分）に対比。 </li><li> 1％酢酸（1分）でよく洗ってください。 </li><li> Pとして脱水、マウントとカバースリップER 4.4.2.12と4.4.2.13。 </li></ol></li><li> PAS（11から変更）： <ol><li> 4.4.2.1に従って脱ワックス。 </li><li> 1％過ヨウ素酸（15分）に酸​​化する。 </li><li>その後、蒸留水を流水で洗ってください。 </li><li>シッフ試薬（15分）で染色。 </li><li>水（5分）で洗う。 </li><li>ハリスヘマトキシリン​​（1分）と対比。 </li><li>水道水で簡単に洗ってください。 </li><li> 0.5％酸アルコール（1ディップ）に分化する。 </li><li>水道水でよく洗ってください。 </li><li>スコットの水道水（1分）のブルー。 </li><li>水でよく洗ってください。 </li><li> 4.4.2.12と4.4.2.13に従って、マウントとカバースリップを脱水。 </li></ol></li><li> 11で説明したようにパールズ&#39;プルシアンブルー染色。 </li></ol></li><li>免疫蛍光染色を詳述したように行った。 <ol><li> 4.4.2.1に従って脱ワックス。 </li><li>蒸留水（2×5分）ですすいでください。 </li><li> 75 0.01％のクエン酸緩衝液6を用いて抗原回復を行う - 80°C（20分）dは0.01％クエン酸緩衝液（20分）に冷却させる。 </li><li>生理食塩水（PBS）（2×5分）をリン酸緩衝セクションを洗う。 </li><li>洗浄緩衝液（10分）内の細胞膜を透過性。 </li><li>血清ブロック溶液（2時間）でインキュベートする。 </li><li>抗体希釈液で希釈し、単一の一次抗体（10％正常ヤギserum/0.1％トリトンX-100/PBS）（冷蔵庫で一晩）のセクションをインキュベートする。使用する各一次抗体の力価を表1に示す。 </li><li>一晩のインキュベーション後、洗浄緩衝液（5×3分間）で切片を洗浄する。この点についてから、暗闇の中でセクションを保つ。 </li><li>特定の期間のために1:500の力価（詳細は表1を参照）に対応した二次抗体のセクションをインキュベートする。 </li><li>洗浄緩衝液（3X 5分）のセクションを洗う。 </li><li> DAPI（1:25,000 / PBS）（30分）のセクションをインキュベートする。 </li><li>洗浄緩衝液（3X 5分）のセクションを洗う。 </li><li>マウントとカバースリップは蛍光を発する使用NTは、メディアをマウント。 </li></ol></li></ol>試験サンプルと対照サンプルは、対比較のために準備ができている。

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著者らは、開示することは何もありません。

インプラントの安全性を評価する前臨床研究のための主要な考慮事項です。人工網膜の前に、それが害を引き起こさないことを確認することが不可欠であるヒトに移植することができる。これは、インプラントの生体適合17-23両方の評価と同様に24-26慢性電気刺激によって引き起こされる可能性のある潜在的な損傷を必要とします。このような人工内耳と同様の神経補綴、の経験は、刺激の広い範囲、および組織の損傷27が発生しない物理的、パラメータへの洞察を提供します。しかし、網膜は他の移植部位に異なる特性、したがって正確な安全限界（例えば最大電荷密度など）は、他のシステムでこれまでの研究から想定することはできませんしています。電荷密度は、アクティブ電極部位で最高であり、これは損傷のための最大の可能性に対応する。直接隣接組織をローカライズする従って方法個々の活性電極に非常にこれらの研究の有用性を増加させる。インプラントの特定の領域に隣接する組織はまた、精密検査のために強調表示されてもよい。このアプローチは、標的 &quot;最悪のシナリオ&quot;を調べたという確信を保持しながら、分析されるべきより少ないセクションを可能にする。 ここで説明する強膜色素ローカライゼーション法が広く手の形、成形シリコーン/ Pt電極アレイ28-30でテストされています。なお、薄膜ポリアミドアレイ7,31、また、薄膜シリコン/ Ptのアレイ32で使用されている。いくつかの人工網膜の研究では、intrascleral注入33 &quot;弾丸の形&quot;の電極を採用。本技術は、電極アレイのこのタイプを評価するための効果的である。薄い強膜とネコ目（後極90で厚さ - 200μm）を配列内の個々の電極の可視化を可能にした。しかし、たとえ個々のエレクトロデその位置を容易にアレイの輪郭は（ステップ2.6で用いたものと同様）ことが分かるシリコーンテンプレートを使用して推論することができ、表示されませんでした。 