Name: 免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶImageJを用いたミクログリア形態の定量化法。免疫組織化学処理した脳組織の顕微鏡写真から、スケルトン解析とフラクタル解析で細胞の複雑さを測定し、神経炎症におけるミクログリアの機能を解明する。

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本研究は、NINR (F32NR013611) から金融サポートを受け取った。さらにお客様し、AnalyzeSkeleton(2D/3D) と FracLac の開発者に感謝したいと思います (アルガンダ ・ カレーラスらや Karperienら、それぞれ) を記載分析不可能なし。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ミクログリア細胞生理学および病理学のマイクロ ドメイン内には、細かくチューニングし、微妙な7,14の総損傷8形態2の多様な範囲を表示します。ImageJ プロトコルの使用は、プラットフォームとしてミクログリアの形態の定量化をすべて研究所にアクセスできるように、プラグイン、オープン ソース画像処理ソフト。記述されていたプロトコルは画像処理と解析のこのソフトウェアを使用して焦点を当て、信頼性、妥当性、データ コレクションの整合性は、優れた IHC と顕微鏡によって始まります。このプロトコルを使用してバイナリ、スケルトン、および全体の顕微鏡写真と単一セルのアウトライン表現の向上が、貧しい IHC 染色の場所を取ることができないと低コントラストになる顕微鏡がぼやけて、または画像の歪み。追加の考慮事項としてミクログリアの形態を決定的に変えるごとに区分化する前に、ストレージの中に脳を平らにしないように注意する必要があります。最後に、各実験内、ミクログリアは同じ顕微鏡と同様に、同じスケールを使用して視覚化される必要があります。計測、目標、およびソフトウェアは、同様の目的にもかかわらず異なるサイズの顕微鏡写真の結果、各フレーム内のセルの数と同様、細部が変更された顕微鏡の間で異なります。たとえば、ライカ SPII で 40 × 対物を使用してイメージ買収の結果ほどツァイス 880 を使用してより詳細なデータとセルの数 2 回で。これは、このデータのサンプリングの問題になりますフレーム全体ではなく、単一のセルからセル分岐データにとって特に重要。
一般に、全体の顕微鏡写真を生かしたスケルトン分析 2 つの理由のため単一細胞のフラクタル解析の前に。顕微鏡写真のすべてのセルの決定のセル分枝は急速な単一細胞のフラクタル解析と比較して、時間が重要な場合、スクリーニング ツールとして考慮されるかもしれない。さらに、スケルトン分析中に派生したバイナリ イメージはフラクタル解析の使用します。このイメージを作成すると、一度スケルトン分析結果に影響を与える可能性があります、ユーザー影響を紹介する重要な手順の数があります。ユーザー間のほとんどの変数は、プロトコルの手順ステップ 4.2 (増加のイメージの明るさ)、ステップ (しきい値の決定) 4.5。可能であれば、輝度 (0-255 の間 max または min スライダー) を高めるための最適な数が決定、すべての画像とユーザーの一定に保たれます。画像変動は素晴らしいが、ユーザーは画像によって異なります明るさを代わりに選択できます。また、画像は明るく、コントラストが高い場合、省略できますし、明るさを増加と専門のしきい値フィルターを使用して、しきい値を標準化できます (e.g。、黄) より変数の既定値ではなく。最適化されれば、追加ユーザー影響を最小限にするためにパラメーターを従う必要があります。
