実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。

次の実験の全体的な目標は、脳虚血後のミクログリアマクロファージ表現型マーカーの発現と細胞局在を視覚化することです。まず、虚血性マウスの脳のクライオ切片を染色して、ミクログリアマクロファージ活性化のマーカーを特定します。染色された切片は、3次元共焦点イメージングにかけられます。

その後、得られた画像を処理して3次元レンダリングを生成し、画像解析を行って細胞クラスター内のマーカーの発現を局在化します。得られたデータは、マーカー発現を特定の細胞体に適切に割り当てる際の3次元共焦点解析の有効性を示しています 2つのマーカーが同じ細胞によって発現されているが、異なる細胞内コンパートメントにある場合、共局在だけではあまり情報が得られない可能性があります。ここで示すように、3次元解析を使用すると、分解能と精度が向上します。

この方法は、虚血性損傷に対する脳の反応の複雑さについての洞察を提供することができるが、損傷と修復におけるミクログリアマクロファージの二重の役割が提案されている他の急性または慢性疾患にも適用できる。また、信号を異なる特殊平面に選択的に位置合わせる必要がある場合は、Carlo PerigoとStefan of Magaliが手順のさまざまな手順をご案内します。次のプロトコルは、虚血が中大脳動脈の永久閉塞によって誘発されたマウス脳組織を利用しています。

クライオスタットを使用して、ゼラチン上の脳の連続20ミクロンの冠状切片を採取します。カバー付きスライドは、使用前にすべての試薬とサンプルを室温に戻します。付属文書に記載されている抗体および血清の希釈率は、異なる抗体および血清を使用した場合に最高の性能を得るために行われた試験の結果であることに注意してください。

プロトコルを検証する必要があります。まず、リキッドブロッカーペンを使用してスライド上のセクションを一周し、必要な試薬の量を最小限に抑えます。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、脳切片を湿ったチャンバーに入れます。

室温のPBSを切片に加え、5分間インキュベートして洗浄します。次に、針付きの1ミリリットルの使い捨て注射器を使用して、溶液を取り出し、もう一度洗浄を繰り返します 2回目の洗浄を取り除いた後、1ミリリットルのピペットと使い捨て注射器を使用してサンプルを染色します すべての溶液交換。染色手順は、要約されているように実行する必要があります。ここは。

洗濯手順などの詳細については、添付のテキストをご覧ください。まず、細胞を正常なヤギ血清でブロッキングした後、1%過酸化水素とインキュベートします。次に、スライドを適切な二次抗体とインキュベートし、続いてトリス、NACLトゥイーンバッファー、またはTNTをインキュベートし、次にトリス、H-C-L-N-A-C-L、ブロッキングバッファー、またはTNBとインキュベートします。

スライドは、ストレプトアビジンHRPとインキュベートされ、続いてシアン化物5チロムを含む増幅希釈剤とインキュベートされ、免疫蛍光シグナルが増幅されます。次に、スライドをNGSとインキュベートして、非特異的結合部位をブロックします。次に、CD 68に対する一次抗体とインキュベートします。

一次抗体とのインキュベーション後、細胞を適切なFluor標識二次抗体でインキュベートし、続いてフック1ミリリットルあたり1マイクログラムでDNAを標識します。染色が完了したら、切片を埋込する際には、気泡が発生しないように、長時間の金を使用してクライオ切片を埋込します。切片は、分析されるまで、摂氏4度で暗闇に保管します。

蛍光シグナルの取得は1週間以内に行う必要があります。このプロトコルは、共焦点スキャンユニットFV 500を搭載したIX 81顕微鏡、488ナノメートルのアルゴンクリプトン、646ナノメートルのヘリウムネオンレッド、532ナノメートルのヘリウムネオングリーン、およびU 500ソフトウェアのインフルエンザのUVダイオードの3つのレーザーラインを備えています。適切な励起レーザーとダイクロイックミラーを選択します。

また、画像の解像度を 800 x 600 ピクセル以上に設定します。次に、スライドを顕微鏡のステージに置き、落射蛍光を使用して、関心のある領域を特定し、倍率を徐々に40倍対物レンズまで上げます。次に、レーザー走査型顕微鏡モダリティに切り替え、光電子増倍管のパワーレベルと各チャンネルのゲインを調整しながら、繰り返しスキャンを実行します。

これにより、異なる波長での同時励起によって引き起こされる信号の重なりが減少します。ゲインをできるだけ低く保ち、不要な非特定の信号を回避します。繰り返しスキャンを続けて、フォーカスを調整し、Z軸の合計長さが10ミクロンのZ軸の下端と上端を定義します。