染料マッピングが存在する染料とのセクションだけが得られるように、非関連の組織切片を取得する必要性を制限する。正確に電極位置を推測する機能は、関連する病理組織学的解析と大きく統計的検出力を可能にしますが、人件費と同様に使用スライドとブレードの量を減らすことによって、時間とコスト管理に大きな影響を持っていないだけ。接着性であり、また、未染色組織切片に見えながら、組織処理に耐えることができる染料の使用は重要な初期の考慮事項です。解剖で組織の染料と向きのと埋め込み時の位置の知識は切削加工を支援します。これは正しく斜めにカットされていないセクションを達成するためのブロックを配向含まれており、フルrepresentatiを与え組織の上に。それは、切断を行う人は染料アプリケーション、切開および埋め込みの時点で存在することが重要である。 全体的なプロトコルは、特に固定タイミングで、マイナーな変更に堅牢です。しかし、目の解剖と染料マーキング手順は良い手先の器用さの恩恵が試料の損傷を避けるために、その繊細な手順です。ダビッドソンの固定はインプラント近く網膜の人為的剥離を低減させるための効果的な証明されている一方で、それは解剖時に直接機械的損傷を防ぐことはできません。ダビッドソンの固定は、いくつかの特別な組織学的および免疫組織化学的手続きと容易に互換性がありませんでした。したがって、上記の詳細にこれらの手順を変更/最適化する必要があった。最適な結果が達成されるまで染色時間と濃度の増分変更が行われました - 詳細については、補足資料を参照してください。 網膜の定量組織学は問題が残っている。網膜は不均一であり、厚さ及び面積中枢34,35から遠ざかるにつれて、セル密度変化の双方。したがって、注入された眼内の隣接組織を比較に使用することができず、制御眼の代わりに用いられる。ペアワイズ制御目で、各セクションのマッチングは私たちに病理学的変化のより強力な統計比較を与え、有効性と安全性の成果を網膜補綴と対象36で仲間の目を比較する際に、より良い評価されている。これは定量に影響を与えるように特別な注意が斜めのカットを最小限にするために注意しなければなりません。 要約すると、上述の方法は、有意に順番に、より効率的な前臨床ワークフローにつながっている我々の組織病理学的分析を改善している。これらのメソッドを直接使用する前臨床試験の結果は3 RP患者を安全にsuprachoroiが注入されていた臨床試験につながっDAL網膜プロテーゼ。これらの方法は、長期的な移植に病理学的応答を評価する必要が網膜刺激装置や他の眼用インプラントの両方に関連している。この方法は、インプラントに関心領域に病理の細胞構築と登録を維持するための価値のある利点を提供する。具体的にテストされていないが、これらの手順の変形例は、アレイが表面的に移植される場合は特に、他の種および他の解剖学的部位に使用することができる。

網膜プロテーゼはすぐに重度の視力低下の様々な形態の治療に有用な臨床的介入になることがある。このような特定の網膜色素変性症などの条件、（RP）、眼の光受容体の広範な変性における結果は、これらの神経信号に光を伝達する責任細胞である。しかし、網膜の他の層のいくつかの細胞が残っていると人工網膜1と電気的刺激のための潜在的なターゲットである。ヒト臨床試験の初期の結果は、電極2,3網膜上、網膜下4,5に移植配列、intrascleral 6箇所に有望されています。これらのデバイスは、異なる形状を有する異なる材料から作られ、それらはすべて視覚的知覚を作成するために、網膜の残りの生存ニューロンを活性化する電気パルスを使用している。 当社の幅広いグループ（バイオニックビジョンオーストラリア）プログレを持つ網膜インプラントを開発してきました脈絡膜上の電極アレイ（治験番号：NCT01603576）を移植した3 RP患者で臨床試験研究にセッド。 図1Aは、この脈絡膜上プロトタイプ人工網膜を示しています。 患者の安全、臨床研究において最も重要であり、したがって、人間の臨床試験を開始する前に、我々は前臨床モデルにおいて豊富急性および慢性試験（ 図1B）を行った。組織病理学的評価は、外科手術を絞り込む電極設計反復処理し、最終的にインプラントの安全性を確立することが不可欠でした。標準的な臨床病理プラクティスダブテール効率的なワークフローを維持するために、パラフィン包埋技術を採用した。それはまた、容易に病理学者によって解釈されヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）などの臨床基準と同等の染色手順を利用することが望ましかった。またに、免疫組織化学的分析に適合させることができる技術を求めていました組織の細胞のさらなる評価を容易にするため。 インプラント材料の生体適合性、および慢性電気刺激の安全性は、慎重に評価する必要がある。