ユーザーの変動の例を図 5に示します。ユーザー 1 とユーザー 2 に増加したデータ値、したがってユーザー 1 とユーザー 2 はデータの収集に貢献した場合、変動を増加するでしょう。ユーザー 1 とユーザー 2 のバイナリとスケルトンのイメージの違いの例は色のついた丸 (図 5) で強調表示されます。この場合、両方のユーザーはミクログリアの限られた専門知識を持つ簡潔に訓練を受けた学部生だった正規監督とミクログリア増加プロトコル トレーニング2と共に専門家による指導・助言は、ユーザ間の可変性を減らすことができます。ここで評価されていません、フラクタル解析がユーザ間変動の影響受けにくいバイナリ細胞ミクログリアの図形を決定するしきい値に頼るのではなく、顕微鏡写真から手動で、個別に分離されているため。ただし、すべてのメソッドは、ユーザー間のいくつかの変動を持っています。したがって、単一のユーザー (理想的には、ミクログリア細胞のいくつかの専門知識によって訓練) データセット全体のデータ収集を完了する必要があります。
追加の変更はこのプロトコルを簡単に行うことができ、画質とノイズを低減し、プロセスの接続を確保する取り組みによって異なります。たとえば、コントラストが適切な場合、アンシャープ マスク必要はありませんし、省略することができます。最適化し、画像、実験例、セット全体からデータを収集する前に、コントロールの特定のセットのプロトコルを完了することをお勧めします。明確またはこのプロトコルに記載されたいない画像をシャープに代わりに他の最後に、追加プラグインを使用するようにさせるか、または研ぐ。
このプロトコルの利点は、その普遍的な可用性と適応性です。さらに、AnalyzeSkeleton を使用してセルの結果を評価する方が迅速かつ全体の顕微鏡写真に適用です。多細胞の解析アプローチの利点は単一のセルではなく、地域全体に焦点を当てるです。そのため、画像内のすべてのミクログリアの (エンドポイント ・ プロセスの長さの面で平均分枝を迅速に評価することが可能です。スケルトン分析を提供する複数のセルの解析: 顕微鏡写真からの単一のセルを隔離する必要な時間の投資のためのフラクタル解析を用いた一致ことはできませんセル数の面でデータ サンプリング。スクリーニングの焦点の傷害に近接電波のミクログリアの形態で最適ありますインスタンスになります。1 つの制限は、IHC 顕微鏡写真のスケルトン モデルを作成するフィールド全体イメージのレンダリングがより時間がかかる単一セル方式と比較して完璧ではないです。さらに、領域の分析は状況に適切なミクログリアの形態が大きく異なる同じフィールド内です。最後に、この分析法は細胞数、実験条件が異なる場合がありますパラメーターに依存しています。
フラクタル解析は、単一のセルに実施し、したがってスケルトン分析で得られた平均セル分岐データ出力を補完します。ただしより多くの時間がかかり、この投資は、地形データの広い範囲を得られます。たとえば、細胞の密度、スパン比と真円度データ サイズ、伸長、およびセル アウトラインの形をそれぞれについて説明します。フラクタル次元とベクトルは、それぞれセル複雑さと図形の不均一性をまとめたものです。インタラクティブ マニュアル16で各パラメーターの計算方法とデータがどのように解釈されるかもしれないの詳細な概要を提供し、そのような詳細は、具体的な研究の質問に関連して考慮すべき。生理学的および病理学的条件で発生する可能性があります 2 D ミクログリアの形態の小さな変化を定量化する敏感なツールで説明されているプロトコル結果。堅さ、凸状、フォーム ファクター16,20など追加形態計測学的解析が可能な 3次元形状を生成する場合あります。
プロトコルの開発と適応は継続的かつユーザー駆動です。それは蛍光8からパラフィン埋め込まれた組織に DAB/明視野画像7がまだ拡張されています。これまた、詳細な分析、Imaris など独自のソフトウェアと組み合わせて使用されることができます。このプロトコルさまざまな生理学に適用することができます、ミクログリアに限定されない、任意のセルまたはティッシュ特定のパターンまたは IHC メソッドを使用して識別することができる図形に適用されます。最後に、十分なサンプル サイズを持つ多変量またはクラスター分析に適用できる形態12,21によるとミクログリアを階層化これは、ミクログリアの形態はミクログリアの機能とその周辺への応答の重要な指標として意味のある情報です。ミクログリアの形態学的多様性のための感謝は、拡大と健康と病気の間にニューロン-グリア細胞血管の相互作用を十分に理解することが重要です。この分野の成長は、定量化し、複数の連続変数を用いたミクログリアの形態を要約のよく発達した、使いやすく、再現性のあるプロトコルによって強化されています。

