Name: 実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学ぶ マウス脳虚血モデルにおけるミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点イメージング法。免疫蛍光染色と3Dレンダリングにより、炎症応答の細胞動態を正確に解析し、神経科学研究への応用可能性を示す。

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ステファノフマガッリはMonzino財団の仲間です。

1。免疫蛍光以下のプロトコルを経心的に灌流したマウス（PBS中の冷却したホルムアルデヒドを50mlの4％、続いてPBS、0.1モル/リットル、pH7.4の20mlの）から得られた冠状脳の凍結切片上で行われる。灌流後、脳を慎重に除去し、凍結保護のために4℃で一晩PBS中30％スクロースに移した。バイアルに密封し、-70℃で使用するまで保存される前に、3分間45°C - 脳を急速にイソペンタンに浸漬することによって凍結させる。冠状脳凍結切片（20μm）を連続的にカットし、免疫蛍光プロトコル11、6を受ける。 使用前に室温にすべての試薬およびサンプルを持参してください。抗体および血清の提示作業希釈は最高のパフォーマンスを得るために作ら試験から生じたことに注意してください。異なる抗体および血清が使用される場合、プロトコルは、検証される必要がある。 <pクラス= &quot;jove_contentは&quot;&gt;抗CD11bおよび抗CD68一次抗体の両方が抗ラットアレクサ546でゼロクロス信号を避けるために、ラットで行われているため、我々が蛍光シグナル増幅に続く抗CD11bの高希釈を使用したことに注意してくださいTSAキット（Cy5のチラミド）。我々はステップ1.17を除いて記述されたプロトコルを実行し、表1に報告されているように抗CD11bの少なくとも7種類の希釈液を使用することによって抗CD11bに最適な希釈率を設定している。 ;励起波長でアレクサ546と2）無信号532 nmの1）可視シグナルCy5で励起波長646 nmで：結果として、1:30,000の希釈化の達成という選択されています。このように、アレクサ546蛍光シグナルを選択的にCD68発現に関連されている。 抗CD11bおよび抗CD68抗体のための最適な希釈は、組織のタイプに応じて変えることができると共標識化プロトコルを開始する前に定義する必要があります。 <ol><li> PBSで2回脳凍結切片を洗浄します。 </li><li>で1％H 2 O 2を含有するPBS中で5分間cubate凍結切片（蛍光増幅が西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン-HRPとのインキュベーションを必要とするため工程が必要、ステップ1.12参照）。 </li><li>洗浄凍結切片をPBSで2回。 </li><li> 10％のNGSおよび0.3％トリトンを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。 </li><li> PBSは、一次抗体、ラット抗CD11b [1:30,000]、10％NGSおよび0.3％トリトンを含有する4℃で一晩凍結切片をインキュベートする。 </li><li>洗浄は、PBSで2回（5分）凍結切片。 </li><li>ビオチン化二次抗ラットAB [1:200]と1％のNGSを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。 </li><li>洗浄凍結切片をPBSで2回。 </li><li> TNTで洗浄する凍結切片（トリス-HCl、NaClを、ツイーン：0.1 M TRIS-塩酸、pH 7.4、0.15 MのNaCl、0.05％のTween 20）。 </li><li> TNB中で1.5時間、凍結切片をインキュベートします（バッファをトリス塩酸-NaClのブロッキング：0.1 Mトリス塩酸、pH 7.4、0.15MのNaCl、適切なキットは0.5％ブロッキング試薬（試薬の表を参照））。 </li><li>ウォッシュクライオのセクションでは、TNTで時間を3倍。 </li><li>ストレプトアビジン-H​​RP [1:100]を含むTNB中の凍結切片をインキュベートする。 </li><li>洗浄は、TNTで3回凍結切片。 </li><li>シアニン5チラミド[1:300]を含む増幅希釈液中で8分間の凍結切片をインキュベートする。 </li><li>洗浄凍結切片をPBSで3回。 </li><li> 10％のNGSおよび0.1％トリトンを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。 </li><li>一次抗体ラット抗CD68 [1:200]、3％NGSおよび0.3％トリトンを含むPBSで一晩4℃で凍結切片をインキュベートする。 </li><li>洗浄凍結切片をPBSで3回。 </li><li> fluorconjugated二次抗体アレクサ546抗ラット[1:500]と1％のNGSを含むPBS中で60分間の凍結切片をインキュベートする。 </li><li>洗浄凍結切片をPBSで3回。 </li><li>ヘキスト1μg/ mlのを含むPBS中で10分間凍結切片をインキュベートする。 </li><li>洗浄凍結切片をPBSで3回。 </li><li>長引かゴールド凍結切片をマウントします。 </li></ol> 2。