アレイ内の個々の刺激電極に隣接した眼組織の組織病理を調べることができることが重要である。ただし、配列は、それらがテストできるように、それらの金属成分を容易に区分けすることができなかったので、サンプルを処理する前に除去する必要がありました。その結果、当社の確立された組織標本は、移植された電極7に対して組織の局在とのマッピングを許可しなかった。組織測位手段の欠如に加えて、標準的なホルムアルデヒドベースの固定および処理技術が普及アーティファクトと眼の様々な層の収縮差（ 図2）により網膜の剥離をもたらした。トンの不均一性に起因する彼網膜は、特に定量的な測定のために、対照組織との有効な比較を行うことは困難であった。これらの組み合わせの制限は、私たちの移植の配列によって生じる潜在的な損傷の正確な評価を複雑。 ここでは、これらの制限を克服するための新たな手法を提示する。我々は専門の注視と処理技術8-10パラフィン系組織学との互換性を維持するために変更しました。我々は、臨床病理医からのフィードバックに基づいて、同等の結果を与えるために、標準組織学的および免疫組織化学的汚れを修正した。強膜組織の半透明をレンダリングした後、染料系のカラーコードは、脈絡膜上スペースから配列を除去する前に、個々の電極に隣接眼組織をマークするために採用されました。電極アレイと個別電極部位をマーキングすることにより、試料を正確に電極隣接地域から収集することができる。マッチしたサンプルは、番目から収集することができた電子制御眼ペアごとの比較を容易にするためである。

<table><tbody><tr><td>デビッドソンマーキングシステム</td><td>ブラッドリー製品</td><td>1163-4 - 赤1163-5 - 青1163-2 - 黄1163-1 - 緑</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗グリア線維酸性タンパク質抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB5804</td><td>1:1500、一晩インキュベーション</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗グルタミン合成酵素抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB302</td><td>1:100一晩インキュベーションモノ</td></tr><tr><td>クローナルマウス抗ニューロフィラメント200抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0142</td><td>1:100一晩インキュベーション</td></tr><tr><td>4'、6-ジアミンジノ-2-フェニルインドール、dilactate (二乳酸)</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>1:25,000 30 min incubation</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Superfrost 90&deg; 黄色</td><td>Grale Scientific</td><td>SF41299</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FLEX IHC マイクロスコープスライド</td><td>ダコ</td><td>K802021-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594ヤギ抗ウサギIgG</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーA11037</td><td>1:500</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>PCN5000</td><td>10%血清/ 0.1%トリトンX-100 / PBS</td></tr><tr><td colspan="4"> 特殊染色のための非標準溶液調製</ > 1%クレシルバイオレット水溶液 <ul> <li>クレシルバイオレット1 g</li> <li>蒸留水100 ml</li> </ul> クレシルバイオレットアセテートワーキング溶液 <ul> <li>1%クレシルバイオレット水溶液9 ml</li> <li>蒸留水51ml</li> <li>10% 酢酸 0.5 ml/</li> </ul> Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution <ul> <li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li> <li>1% 