ミクログリアは、脱分岐し、アメーバ形態2 にハイパー分岐と非常に複雑な形態からその範囲可能性の連続体に沿って脳生理学1で変化への迅速かつ多様な形態学的応答を持っています。.ミクログリアは、偏光と棒状の3もなります。ミクログリア細胞分岐は複数のプロセスを持つ複雑な形状としてよく定義されているし、セルごとのエンドポイントの数や細胞プロセスの長さとしてしばしば報告されています。ミクログリアの形態が多様な細胞機能と機能障害の指標として役立つかもしれないミクログリアが細かく連続細胞間クロストークとin vivo運動4,5を介して神経細胞およびグリア細胞の機能に調整されているので脳内。定量的アプローチ (てんかん5,6など微妙な生理学的な摂動で発生する分岐し細胞間の違いを区別するためにこれらの形態学的変化の多様性を十分に説明する必要があります。脳震盪7) (ストローク8) など総損傷に加えて。形態の定量化7,8,9,10、11,12,13,14の使用の増加健康と病気の間にフル ミクログリアの形態の多様性を明らかになります。本研究は ImageJ プラグイン ミクログリアの蛍光または非蛍光性顕微鏡写真からミクログリアの形態を要約する必要の段階的な使用は、免疫組織染色 (IHC) 後固定の齧歯動物のティッシュで取得した情報。
中央ここで説明されている分析手法には、ImageJ プラグイン AnalyzeSkeleton (2 D ・ 3 D)15、乳腺の大型構造物を定量化する 2010年で開発された FracLac16, 2014 年 ImageJ とフラクタル解析を統合するために開発されました。個々 のミクログリア図形を定量化します。これらのプラグインは、全体の顕微鏡写真内ミクログリア分枝の迅速分析または顕微鏡写真内で定義された投資収益率の複数のミクログリアを提供します。この分析は、単独またはフラクタル解析を補完するために使用可能性があります。単一セルのフラクタル解析 (FracLac) は時間の投資が必要ですが、ミクログリアの複雑さ、形状、およびサイズに関する複数の形態の出力を提供します。両方のツール使用は冗長ではありません、分枝はセルの複雑さに相補的な細胞として、データセット12,17内の多様なミクログリアの形態を区別する複数のパラメーターの組み合わせを使用することがあります。

<table><tbody><tr><td>一次抗体抗IBA1</td><td>和光&nbsp;</td><td>019-19741</td><td>ウサギ宿主</td></tr><tr><td>Vectashield ソフトマウント</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>ロバ宿主</td></tr><tr><td>4 mL ガラスバイアル</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫組織化学準備 imagej を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

ミクログリアは脳食脳のホメオスタシスに参加し、疾患、損傷、機能不全のために環境を継続的に調査します。最初のレスポンダーとしてミクログリアは、ニューロンとグリア細胞の機能障害を軽減するために重要な機能を持っているし、この過程で、彼らは広範な形態学的変化を受けます。ミクログリアの形態は唱え分類できます。 または、または、セルの分枝、複雑さ、および図形などのパラメーターを連続変数として定量化することができます。ミクログリアを定量化するためのメソッドは、単一のセルに適用される、ほとんどのテクニック全体の顕微鏡写真で複数のミクログリアに適用されません。このメソッドの目的は、複数を定量化して容易に利用可能な ImageJ プロトコルを使用して単一セル。このプロトコルの手順の概要は、ImageJ プラグインの蛍光および明るいフィールド顕微鏡写真を代表的なバイナリとスケルトンの画像に変換し、それらを分析するをお勧めします AnalyzeSkeleton (2 D ・ 3 D) と FracLac のソフトウェアのプラグインを使用して、データ収集の形態。これらのプラグインの出力は、プロセスのエンドポイント、接合、および長さの複雑さ、セル形状とサイズの記述子の面で細胞の形態をまとめたものです。記載スケルトン分析プロトコルは、FracLac は、相補的な個々 のセル分析を提供に対し全体の顕微鏡写真や利益 (率 ROI) の領域内の複数のミクログリアの地域分析に適して。プロトコルは組み合わせることで、目的、多様なミクログリアの形態の健康と負傷者の脳内に存在間を分類する使用ことができます、敏感で、包括的なアセスメント ツールを提供します。