共焦点顕微鏡による三次元画像の取得<ol><li>励起する蛍光色素の波長によって励起レーザを選択します（Cy5の、CD11bのためのHe-Ne赤、Alexa546、CD68およびヘキスト、核についてのUVダイオードのヘリウムネオングリーン）。 </li><li>光信号収集のための最高のダイクロイックミラーの組み合わせを選択します。 </li><li> 800×600ピクセルの最小の画像の解像度を設定します。 </li><li>落射蛍光を利用して、関心領域を特定し、徐々に対物レンズ40倍に倍率を上げる。 </li><li>レーザー走査顕微鏡（LSM）モダリティに切り替えます。 </li><li>光電子増倍管（PMT）と、各チ​​ャンネルのゲインを調整するために繰り返しスキャンを実行します。レーザは、セットを容易にするために個々にオンにすることができる。不要な非特異的シグナルを避けるために、可能な限り低く、利得を保持します。 </li><li> REPEとtitiveスキャン実行して、z軸（合計z軸の長さ=10μm）を、下限および上限の極端な値を定義するためにフォーカス制御を移動する。 </li><li>反復的なスキャンを停止します。 </li><li>ステップサイズを定義します。これは、z軸上で1：01標準サイズ比を得るために、画素サイズ（0.225ミクロン）のできるだけ近くにあるべきである。 </li><li>カルマンフィルタを少なくとも2回をアクティブにします。 </li><li>ブリードスルー効果を避けるために、シーケンシャルスキャンモードを有効にします。 </li><li>ハーフウェイz軸に沿って移動し、XY順次スキャンを実行します。 PMTの設定およびゲイン（良好な信号/ノイズ比）を確認してください。満足できない場合は、手順2.6を繰り返します。 </li><li> XYZ買収を実行します。 </li><li> multitiffファイルとしてデータをエクスポートします。各multitiffファイルは、通常、3色チャネル（青、緑、赤）と44の焦点面が含まれています。 </li></ol> 3。共焦点取得の立体図と3次元レンダリング IMARISソフトウェアにmultitiffファイルをアップロードし、次のようにそれらを処理する。 <ol><li>オープンソフトウェア。 </li><li> 上回るビューを選択します。 </li><li> multitiffファイルをアップロードします。 </li><li>各チャネルの希望の色を選択します。 </li><li> 表示調整パネルの最小値を大きくすることにより、バックグラウンドのノイズを除去する。個別に各チャネルを調整します。 </li><li> セクション·ビューに移動します。共局在（黄ピクセル​​）を探して、Z軸に沿って移動する。 </li><li> （ すなわち、固体のオブジェクトに属している）の共局在は、z軸に沿って存在しているかどうかを見るために、黄色のエリアをクリックしてください。 Z軸投影は、図の右と下の部分に表示されます。 </li><li>スナップショットを作成します。 </li><li>ビューを上回る戻ります。 </li><li>細胞または細胞のクラスターを単離するために、3Dをトリミング。 </li><li> 表示調整パネル上の1チャンネルを選択します。 </li><li> 上回る/サーフェスアルゴリズムビルダーを選択します。アルゴリズムステップ： <ol><li>チャンネルを選択します。 </li><li>しきい値を定義します（Tで同じ最小値を使用彼は） 調整パネルを表示します 。 </li><li>サイズ変更を定義します。 </li><li> （0.200 =最良）スムージング定義します。 </li><li>色の外観を定義する。 </li><li>アルゴリズムを終了する。 </li></ol></li><li>各チャンネルについて、手順3.12。 </li><li> 表示調整パネルの蛍光チャネルの選択を解除し、すべての3 の面を選択します。 </li><li>最高の景色を見つけて、ボリュームを移動します。 </li><li>スナップショットを作成します。 </li></ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
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<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは虚血領域への局在化およびM / M表現型マーカーの共発現を調査するための強力なアプローチ（より詳細な分析のために、参考文献6を参照）のような三次元共焦点解析に続いて免疫蛍光ベースのプロトコルを提示する。この方法は、3次元共焦点イメージングとM / Mの活性化の関連マーカーの特異的染色を兼ね備えています。抗体、血清および作業希釈液をfluorconjugatedの微調整を検討したマーカーのSN比に最適な信号を可能にする。三次元レンダリングを得るための画像処理は、M / M.の機能状態を示す取得された画像を作り、セルのクラスタ内のマーカー発現の定義を可能にする研究が増えて、今のM / Mは、多様な表現型を獲得し、周囲の信号に応じて、異なる機能のプログラムを係合することができる、高度なプラスチック細胞であることに同意するものとします。炎症環境は、時間の経過とともに進化し、組織化することがM / Mの偏光、in vivo試験の方がはるかに有益in vitroモデルよりも、リクルート/活性化した細胞の完全なネットワークを再現することができないこと。 <p class="jo...