酸性フクシン 10 ml</li> <li>氷酢酸 1 ml</li></ul> ホスホモリブディ-リンタングステン酸溶液 <ul> <li>ホスホモリブデン酸 2.5 g</li> <li>リンタングステン酸 2.5 g/</li> <li>蒸留水 100 ml</li> </ul> アニリンブルー溶液 <ul> <li>アニリンブルー 2.5 g</li> <li>氷酢酸 2 g</li> <li>蒸留水 100 ml</li> </ul> Solutions for Immunohistochemistry Wash 緩衝液 <ul> <li>0.1% Triton X-100 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</li> </ul> Serum Block Solution <ul> <li>10% Normal Goat Serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li> </ul> 補足資料 Luxol Fast Blue Luxol Fast Blue(LFB)染色を行う目的は、クレシルバイオレットの対比染色を通じて神経節細胞層の神経節細胞を特定することでした。LFBはミエリンを染色しますが、クレシルバイオレット染色は、粗い小胞体とリボソームで構成されるニューロンのニッスル物質に結合します。網膜の多数の細胞には、アマクリン細胞を含むニッスル物質が含まれています。これらの細胞は通常、内側の核層の内側境界層に位置していますが、変位したアマクリン細胞は神経節細胞層に見つけることができます。ニッスル物質の染色は、大きくて重度に染色された神経節細胞を、より小さく変位したアマクリン細胞から区別するのに役立ちます。これらの細胞の視覚化を支援するために、作業溶液中のクレシルバイオレットストック溶液の量を増やすことにより、クレシルバイオレットワーキング溶液プロトコルを変更しました。1.0ml刻みで6.0mlから9.0mlに増やし、蒸留水の量を減らしました。神経節細胞の視覚化と同定の容易さを評価し、9 mLのクレシルバイオレットストック溶液と51 mLの蒸留水を追加して最適な染色を行いました。クレシルバイオレットは塩基性色素ですが、ニッスル物質を染色するためには酸性溶液中での用法が必要であり、酢酸の量は0.5ml. Junction Acid Schiff 過ヨウ素酸シフ(PAS)染色をハイライトするために行いました。多糖類、特にグリコーゲンは、基底膜や真菌細胞壁に見られ、真菌感染症を示しています。PAS染色のプロセスは、過ヨウ素酸を使用して多糖類のヒドロキシル基を酸化し、アルデヒド基を生成することです。シッフ試薬の適用は、アルデヒド基に結合してマゼンタ色を発し、ヘマトキシリン対比染色により紫色の細胞核が生成されます。私たちのスライドは、内部制限膜に弱い染色を示しました。これは、すべての多糖類、特に陰イオン性多糖類を含むものを標準的な時間枠で酸化できるわけではないため、存在する多糖類によるものかもしれません。そのため、酸化ステップの時間を 10 分から 12 分、15 分、20 分に増やしました。PAS染色では、15分間の酸化ステップが最も効果的であることがわかりました. Masson's Trichrome Blue Massonのトリクロームブルー染色の原理は、コラーゲンと筋肉を染色することです。これは、私たちの網膜スライドでは、損傷による線維化を示す可能性のあるコラーゲン組織の増加を示すために使用できます。この染色は固定技術に敏感であるため、最適な染色を得るためには変更が必要でした。この染色のプロセスは、酸性のビーブリッチ緋色酸フクシン赤色染料を使用して、最初に細胞質と筋繊維を赤く染色することです。ホスホモリブジン酸/リンタングステン酸との分化は、コラーゲン繊維の赤色色素と競合します。強膜では、大きなリン脂質溶解系/リンタングステン酸分子が緩い結合組織に浸透することができますが、密集した筋繊維は小さな分子にのみ浸透できます。次に、アニリンブルー染料を塗布してコラーゲン繊維の酸を置き換え、青色に染まった強膜を生成します。網膜切片のこの染色を最適化するために、Biebrichスカーレット酸フクシン色素による染色時間を短縮して、青色と赤色の色素のバランスを作り出しました。また、デビッドソンの固定剤の使用には、コラーゲンから赤色の染料を除去するために、長時間の分化時間が必要でした。5分、6分、8分、10分で分化を試み、6分で最適な結果が得られました。分化は、滑らかな切片の厚さと切断によっても異なり、6分以上の分率が必要になる可能性があります. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody ポリクローナル、宿主種はウサギです。 