ミクログリアの形態分析のプロトコルに記載は、蛍光のおよび形態計測学的解析のための軽打の顕微鏡写真の処理に役立つ手順をまとめたものです。これらの手順を図 2に視覚的にまとめますと図 3。これらの手順の目標は、蓄積されたデータが有効になるよう適切に元の顕微鏡写真をモデル化する代表的なバイナリと白骨イメージを作成することです。プロトコル アプリケーション後 AnalyzeSkeleton プラグインの結果からタグ付けのスケルトン画像エンドポイントや支店の数 (すなわち。、プロセス) でできた金管楽器は、結果として得られる出力ファイルから要約します。エンドポイント ・ プロセスの長さデータは、顕微鏡写真や投資収益率のミクログリア分枝の程度を推定する使用されます。図 4は、プロトコル アプリケーションと収集結果のデータ (エンドポイント/セルとプロセスの長さ/セル) をまとめたものです。同様の傾向が存在する図 4 階に集約されたデータは図 4Eに比べて変化が少ないです。これらのデータが、プロトコルが適用されたときのグループ間の違いを検出する感度の向上を説明するさらに、します。最後に、ケアは、プロトコルのアプリケーションにおけるユーザ間変動に関する取られなければなりません。図 5上述と同じプロトコルを適用する 2 つの独立したユーザーが同じデータ セットを行ったによってこのような違いをまとめます。
その他の形態のデータは、プロトコルの適用時に作成されたバイナリ イメージから分離された単一のセルから収集されます。前にミクログリアの形態および図 6に FracLac プラグインをまとめてを使用して分析するプロトコル手順。我々 は両方無傷 (図 6 a) でこの分析を説明し、(図 6 b) 組織を負傷しました。バイナリ、アウトライン、ハル/カプセル化円、およびボックスのカウント例で各セルを分析し、図 6-f.に表示されますアプリケーション プロトコルを使用せずに凸の代表的な画像これらのイメージは、図 6に示す形態データの相違の起源を説明するために役立ちます。
<img alt="ニューロントレース図;循環型体型と単一起源型体型。蛍光オーバーレイ;ニューラルネットワークマッピング。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1。(最適な) 単一の起源相馬と白骨細胞と元の顕微鏡写真の対応するオーバーレイ (準) 円形相馬と白骨ミクログリアのイラスト。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="画像処理ステップ:グレースケール、斑点除去、バイナリを含むタグ付き骨格への顕微鏡オリジナル。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2。蛍光顕微鏡写真にアプリケーションをプロトコルします。詳細を表示する単一細胞の蛍光顕微鏡写真に適用されるスケルトン分析プロトコルのイラストをトリミングしました。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="ニューロン構造解析のための画像処理シーケンス。FFTフィルター;グレースケール;スケルトン図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3。明視野 DAB にプロトコル アプリケーション顕微鏡写真。トリミングの詳細を表示する単一のセルに明視野軽打の顕微鏡写真に適用されるスケルトン分析プロトコルのイラスト。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="ニューロンプロセス分析;顕微鏡画像、プロトコル比較、エンドポイント/セルを示すグラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4。データ分析とプロトコル アプリケーションなし。(A) (B) で黄色い箱に対応する蛍光 IHC とトリミングの例の顕微鏡写真。例のバイナリと白骨画像 (C) および (D) に従って適用プロトコルなし。ミクログリア エンドポイント/セルとプロセスの長さ/セルの集計データ (白) を無傷し、プロトコルの適用なし (F) (E) (グレー) 大脳皮質組織を負傷しました。スチューデント t 検定と n を使用して統計分析、3 を = * * p &lt; 0.01 を表します。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="ニューロン形態分析;画像処理とデータグラフ。バイナリ、スケルトン図、統計結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5。プロトコルのアプリケーションとユーザーの違い。ユーザー 1 とユーザー 2 がバイナリとスケルトンの画像にオリジナル画像とプロトコル変換の例です。色のついた丸が一致する 2 つの画像間の相違点がハイライトされます。ユーザー 1 とユーザー 2 が無傷と負傷者の脳領域におけるミクログリア エンドポイント/セルとプロセスの長さ/セルのデータの概要のグラフ。統計分析分散分析とサンプル サイズが n = 3;p &lt; 0.05 * *p &lt; 0.01 * * *p &lt; 0.001。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="形態学的比較を伴う神経損傷分析。ミクログリアに対するプロトコル適用効果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図 6。フラクタル解析プロトコル アプリケーションと。無傷 (A) と (C) 対応するバイナリおよび適用プロトコルと結果概要 (D) 画像で負傷した (B) 皮質におけるミクログリアのトリミングの顕微鏡写真の例です。関連付けられている凸型ハル (青) と対応するアウトライン図形 (E) (ピンク) サークル囲む形密度計算、比率、および真円度 (G) にまたがるされます。ボックスカウンティング法は (F) に示す、フラクタル次元 (D ・B) とベクトル (λ) 計算 (G) に使用します。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ミクログリアは、調査、定量的評価されるかもしれない形態の変化によって変えられた脳生理学に反応する脳の免疫細胞です。このプロトコルの概要、ImageJ ベースのセル分枝、複雑さ、および図形などによると継続的なデータとしてミクログリアの形態を表す解析プロトコル。