急性脳損傷の後、ミクログリアは急速に活性化し、劇的な形態学的および表現型を受けている1〜3に変更されます。この組み込み関数応答が負傷脳実質4,5内に移動血液由来のマクロファージの動員に関連している。脳損傷における抗原的に区別できない小膠細胞およびマクロファージの役割（以下、M / Mという）まだ議論されている。研究が増えても同様に、末梢マクロファージについて記載されたものに、ミクログリアおよび脳はマクロファージが、その極端な（M1）の古典的な前炎症性毒性または抗炎症保護（M2）の表現型に対応して異なる表現型をとることができる募集、ことを示している。炎症または抗炎症因子の分泌を含む異なる活性化状態、神経栄養性分子およびリソソーム活性の放出は、その発現が時間的に依存する表現型マーカーの特定のパターンによって特徴付けられる周囲の環境の進化。負傷した脳内のこれらのM / Mの表現型の特徴付けはまだ乏しいです。私たちは、脳卒中後のM / Mの発現と進化を分析するpMCAOのの老舗マウスモデルを使用していました。ここで紹介する免疫蛍光ベースのプロトコルは、特定のM / M表現型マーカー、それらの局在と虚血領域における細胞の共発現の外観への洞察を得ることを目指しています。我々は、異なる活性化状態または表現型に関連するいくつかの分子を調べ、すなわちのCD11b、白血球及びM / Mの活性化/人材紹介6-8の広く使われているマーカーによって発現される表面マーカー、CD68リソソーム6,7とYm1は分泌のマーカータンパク質は、代替的にアクティブ化（M2）、マクロファージで発現し、回復と機能回復9月10日に関連付けられている。 2マーカーが同じセルによってではなく、様々な細胞内コンパートメントで表現されている場合、単独の共局在はあまりINFできない場合がありますormative。この場合、共発現の分析は、単一の平面図を用いて三次元レンダリングを行うことができる。ここでは、マーカーの同時発現の完全な三次元解析を得るためのプロトコルを記載している。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD11b</td><td>Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td><td></td><td></td></tr> ラット <tr><td>アンチマウス CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211;chst 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated Goat Anti-Rat antibody</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 System </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクター研究所</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr> <tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 共焦点顕微鏡 </td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS ソフトウェア</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris ソフトウェア 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアパッケージ GraphPad Prism バージョン 4.0</td><td>GraphPad Software株式会社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