分子量は50kDaです。GFAP抗原は、細胞質(星状細胞およびM&uuml;網膜のller細胞)、抗原は428アミノ酸から作られ、分子量は49512 Da. ニューロフィラメント-200抗体 モノクローナル、宿主種はマウス、 クローンN52、アイソタイプIgG1は、分子量200 kDaの重ニューロフィラメントのリン酸化型と非リン酸化型を認識します。抗体は、ニューロフィラメントのテールドメインのエピトープに結合します。 Glutamine Synthetase (GS) antibody モノクローナル、クローンGS-6、宿主種はマウス、分子量は45 kDa、抗体アイソタイプはIgG2aです。GS抗原は、細胞質(M&uumlの細胞質;網膜のller細胞)、抗原は373個のアミノ酸と42,064 Da.< / pの分子量を持っています> </td></tr></tbody></table>

ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

網膜プロテーゼの最近の開発では、前臨床研究において、これらのデバイスの安全性を評価するための信頼できる技術を開発することが重要である。しかし、標準的な固定、準備、および自動化された組織学手順は理想的ではない。ここでは、インプラントに直接隣接網膜の健康を評価するための新たな手順について説明します。網膜の補綴物は眼組織に接触して電極アレイを備えています。従来の方法は、空間的に配列内の個々の電極に隣接する眼組織をローカライズすることができなかった。注入された目を評価する際に加えて、標準的な組織学的処理は、多くの場合、網膜層の総人為剥離をもたらす。これにより、注入された電極アレイの注入及び刺激によって引き起こされる、存在する場合、局部的な損傷を評価することは困難であった。したがって、我々は、電子注入に隣接する眼組織を識別し、ローカライズするための方法を開発（色分けされた）染料マーキングスキームを使用して、我々は人為網膜剥離を最小限にするために目の固定法を変更lectrodes。また、このメソッドは、個別電極とインプラントの特定の部分のローカライズを可能にする、強膜の半透明のレンダリング。最後に、組織病理学的評価の力を高めるために適合対照を使用した。要約すると、この方法は、信頼性の高い効率的な差別や移植眼の網膜の細胞構築の評価を可能にします。

図4は、図3に示されているサンプルを切断から得られた代表的な断面を示している。セクションは、上記のプロトコルに従ってH＆Eで5μmの厚さとステンドで切断した。サンプルストリップの総形状は、最小限の差組織の成果物（ 図4A）で保存されています。緑色の色素は赤（ 図4B）よりも弾力性であったが、両方の染料マーキングは、強膜上に見えていた。網膜の層は人為切り離されず、網膜の形態は（ 図4C）保持されます。アレイ内の電極の位置に対応する染料マーキングに隣接して網膜組織は、容易に同定することができる。 図5は、現在のプロトコルに従って調製された組織切片の代表的な特殊な染色および免疫組織化学を示す。 5 captio 図を参照してください具体的な汚れやその使用法に加えられた変更についての詳細は、nと補足資料。変更後、これらの汚れや免疫組織化学は、確立された基準と同等であった - などの病理学者によって検証。 <table border="1"><tbody><tr><td>一次抗体と力価の種類（カッコ内） </td><td> GFAP（1:1500） </td><td> NF200（1:100） </td><td> GS（1:100） </td></tr><tr><td>二次抗体と力価の種類（カッコ内） </td><td>アレクサフルーア594 </td><td>アレクサフルーア488 </td><td>アレクサフルーア488 </td></tr><tr><td>二次抗体のインキュベーションの期間</td><td> 1時間</td><td> 2時間</td><td> 45分</td></tr></tbody></table> 表1。抗体の種類、ラベルの力価と期間。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> 図1。 Suprachoroidal試作電極アレイ。臨床グレードの成形配列の）マクロ写真。B）手作りの前臨床配列の顕微鏡写真。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> 図2。前者の網膜組織学標準組織学的方法は、これらを調製するために使用し、H＆E染色され、脈絡膜上電極アレイを移植した眼のセクション。）電極アレイ空洞（星印で示される）を通って直交する断面。網膜は、外眼組織から取り外される。これにより、注入領域（矢印）の下に特に明らかである。アレイの各個別電極に隣接していた網膜のどの部分かを判断することは不可能である。