免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

これらのスケルトンおよびフラクタル解析法の全体的な目標は、IHCで調製した組織からミクログリアの形態を測定することであり、本質的にハイスループットであり、細胞形状のわずかな違いを検出するための感度の高い定量的方法を使用して測定します。この方法は、健康と病気の間のミクログリアの形態と機能のニュアンスを定義することにより、神経炎症領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、カテゴリ変数ではなく連続変数を使用してミクログリアの形態を定量化できることです。ここで説明する方法は、プロプライエタリなソフトウェアを必要とせず、脳領域のスクリーニングや細胞ごとの解析に使用することができます。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるキンバリー・ヤングです。開始する前に、AnalayzeSkeleton プラグインが ImageJ または Fiji にダウンロードされていることを確認してください。次に、免疫染色された脳のIba1を示す30ミクロンのZスタックを開きます。蛍光顕微鏡写真を使用する場合は、画像が8ビットであることを確認し、グレースケールに変換して、すべての陽性染色を最適に視覚化します。ツールバーを使用して、[イメージ]、[ルックアップ テーブル]、[グレー] の順にクリックします。DAB明視野写真を使用する場合は、まずデフォルト設定でFFTバンドパスフィルタープラグインを使用します。[処理]、[FFT]、[バンドパス フィルター] の順にクリックし、グレー スケールに変換します。画像が暗すぎてミクログリアのプロセスを視覚化できない場合は、ツールバーを使用して、画像、調整、明るさ/コントラストをクリックします。必要に応じて、ヒストグラムの端まで最小または最大のスライダーを調整しますが、それ以上は調整しないでください。輝度の調整は、データ分析に最もばらつきが生じるため、最も重要なステップです。次に、アンシャープマスクフィルターを実行して、プロセス、フィルター、アンシャープマスクをクリックしてコントラストをさらに上げます。ノイズ除去手順を実行して、アンシャープマスクによって生成される塩とコショウのノイズを除去します。ツールバーを使用して、Process(処理)、Noise(ノイズ)、Despeckle(ノイズ除去)をクリックします。画像をバイナリに変換するには、[Image]、[Adjust]、[Threshold] を選択します。次に、ノイズ除去機能をバイナリ画像に適用して、残っている 1 ピクセルのノイズをすべて除去します。次に、[プロセス]、[バイナリ]、[閉じる]の順にクリックして閉じる機能を適用し、最大2ピクセルで区切られた暗いピクセルを接続します。次に、[Process]、[Noise]、[Remove Outliers] の順にクリックして、外れ値を削除します。画像を後で使用するために別のファイルとして保存した後、ツールバーを使用して[プロセス]、[バイナリ]、[スケルトン化]の順にクリックして、画像をスケルトン化します。スケルトン化された画像を選択し、[Plugins]、[Skeleton]、[Analyze Skeleton] の順にクリックし、ブランチ情報ボックスにチェックを入れて、AnalyzeSkeleton プラグインを実行します。結果と分岐情報の出力からデータをコピーし、Excel スプレッドシートに貼り付けます。Excel で、データをトリミングして、IHC と画像取得の結果として生じるスケルトン フラグメントを削除します。データセットからトリミングするフラグメントの長さを決定するには、ImageJ でスケルトン化された画像を開き、[線] ツールを選択します。