フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

この実験では、フローサイトメトリーを用いて、ヒト末梢血から精製した好中球から分離し免疫ラベル化した核内の核タンパク質を検出および定量します。まず、デキストリンを用いて赤血球を除去し、次に血漿の密度勾配遠心分離を行います。その後、受容体抗体を用いて、インテグリンまたはFC受容体を介して精製した好中球を刺激します。

核を単離し、目的の核因子（例：NF kappa B）に対する特異的抗体を用いて免疫標識するためのサンプル固定を行います。最終的に、核因子の活性化に伴う微小な変化を検出するために、フローサイトメトリーで核を解析します。その結果、インテグリンを介した好中球の刺激により、転写因子 NF kappa B の核内濃度が上昇することが示されます。核因子の活性化に至るシグナル伝達経路は、通常、初代細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイまたは電気泳動移動度シフトアッセイによって解析されます。

多くの場合、これらの手法は適切ではありません。フローサイトメトリーを用いることで、単離した核内の核タンパク質を迅速に検出および定量することが可能です。まず、健康な成人ボランティアから採取した新鮮な血液 10 milliliters を用意します。

6%デキストリンT 500溶液2 mLを15 mLコニカル遠心チューブにピペットで分注します。次に、10 mLの血液を加え、チューブを2、3回反転させて混合し、新しい15 mLコニカル遠心チューブ内で赤血球が重力により沈降するまで45分間静置します。FIフィアルパックに5 mLを分注します。

沈降した赤血球の上に形成された白血球富化血漿を回収します。これをファイアルパックの上に慎重に重層して2相を作り、4°Cで20分間、516 Gsで遠心分離します。上清を除去し、チューブをラックに軽く叩きつけて細胞ペレットをバラバラにします。

次に、細胞を10 millilitersの冷PBSで再懸濁します。細胞懸濁液を50 milliliterのコニカル遠心チューブに移し、4 °Cで290 Gsにより5分間遠心分離します。前と同様に細胞ペレットをほぐし、赤血球を溶血させるために10 millilitersの冷低張溶液を加えます。

チューブを1分間静かに回旋させて混ぜ合わせます。次に、冷えた高張溶液ミックスを10 milliliters加え、氷上で保存します。その後、遠心分離により好中球をペレット化した後、細胞数を計測します。

PMNを10⁷ cells/mLの濃度で懸濁します。冷PBS中で細胞を氷上に保持します。PMN懸濁液100 µLを1.5 mLエッペンチューブに分注します。

次に、10 µg/mLの対応するモノクローナル抗体を加え、氷上で15分間インキュベートします。細胞を洗浄するために、1 mLの冷PBSを加えて遠心分離し、上清を吸引除去します。その後、細胞ペレットを穏やかに懸濁させ、PBSでさらに2回洗浄します。

未結合の抗体を除去するため、洗浄したPMNを、60 µg/mLのgo anti muse IgGを含む同量の温めたPBSに再懸濁し、目的の核因子に応じて37 °Cで1～20分間インキュベートします。次に、1 mLの冷PBSを加えます。遠心分離により細胞をペレット化した後、上清を除去し、細胞ペレットをドライアイス-エタノールバスで直ちに凍結させます。各サンプルについて、チューブをドライアイス-エタノールバスから取り出し、汚れを拭き取って再懸濁します。

凍結したPMNペレットを100 µLの冷低張溶液に懸濁させます。すべてのサンプルを氷上に置き、核の完全性をモニタリングします。核懸濁液のアリコートをトリパンブルーで染色します。

核懸濁液に無傷の細胞やデブリが多く含まれている場合は、調製物を廃棄し、別のサンプルで手順をやり直すことが望ましい。遠心分離により核をペレット化した後、上清を非常に慎重に取り除き、100 µLの冷えた4%パラホルムアルデヒド溶液で核を固定し、氷上でインキュベートする。核をペレット化した後、上清を慎重に取り除き、100 µLの冷えた透過バッファーを加え、サンプルを氷上で10分間インキュベートする。

次に、遠心分離によって透過核を回収します。この時点では、核のペレットがチューブの底に十分にとどまりません。そのため、再度遠心分離を行うことが推奨されます。

非特異的結合部位をブロックするため、核を500 µLの冷えた4%胎児牛血清（FBS）含有PBSに懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。遠心分離により核をペレット化し、次に、4%FBSおよび2.5 µg/mLの目的の核因子のモノクローナル抗体を含む100 µLの冷PBSで核を再懸濁します。サンプルを氷上で20分間インキュベートした後、4%FBS含有の冷PBS 500 µLでサンプルを2回洗浄し、核を4%FBS含有の冷PBS 100 µLおよび10 µg/mLの対応するFZ標識二次抗体の中に懸濁します。氷上で20分間インキュベートし、2回洗浄した後、核を400 µLの冷えた4%パラアルデヒド含有PBSに再懸濁します。

FactScanまたは同様の装置などのフローサイトメーターを用いて、免疫標識した核を解析します。取得設定を、FSC（対数スケール）10⁻¹、SSC（対数スケール）196に調整し、ドットプロットで核をゲートします。サンプルあたり10,000個の核を取得します。

次に、logスケール400に設定したFL-1チャネルを用いて、fitsyで染色した核の蛍光を分析します。このPMN精製法により、通常95%以上の純度の未刺激好中球が得られます。PMN核は高収率で単離され、フローサイトメーターのドットプロットにおいて、刺激後の完全なPMNとは異なる集団として容易に識別できます。β1インテグリンを架橋させることで、NF-κBが核内に移行し、この核内NF-κBの増加が蛍光強度の増加として検出されます。

同様に、β2インテグリンの架橋によるPMNの刺激も、蛍光強度の増加で示されるように、NF-κBの活性化を誘導します。本法の感度により、核因子のレベルのわずかな変化を検出することが可能です。実際に、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質に結合するβ1インテグリンは、他細胞の接着分子に結合するβ2インテグリンよりも強力にNF-κBの活性化を誘導することが示されています。本法は、多くの異なる蛍光色素を使用でき、またさまざまな細胞種から核を調製できるため、非常に柔軟性が高く、多様な細胞種の核におけるタンパク質レベルの変化を伴うシグナル伝達研究において、簡便かつ経済的なアプローチとして利用可能です。