スケールバー= 1ミリメートル。B）パネルの箱入り地域の高倍率。網膜レーで、等間隔に、いくつかの成果物がありますRS（矢印）と同様、タペート層（猫の目に反射層）からの主要剥離。スケールバー=100μmである。C）パネルBで箱入りの地域の高倍率。矢印は剥離ようビボ外傷や病態にによって引き起こされるのではなく、処理の副作用人為的だったことを示唆し、光受容体の外側のセグメントと同様に、無傷のままpigmental上皮を、示された。スケールバーは=20μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> 図3。電極、隣接する組織のローカライゼーションと解剖。AD）in situで脈絡膜上電極アレイと摘出眼球の高ダイナミックレンジのマクロ写真は、。）投稿ダビッドソンの固定液で固定し、前に配列の除去に、半透明の強膜は、可視化を可能に配列内の個別電極（シングル例が矢印で示される）。B）電極はあらかじめ定義された染料の色が付いています。C）解剖学的なランドマークからの定期的な間隔で染料マーキングは実験全体で一貫性を維持するために使用されます。D）を除去するとアレイは、目は、サンプルストリップに手で切開されている。着色された矢印は、強膜上の電極隣接のサイトのうちの2つを示している。黄色の破線は切片の面を示します。E）は 、試料片のマクロ写真寒天ブロック内に埋め込 ​​まれた。F）パネルEから寒天埋め込 ​​みサンプルストリップのマクロ写真は、切り出し、泡生パッドでサポートされている包埋カセットに配置処理の間部の移動を最小限にする。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> 図4。新しい網膜組織学。 </s<html> trong&gt;電極ポケットを含む上記のサンプルストリップ（ 図3Dから）、H＆Eでは5μmとステンドグラスに切片、パラフィン包埋だった）緑と赤染めの領域が（ 図3Dと同じ矢印で示される）に表示されますセクションは、 図3Dで黄色の点線のレベルで撮影。スケールバー= 1,000μmの。網膜は配列ポケット下にもリモートでも、切り離されていません。矢印で示されている目に見える赤と緑の色素で、無傷の網膜全体にパネルからB）箱入りの地域。スケールバー=500μmで緑色染料に隣接してそのまま、添付、網膜を示すパネルBからC）箱入り地域。スケールバー=50μmである。染料の位置が電極の位置があれば、我々は自信を持って電気刺激により引き起こされる、損傷のため隣接する網膜組織を評価できることを示していることを知る。 ve_content &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> 図5。特殊な汚れや免疫蛍光を使用して変更網膜cytohistochemistryの例。ダビッドソンの固定液の使用は、メインプロトコルテキストで説明されている標準のホルマリン固定技術は、通常の染色プロトコルに必要な変更、とは対照的に。病理学者は、これらの変更は、同等染色をもたらしたことを確認しました。）H &amp;E;ヘマトキシリンの汚れの細胞核は、紫ピンクのエオシンの汚れ細胞質、コラーゲンと支持組織の様々な色合いながら。B）LFB汚れミエリン青クレシルバイオレットの対比をするために使用することができますが周核青内ニッスル体を染色し、細胞を取り巻く衛星細胞を強調することによって神経節細胞を同定C）マッソン三重青;。ビーブリッヒ緋色酸フクシン液汚れ筋肉Fiありこの場合強膜、青で、コラーゲンアニリンブルーしみながらD）PAS BERが赤、、基底膜と結合組織成分の糖タンパク質成分をヘマトキシリンで紫色の細胞核を対比染色しながら、紫の染色されるE）はパールズ&#39;プルシアンブルー。ニュートラルレッド染色の色の追加は赤リソソームながら出血の部位で、鉄錯体の劣化した赤血球およびリリースからヘモジデリンの形成は、紫の色を作り出すF）GS;ミュラー細胞13（緑色で見つかったこの神経伝達物質分解酵素）、内顆粒層と内境界膜を形成ミュラー細胞endfeetにおけるミュラー細胞体との両方向に伸びる見られるG）は NF-200;細胞ソーマとプロセスで見つかったこの重鎖細胞骨格タンパク質（緑） 、ニューロン14,15の構造を維持するために、他の神経フィラメントと架橋する。神経節ネコにおける網膜内顆粒層の外側に位置するボーダー水平細胞の軸索も強調表示されている間、細胞とその軸索は、神経節細胞層、神経繊維層に見ることができる。 。DAPI（青）と対比すると、網膜の層の可視化H）GFAPができますが、この細胞骨格タンパク質（赤）が、グリオーシス16時のミュラー細胞とアストロサイトの増殖にインナーを通して細いエクステンションを形成ミュラー細胞と神経線維層を裏打ち見ることができます外側の網膜層。 DAPI（青）と対比すると、網膜の層の可視化を可能にします。すべてのパネルでスケールバーは=50μmである。内側の網膜は、各画像の上部に表示され、外側網膜強膜下の反応を示したパネルE、除いて、各画像の下部に示されている。