平均長に注意していくつかのフラグメントを測定し、データセット全体で一貫しているカットオフ値を決定します。Excel スプレッドシートをカスタム並べ替えるには、[並べ替えとフィルタ]、[カスタム並べ替え] の順にクリックします。端点ボクセルで最大から最小にソートし、新しいレベルでは Mx ブランチ PT で最大から最小にソートします。最大分岐長がカットオフ値より短い 2 つの端点を含むすべての行を削除します。エンドポイント列のデータを合計して、イメージから収集されたエンドポイントの合計数を計算します。分岐情報データについても、分岐長でソートした後、この手順を繰り返します。すべてのデータがトリミングされ、合計されたら、各画像のデータを対応する画像内のミクログリア体の数で割ります。最終的なエンドポイントとセルおよびセルごとの分岐長データを統計ソフトウェアに入力します。FracLacプラグインがダウンロードされたことを確認します。次に、長方形ツールを使用してROIを描画します。ボックスがセル全体をキャプチャするのに十分な大きさであり、データセット全体で一貫性を維持できることを確認します。ROIマネージャーウィンドウで、[更新]を選択して、顕微鏡写真でランダムに選択したセルにROIをロックします。選択したセルを含むバイナリ イメージを開きます。ペイントブラシツールをダブルクリックし、色を黒に設定し、必要に応じてブラシの幅を調整します。一致する顕微鏡写真を参照として使用して、Paintbrushを使用して隣接する細胞プロセスを除去し、断片化されたプロセスを結合し、目的の細胞を分離します。バイナリセルが分離されたら、バイナリファイルを保存します。バイナリセルをアウトラインに変換するには、ツールバーを使用して、[プロセス]、[バイナリ]、[アウトライン]を使用します。ツールバーで、ツールバーを使用して FracLac を開き、[Plugins]、[Fractal Analysis]、[FracLac] の順にクリックし、ボックス カウントで [BC] を選択します。Grid Designで、Num Gを4に設定します。[グラフィックス オプション] で、メトリック ボックスをオンにして、セルの凸包と境界円を分析します。終了したら、[OK] を選択し、[スキャン] ボタンを選択して、選択したイメージに対してボックス カウント スキャンを実行します。「ハルと円の結果」ウィンドウで、必要なデータ結果をすべてコピーします。次に、[Box Count Summary] ウィンドウで同じ操作を行います。コピーしたデータをExcelファイルまたは統計ソフトに転送します。このグラフは、無傷および損傷した皮質組織における細胞ごとのミクログリアエンドポイントと細胞あたりの処理長の要約データを示しています。これは、プロトコルを適用した解析結果です。いずれの場合も、Students T Testを用いて統計解析を行い、3枚の画像を解析しました。プロトコルの適用におけるユーザー間のばらつきについて注意を払う必要があります。このような違いをここにまとめると、同じデータセットが、同じプロトコルを適用する2人の独立したユーザーによって分析されました。傾向は全体的に似ていますが、ユーザー間の変動性はデータの重要性に影響します。この手順を試行する際、目標は元の顕微鏡写真を代表するスケルトンまたはアウトラインモデルを取得することであることを覚えておくことが重要です。これは、ステップが治験責任医師の特定のニーズに合わせて変更できる可能性があることを意味します。このビデオを見れば、すぐに利用できるコンピュータソフトウェアを使用して、免疫組織化学組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態を迅速に定量する方法を十分に理解できるはずです。