脳卒中のミクログリア/マクロファージの後に（M / M）は、新規表面抗原の発現および構築し、炎症反応を維持するメディエーターの産生を含む劇的な形態学的および表現型変化と急速な活性化を受ける。新たな証拠は、M / Mは、急性脳損傷後の古典（M1）の炎症誘発性または代替抗炎症（M2）の活性化を引き受けることができる、高度なプラスチック細胞であることを示しています。しかし負傷した脳内のM / Mの表現型マーカー発現、彼らの共局在的、時間的進化の完全な特徴付けは、依然として行方不明です。 具体的にはM / M活性化の関連するマーカーを免疫蛍光染色プロトコルは、虚血性脳内で行うことができる。ここでは、局在化およびのようなM / M表現型マーカーの共発現パターンを調査するための強力なアプローチとして、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを提示のCD11b、CD68、Ym1は、中大脳動脈（pMCAOの）の永久閉塞によって誘発される局所的虚血のマウスモデルにおいて。染色された領域の二次元解析では、各マーカーが定義され、M / Mの形態に関連しており、虚血性病​​変内の指定されたローカライズを持っていることが明らかになった。 M / M表現型マーカーの共発現のパターンは、虚血領域における三次元共焦点イメージングによって評価することができる。画像は、ブリードスルーの影響を最小限にし、波長の重なりを回避する順次走査モードで（180 X 135×10ミクロンの体積に相当する、10〜z軸と0.23μmのステップサイズ）規定された体積にわたって取得することができる。画像は、IMARISソフトウェアを用いて三次元レンダリングを得るために処理される。 3次元レンダリングの固体ビューは細胞のクラスターにおけるマーカー発現の定義を可能にする。我々は、M / M、病変部位およびtiの場所に応じて、多数の表現型に分化する能力を有することを示す私損傷後。

標識プロトコルおよび共焦点買収が虚血領域に行われる場合の結果の一例が図1Aおよび図1Bに示されている。取得された画像の二次元図で二十四時間虚血（A）の後で、リソソームマーカーCD68（緑）が虚血性コア中に存在する肥厚性アメーバ様CD11b細胞（赤色）において発現されることを示している。ボーダーゾーン（B）にはCD11b陽性細胞は、丸い細胞体とCD68に対する肯定枝状のプロセスを表示します。 Z軸突起（右と下の部分A及びB）は、単一の平面図に記載されたマーカーの分布はまた、z軸に沿って存在するか否かの可視化を可能にする。共局在が発生した場合には、黄色のピクセルが生成されます。 CD11bのは、C3フラグメントのための受容体であり、膜の分布を示す。 CD68は、リソソームにラベル付けし、主に細胞質ゾル中にこのように存在している。 CD11b/CD68二重陽性細胞は、通常、共局在ボクセルの小さな割合を有し、ほとんどの場合には、CD11bのCD...

脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

本実験の目的は、脳虚血後におけるミクログリア・マクロファージ表現型マーカーの発現と細胞内局在を可視化することである。まず、虚血マウス脳の凍結切片を染色し、ミクログリア・マクロファージ活性化のマーカーを同定する。その後、染色した切片に対して3次元共焦点イメージングを行う。得られた画像は、3次元レンダリングを生成するために処理され、画像解析によって細胞クラスターにおけるマーカーの発現部位を特定します。得られたデータは、特定の細胞体にマーカーの発現を正確に割り当てる上で、3次元共焦点解析が有効であることを示しています。2つのマーカーが同一細胞内の異なる細胞内コンパートメントで発現している場合、共局在解析だけでは十分な情報を得られないことがあります。ここで実演するように、3次元解析を用いることで、より高い解像度と精度が得られます。この手法は、虚血性損傷に対する脳反応の複雑さを解明できるだけでなく、損傷と修復においてミクログリア・マクロファージが二役を担うことが提唱されている他の急性または慢性の疾患にも適用可能です。あるいは、異なる空間平面でシグナルを選択的に局在化させる必要がある場合にも有用です。Carlo PerigoとStefan of Magaliが、本手順の各ステップについて解説します。以下のプロトコルでは、中大脳動脈の永久閉塞によって虚血を誘発させたマウス脳組織を使用します。クライオスタットを用いて、脳の冠状断 20 micron 連続切片をゼラチンコートスライドグラス上に採取します。カバーガラスを使用します。試薬およびサンプルは、使用前にすべて室温に戻してください。なお、付属文書に記載されている抗体および血清の使用希釈倍率は、異なる抗体や血清を使用した場合に最高のパフォーマンスを得るために行われた検討の結果に基づいています。プロトコルのバリデーションが必要です。まず、試薬の使用量を最小限に抑えるため、リキッドブロッカーペンを用いてスライド上の切片を囲みます。次に、1 mLピペットを使用して、脳切片をウェットチャンバーに入れます。切片に室温のPBSを加え、5分間インキュベートして洗浄します。次に、針付きの1 mL使い捨てシリンジを用いて溶液を除去し、洗浄をもう一度繰り返します。2回目の洗浄液を除去した後、1 mLピペットと使い捨てシリンジを用いてすべての溶液交換を行い、サンプルの染色に進みます。染色の手順は、こちらにまとめられている通りに実施してください。洗浄ステップを含む詳細は、付随するテキストを参照してください。まず、正常ヤギ血清でブロッキングした後、細胞を1% hydrogen peroxideでインキュベートします。次に、CD 11 Bに対する一次抗体でインキュベートします。その後、適切な二次抗体でスライドをインキュベートし、続いてtriss, NACL tween buffer（TNT）で洗浄し、TNBでのインキュベーション後はtriss, H-C-L-N-A-C-L ブロッキングバッファー（TNB）で洗浄します。スライドをストレプトアビジンHRPでインキュベートし、続いて免疫蛍光シグナルを増幅させるシアニン5 tyramを含む増幅希釈液で処理します。次に、非特異的結合部位をブロックするために、スライドをNGSでインキュベートします。その後、CD 68に対する一次抗体でインキュベートします。一次抗体でインキュベートした後、細胞を適切な蛍光標識二次抗体でインキュベートし、続いてDNAを標識するために1 µg/mLのHoechstで処理します。染色の完了後、Prolong Goldを用いて凍結切片を封入します。封入の際は気泡が入らないように注意してください。解析を行うまで、切片を4 °Cの暗所で保存します。蛍光信号の取得は1週間以内に行う必要があります。本プロトコルでは、3本のレーザーライン（488 nanometersのアルゴン・クリプトン、646 nanometersのヘリウムネオンレッド、532 nanometersのヘリウムネオングリーン）およびU 500ソフトウェアのフルー内のUVダイオードを備えた共焦点スキャンユニットFV 500を搭載したIX 81顕微鏡を使用します。適切な励起レーザーとダイクロイックミラーを選択してください。また、画像解像度を最低でも800 × 600ピクセルに設定します。次に、スライドを顕微鏡のステージに設置し、エピ蛍光を用いて関心領域を特定し、倍率を段階的に上げて40x対物レンズに合わせます。その後、レーザースキャニング顕微鏡モードに切り替え、各チャネルの光電子増倍管の出力レベルとゲインを調整しながら、繰り返しスキャンを行います。これにより、異なる波長での同時励起によって生じる信号の重なりを低減できます。不要な非特異的信号を避けるため、ゲインは可能な限り低く設定してください。繰り返しスキャンを継続しながら、フォーカスを調整し、Z軸の全長を10 micronsとしてZ軸の下限と上限を定義します。次に、反復スキャンを停止します。続いて、ステップサイズを入力します。