網膜刺激内の個々の電極に直接隣接する網膜細胞構築を可視化するための技術。

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

本手順の総合的な目的は、網膜プロステーシスの安全性の評価を改善することです。まず、最適に固定された摘出眼の表面を組織染料で標識し、インプラント電極の位置を示します。次に、電極アレイを取り除き、眼組織をストリップ状に切片化します。次に、ストリップをアガーで安定化させ、その後パラフィンに包埋します。最終ステップとして、標記した関心領域を薄切し、染色のためにスライドガラス上に回収します。最終的に、各電極に隣接する植込み領域の健全性を、明視野顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡によって評価することができます。この手法の主な利点は、固定に伴うアーティファクトや剥離を最小限に抑えつつ、大きなサンプルにおいて電極隣接組織領域を正確に追跡できることです。また、他の眼疾患に対する新しいインプラントの安全性を評価する場合にも利用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、網膜が剥離しやすく、サンプルの取り扱いに高度な器用さが求められるため、困難に感じることがあります。脆弱な組織のマーキングと取り扱いの習得は困難であるため、本手法を視覚的に提示することは重要です。本研究以前は、脈絡上電極アレイを植え込んだ後、星印で示されるように不適切な手法で眼の処理が行われていました。最初の画像は、電極アレイ空洞を通過する代表的な直交断面を示しています。網膜が外眼組織から剥離していることに注意してください。これは、矢印で示されているように、移植領域の下で特に顕著です。また、網膜のどの部分がアレイの各電極に隣接していたかを特定することは不可能であることにも注意してください。この高倍率像では、矢頭で示されているように、網膜層に放出に基づいた複数の定形アーティファクトが見られるほか、ネコ眼の反射層であるtorpedo layerからの大きな剥離が認められます。さらに倍率を上げると、光受容体の外節および色素上皮は依然として無傷であることが観察され、以前に観察された剥離は、生体内の外傷や病理によるものではなく、処理過程で生じたアーティファクト的な副作用であることが示唆されます。したがって、これらの固定に関連するアーティファクトや層間剥離を最小限に抑えるため、以下の手法を導入しました。眼球の核抽出と固定後、エタノールから植え込み済みの眼球を取り出し、結膜や腱鞘を含む余分な組織を慎重にトリミングします。視神経を2～3 mmの長さに切り詰めます。電極アレイは、半透明の強膜を通して確認できます。次に、細筆を使用して組織に組織学的染料を慎重に塗布し、あらかじめ定義したカラーコードで電極を標識します。このとき、染料を塗り広げないように注意してください。関心領域を定義したり、切片の整合性を高めたりするために、追加の染料によるマーキングを行うことができます。ここでは、最大限に刺激された電極を緑色で標識しました。その他の活性電極は赤色で標識しています。より直径の大きいリターン電極は黄色に彩色し、追加のガイドや解剖学的標識は青色染料で標識しました。5分間自然乾燥させた後、染料を脱水させるために眼球を70% ethanolに戻します。次に、先ほど実演したように、非移植コントロール眼から余分な組織をトリミングし、核出および固定ステップで取り付けた8本のナイロン縫合糸を使用して、コントロール眼と移植眼を鏡像ペアになるように整列させます。その後、電極アレイと同じ寸法のシリコンテンプレートを、移植眼のアレイの位置に対応するコントロール眼の鏡像位置に配置します。次に、デモンストレーションした通りにコントロール用の眼球にラベルを貼り、各電極植え込み部位に対して解剖学的に同等の位置にコントロールペアが配置されるようにします。続いて、眼球からインプラントアレイを取り外し、角膜、虹彩、水晶体を含む眼球前面を除去します。次に、残った眼球カップから硝子体液を除去します。次に、インプラントを埋入した眼を、厚さ2 mmの複数のストリップ状に切断します。各ストリップには、マーキングした領域の一部が含まれるようにします。ストリップの方向は、インプラントに対する組織反応のさまざまな側面を評価しやすいように選択し、後の参照のために、サンプル上のダイマーキングの位置を注意深く記録してください。次に、最初に切断する面を下にして、ストリップを液状アガロースの浅いプールの中に置きます。アガロースが固まったら、サンプルの周囲を切断し、フォームインサートで固定した組織カセットに入れます。