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Etienne, F. et al. Two-photon Imaging of Microglial processes' Attraction towards ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp.

マウス脳スライス中の化合物に対するミクログリアプロセス引力を研究するための2光子顕微鏡

脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。...

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

小膠細胞は、それらの細胞外環境に材料を貪食又は巻き込むための高い能力を有する中枢神経系（CNS）の居住者の免疫細胞である。ここでは、シナプスのコンポーネントのミクログリア媒介貪食を可視化し、測定するために広く適用可能で信頼性が高く、高度に定量的なアッセイが記載されている。...

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

ミクログリアの活性化および小膠は、慢性神経変性に重要な応答です。ここでは、in vivoで 、共焦点検眼鏡による網膜CX3CR1-GFP +ミクログリア細胞の長期的な可視化のための方法を提示し、閾値と形態計測のために識別し、それらの活性化を定量化するために分析します。我々は、年齢関連の緑内障の早期の段階でミクログリアの変化を監視します。...

共焦点検眼鏡イメージングとマウス緑内障における細胞の形態計測：神経変性中に網膜ミクログリアの活性化のインビボダイナミクス

二つの画像解析アルゴリズム、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」および「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測を」自動的ショウジョウバエ神経筋接合部（NMJ）の9つの形態学的特徴を定量化するために、 作成されました 。...

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部形態

このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。...

患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

このプロトコルは、IBA1およびTMEM119の免疫蛍光コシャリンのための段階的なワークフローを記述し、ミクログリア密度、分布、および形態の分析に加えて、ならびにマウス脳組織における末梢骨髄細胞浸潤の分析を説明する。...

マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色

我々は、細胞数を識別するために一般化可能な領域ベースの画像解析アプローチを利用する方法を提示する。異なる細胞集団の分析は、適応アルゴリズム内の異なる細胞型間の有意な細胞高さおよび構造の違いを利用した。...

マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro...

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

マウスにおける上行性膣感染症、早産、および新生児罹患率のモデル化

マッピングミログリアパラメータソフトウェア(MMPS)は、コーディングの専門知識を必要とせず、免疫蛍光画像から単細胞微粒細胞形態学解析を半自動化するユーザーフレンドリーな解析パイプラインです。齧歯類リポ多糖誘発神経炎症モデルで検証され、MMPSは活性化に関連する形態変化を再現性可能に検出し、標準化され拡張可能なミクログリア表現型化を可能にします。...

マッピングミクグリアパラメータソフトウェア(MMPS):定量的なミクログリア形態分析のためのオープンソースで使いやすいツール

学ぶImageJを用いたミクログリア形態の定量化法。免疫組織化学処理した脳組織の顕微鏡写真から、スケルトン解析とフラクタル解析で細胞の複雑さを測定し、神経炎症におけるミクログリアの機能を解明する。

免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

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