この値は、ピクセルサイズである0.225 micronsにできるだけ近づけて設定してください。これにより、ソフトウェア上でZ軸方向に標準的な1:1のサイズ比が得られます。カルマンフィルターを少なくとも2回作動させてください。カルマンアルゴリズムは、背景ノイズに起因する単一の正のボクセルなどのランダム信号を除去する反復関数であり、これによりSN比が向上します。次に、ブリードスルー効果を回避するために、シーケンシャルスキャンモードを有効にします。Z軸の中間点に移動し、XYシーケンシャルスキャンを実行します。十分な信号対雑音比（S/N比）が確保されているか、PMTの設定とゲインを確認してください。その後、XYおよびZのデータ取得（acquisition）を行ってください。データをマルチTIFファイルとしてエクスポートします。通常、各マルチTIFファイルには、処理用に3つのカラーチャンネルと44の焦点面が含まれています。まず、imasソフトウェアを開いてください。まず、surpassビューを選択し、マルチTIFファイルをアップロードします。次に、ディスプレイ調整パネルで、各チャンネルの希望の色をここで選択してください。赤はCD 11 B、緑はCD 68、青はhooks DNA染色を表します。背景のノイズを除去するには、ディスプレイ調整パネルで各チャンネルの最小値を上げてください。次に、セクションビューに移動し、X、ZおよびYZ軸の直交投影を伴う単一のXY焦点面を可視化します。Z軸に沿って移動し、黄色いピクセルとして表示される共局在を探します。黄色い領域をクリックして、Z軸に沿って共局在が存在するかを確認します。これにより、それが立体的なオブジェクトのZ軸に属しているかどうかが分かります。投影図が図の右側と下側に表示されています。スナップショットを撮り、サプレスビューに戻ります。次に、編集ドロップダウンメニューから「crop 3D」を選択し、関心領域を囲んで細胞または細胞クラスターを分離します。次に、ディスプレイ調整パネルでチャンネルを1つ選択します。「surpass surfaces」アルゴリズムビルダーを選択してください。続いてアルゴリズムを設定するため、まずチャンネルを選択します。次に、しきい値を表示調整パネルで設定した最小値と同じ値に定義し、必要に応じてリサイズを定義します。続いて、スムージングを0.200に定義します。カラーパネルを選択し、必要に応じて外観を変更します。各チャンネルに対して、surpass surfacesアルゴリズムビルダーの設定を繰り返します。次に、ディスプレイ調整パネルで蛍光チャンネルの選択を解除し、3つのサーフェスすべてを選択します。最後に、ボリュームを移動して最適なビューを探し、スナップショットを撮影してMMマーカーの共発現パターンを判定します。このビデオで説明する免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡による画像取得のプロトコルは、中大脳動脈の永久閉塞によって誘発された焦点性虚血のマウスモデルを用いて実施されました。取得した画像の二次元ビューでは、虚血後24時間において、虚血コアに存在する赤色で示されるCD 11 B陽性細胞の肥大化した細胞内に、緑色で示されるリソソームマーカーであるCD 68が発現していることが分かります。右下に示されたZ軸投影図は、単一平面ビューで記録されたマーカー分布が、境界領域のZ軸方向にも同様に存在することを示しています。CD 11 B陽性細胞は肥大化した細胞体を示し、突起においてCD 68が高陽性であることから、ファゴソームが細胞膜に結合していることが示唆されます。これは、M2極性化のマーカーであるCD 68とYM1の共発現を評価した際の、ミクログリア細胞の活性なPHA酸性挙動を示すものです。蛍光画像に対して3次元レンダリングを行いました。ここに示した取得画像の3次元ビューでは、緑色の蛍光ボクセルで示されるCD 68陽性細胞と、赤色の蛍光ボクセルで示されるYM-1陽性細胞の存在が示されています。これらが平行に配置されている場合、観察者の視点によっては黄色い共局在シグナルが見えることがありますが、これはマーカー間の実際の距離とは無関係である可能性があります。共局在を定義するには。Z軸に沿って移動しながら、Z軸の投影を含む単一平面ビューを生成します。共局在を確認します。Z軸の投影は、この画像の右側および下側に示されている通りに取得されます。蛍光ボクセルは、マーカーの発現を特定の細胞体に割り当てて3次元レンダリングを行うことで、立体オブジェクトに変換できます。高倍率での観察および3Dレンダリング後、2つのマーカーは近接した異なる細胞に属しているように見えます。このビデオを視聴することで、複数のマーカーと染料を用いた免疫蛍光染色の方法、および共焦点顕微鏡による3次元画像の適切な取得と可視化方法について十分に理解できるはずです。さらに、上述の後処理解析を用いることで、細胞レベルでの共発現や共局在の解析、あるいは異なる空間平面で選択的にシグナルを局在化させる必要がある場合の解析に有効に活用できます。