その後、繰り返しスキャンを停止します。次に、ステップサイズを入力します。ピクセル サイズ (0.225 ミクロン) にできるだけ近づける必要があります。

これにより、ソフトウェアのActivate kalmanフィルターでZ軸に対して標準の1対1のサイズ比が少なくとも2回与えられます。カルマンアルゴリズムは、バックグラウンドノイズに属する単一の正のボクセルなどのランダム信号を排除する反復関数であり、信号対雑音比を改善します。次に、シーケンシャルスキャンモードをアクティブにして、ブリードスルーエフェクトを回避します。

Z軸の中点に移動し、XYシーケンシャルスキャンを実行します。PMTとゲインの設定を確認して、S/N比が良好であることを確認してください。取得後にXY、Z取得を実行します。

データをマルチTIFファイルとしてエクスポートします。各マルチTIFファイルには、通常、処理用の3つのカラーチャネルと44の焦点面が含まれています。まず、imasソフトウェアを開きます。

まず、surpassビューを選択し、次にマルチTIFファイルをアップロードします。次に、ディスプレイ調整パネルで、各チャネルに必要な色を選択します。赤はCD11、B.緑はCD68、青はフックDNAの汚れを表し、背景からノイズを除去し、各チャンネルのディスプレイ調整パネルの最小値を増やします。

次に、断面図に移動して、x、Z、およびYZ軸の直交投影を持つ単一のXY焦点平面を視覚化します。Z 軸に沿って移動し、黄色のピクセルとして表示される共局在を探します。黄色の領域をクリックすると、共局在がZ軸に沿って存在し、ソリッドオブジェクトのZ軸に属しているかどうかを確認します。

図の右側と下部に突起物が表示されます。スナップショットを撮ってから、surpassビューに戻ります。次に、編集ドロップダウンメニューで、[3Dの切り抜き]を選択し、関心領域の輪郭を描き、セルまたはセルのクラスターを分離します。

次に、ディスプレイ調整パネルで、1つのチャンネルを選択します。surpass surfaces アルゴリズム ビルダーを選択します。次に、アルゴリズムを設定するには、まずチャネルを選択します。

次に、しきい値をディスプレイ調整パネルで設定されているのと同じ最小値として定義し、必要に応じてサイズ変更を定義します。次に、スムージングを 0.200 と定義します。カラーパネルを選択し、必要に応じて外観を変更します。

各チャネルの surpass surfaces アルゴリズム ビルダーの設定を繰り返します。次に、ディスプレイ調整パネルで蛍光チャンネルの選択を解除し、3 つのサーフェスすべてを選択します。最後に、ボリュームを移動して最適なビューを見つけ、スナップショットを撮って MM マーカーの共発現パターンを決定します。

このビデオに記載されている免疫蛍光法および共焦点獲得のプロトコルは、中大脳動脈の永久閉塞によって誘発される限局性虚血のマウスモデルで実施されました。取得した画像の2次元ビューは、虚血の24時間後に、緑色で示されているリソソームマーカーCD68が、虚血性コアに存在する赤色で見られるCD11B陽性細胞の中で肥大性の中で発現していることを示しています。右下に示されている Z 軸の投影は、単一平面ビューで文書化されたマーカー分布が境界ゾーンの Z 軸に沿っても存在することを示しています。

CD 11 B陽性細胞は、CD 68に対して非常に陽性のプロセスを持つ肥大性細胞体を示し、ファゴソームが細胞膜に結合していることを示唆しています。これは、ミクログリア細胞の活発なPHA酸性挙動を示しており、CD 68とM2の偏光マーカーであるYM oneの共発現を評価しています。蛍光画像は立体レンダリングを受けました。

ここに示す取得画像の3次元ビューは、緑色で示されるCD68陽性細胞と赤色の蛍光ボクセルで示されるYM1陽性細胞の存在を示しています。平行に敷設すると、観測者の視界は黄色で見える共局在信号を生成する可能性があり、これはマーカー間の実際の距離とは関係がない可能性があります。共ローカライゼーションを定義するため。

Z 軸の投影を持つ 1 つの平面ビューは、Z 軸に沿って移動して生成する必要があります。共ローカライゼーションを探しています。Z軸の投影は、この画像の右と下の部分に示すように取得されます。

蛍光ボクセルは、特定の細胞体にマーカー発現を割り当てて3次元レンダリングすることにより、固体オブジェクトに変換することができます。高倍率で 3D レンダリングすると、2 つのマーカーは近接する異なるセルに属しているように見えます。このビデオを見れば、複数のマーカーや色素を用いた免疫蛍光アッセイの実施方法や、共焦点顕微鏡による3次元画像を適切に取得・可視化する方法を十分に理解できるはずです。

さらに、後処理分析は、細胞レベルでの共発現または共局在を分析するために、またはシグナルを異なる空間面に選択的に局在させる必要がある場合に、実りある方法で活用できることを説明しました。