対照眼の解剖と包埋を行った後、カセットを中性緩衝ホルマリンに入れ、標準的な自動12時間パラフィン処理法を用いて一晩処理します。翌日、処理した組織を、切断する面を下にしてパラフィンに埋没させます。次に、パラフィンブロックを5 µmの厚さで薄切します。その後、染色領域ごとの切片をスライドガラスに貼付します。DY領域を特定するために、顕微鏡下でスライドを定期的に確認してください。強膜の各染色スポットに直接接している領域が、アレイの対応する電極に最も近かった部位となります。最後に、必要に応じて切片を染色してください。ハイダイナミックレンジ。デイビッドソン固定液で固定し、アレイを除去する前の、脈絡膜上電極アレイを留置したネコの摘出眼のマクロ写真を示す。強膜が半透明であるため、アレイ内の個々の電極を視認することができる。矢印で示されているように、電極にはあらかじめ定義された染料の色スキームで印が付けられています。解剖学的指標から等間隔に配置されたこれらの染料によるマーキングは、実験間での一貫性を維持するために使用されます。電極アレイを取り除いた後、眼球を手作業でサンプルストリップ状に解剖します。矢印は、強膜上の電極隣接部位の2箇所を示している。破線は、前図のサンプルを切り出した代表的な切片における切断面を示しており、サンプルストリップの全体的な形状は、組織の不均等なアーティファクトを最小限に抑えて保持されている。矢印で示されるように、強膜上の2つの染料標識は依然として確認できる。緑色の染料は赤色よりも耐性がありましたが、染料の位置は電極の配置を示しています。したがって、隣接する網膜組織について、電気刺激によって生じた損傷（もしあれば）を評価することができます。この倍率で観察すると、前像で見られた緑色染料に隣接する網膜層は実際には剥離しておらず、ここでは網膜の形態が維持されていました。本プロトコルに従って処理した網膜組織切片の代表的な特殊染色および免疫組織化学染色の結果を、この最初の画像に示します。ヘマチンは細胞核を青色に染色し、エオシンは細胞質、コラーゲン、および支持組織をさまざまな色調のピンク色に染色しました。この画像では、ルクサルファストブルーが髄鞘を青色に染色しています。クリスタルバイオレットの対比染色は、ペリセルブルー内のニッスル小体を染色し、周囲の衛星細胞を強調することで、神経節細胞を同定するために使用されました。このメイソン・トリクロームブルー処理を施した切片では、BRICスカーレット酸フクシン溶液が筋線維を赤色に染色し、リンブルーがコラーゲンを青色に染色しました。本例において、この切片の強膜はPAS（過ヨウ酸シッフ）染色されており、基底膜の糖タンパク質成分および結合組織成分が紫色に、ヘマトキシリン対比染色の細胞核が青色に染まっています。この画像に示されている強膜下切片では、出血部位にパールス・プルシアンブルー染色を施しています。分解された赤血球からのヘモジデリンの形成および鉄複合体の放出により、紫色を呈しています。この画像では、ニュートラルレッドの添加によりリソソームが赤色に染色され、グルタミン合成酵素が染色されています。ミュラー細胞に存在するこの神経伝達物質分解酵素は緑色に染色されており、内顆粒層にあるミュラー細胞体から、内境界膜を形成するミュラー細胞の終末足に至るまで、両方向に伸びています。ニューロフィラメントタンパク質の染色において、この重鎖細胞骨格タンパク質は緑色でラベル付けされており、細胞体および突起に存在します。ニューロフィラメントタンパク質は、他のニューロフィラメントと架橋することでニューロンの構造を維持しています。神経節細胞層および神経線維層では、神経節細胞とその軸索が観察でき、猫の網膜において内顆粒層の外縁に位置する水平細胞の軸索は緑色に görün 보인다。最後の画像では、細胞骨格タンパク質であるグリア線維性酸性タンパク質が赤色で示されている。このタンパク質はグリア症の際にミューラー細胞やアストロサイトで増殖し、神経線維層に沿って配置されるとともに、ミューラー細胞が内層から外層の網膜層にかけて細い突起を形成している様子が確認できる。青色のDPIによる対比染色は、網膜層の可視化を可能にする。この手順を試みる際は、サンプルワークフローを三次元的に視覚化し、手順全体を通してサンプルの向きを定期的に確認することが重要です。この手順を完了した後、開発後の安全性に関するさらなる疑問に答えるために、あらゆる組織学的手法を用いることができます。この技術は、人工視覚の開発に携わる研究者が、視覚障害を持つ患者に対する長期的な安全刺激レベルを評価するための道を開きました。このビデオを視聴することで、バイオニックアイ・インプラントの安全性を評価する方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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