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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二光子生体内イメージングは、背柱外傷性脊髄挫傷を負った骨髄キメラ動物の天然組織環境における脊髄の異なる細胞タイプ間の相互作用を調査するために使用することができます。...

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

ミクログリアは、調査、定量的評価されるかもしれない形態の変化によって変えられた脳生理学に反応する脳の免疫細胞です。このプロトコルの概要、ImageJ...

免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

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マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色

脳挫傷を伴う実質内出血や神経炎症は、重度の二次性脳損傷を引き起こす可能性があります。このプロトコルは、マウス制御皮質衝撃(CCI)モデルの詳細を詳述しており、研究者は出血、挫傷、心的外傷後免疫応答を研究し、潜在的な治療法を探求することができます。...

外傷性出血挫傷および神経炎症に対する前臨床制御皮質衝撃モデル

このプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷に対する神経炎症性および血行力学的応答を特徴付け、部分最小二乗回帰を用いた多変量系分析の一部としてこれらのデータを統合する方法を提示する。...

外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。...

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プロトコルは、マウスモデルにおける軽度の外傷性脳損傷について説明しています。特に、軽度の正中線閉鎖頭部外傷を誘発するための段階的なプロトコルおよび動物モデルの特徴付けが完全に説明されている。...

マウスにおける軽度外傷性脳損傷の電磁制御クローズドヘッドモデル

損傷した脊髄のミクログリア(MG)と末梢浸潤マクロファージ(Mø)の同定は困難です。このプロトコールでは、フローサイトメトリー(FCM)を使用して、それぞれM1様MG、M2様MG、M1様Mø、およびM2様Møを同定しました。この技術は、MGとMøの役割を理解するために、他の中枢神経系疾患にも適用できます。...

フローサイトメトリーを用いた損傷脊髄のミクログリアおよび末梢浸潤マクロファージの同定

ここでは、ミニ脳卒中モデルでのフローサイトメトリー分析を使用して、虚血性脳卒中後の免疫細胞機能を評価するためのプロトコルを紹介します。この方法は、神経免疫相互作用の詳細な調査を可能にし、他の神経変性疾患の研究にも適応できるため、脳卒中病理における免疫応答の理解を深めることができます。...

ミニ脳卒中マウスモデルにおける神経免疫相互作用の単離とフローサイトメトリー評価

マッピングミログリアパラメータソフトウェア(MMPS)は、コーディングの専門知識を必要とせず、免疫蛍光画像から単細胞微粒細胞形態学解析を半自動化するユーザーフレンドリーな解析パイプラインです。齧歯類リポ多糖誘発神経炎症モデルで検証され、MMPSは活性化に関連する形態変化を再現性可能に検出し、標準化され拡張可能なミクログリア表現型化を可能にします。...

マッピングミクグリアパラメータソフトウェア(MMPS):定量的なミクログリア形態分析のためのオープンソースで使いやすいツール

学ぶ マウス脳虚血モデルにおけるミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点イメージング法。免疫蛍光染色と3Dレンダリングにより、炎症応答の細胞動態を正確に解析し、神経科学研究への応用可能性を示す。

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

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