免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

これらのスケルトンおよびフラクタル解析法の全体的な目標は、IHCで調製した組織からミクログリアの形態を測定することであり、本質的にハイスループットであり、細胞形状のわずかな違いを検出するための感度の高い定量的方法を使用して測定します。この方法は、健康と病気の間のミクログリアの形態と機能のニュアンスを定義することにより、神経炎症領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、カテゴリ変数ではなく連続変数を使用してミクログリアの形態を定量化できることです。

ここで説明する方法は、プロプライエタリなソフトウェアを必要とせず、脳領域のスクリーニングや細胞ごとの解析に使用することができます。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるキンバリー・ヤングです。開始する前に、AnalayzeSkeleton プラグインが ImageJ または Fiji にダウンロードされていることを確認してください。

次に、免疫染色された脳のIba1を示す30ミクロンのZスタックを開きます。蛍光顕微鏡写真を使用する場合は、画像が8ビットであることを確認し、グレースケールに変換して、すべての陽性染色を最適に視覚化します。ツールバーを使用して、[イメージ]、[ルックアップ テーブル]、[グレー] の順にクリックします。

DAB明視野写真を使用する場合は、まずデフォルト設定でFFTバンドパスフィルタープラグインを使用します。[処理]、[FFT]、[バンドパス フィルター] の順にクリックし、グレー スケールに変換します。画像が暗すぎてミクログリアのプロセスを視覚化できない場合は、ツールバーを使用して、画像、調整、明るさ/コントラストをクリックします。

必要に応じて、ヒストグラムの端まで最小または最大のスライダーを調整しますが、それ以上は調整しないでください。輝度の調整は、データ分析に最もばらつきが生じるため、最も重要なステップです。次に、アンシャープマスクフィルターを実行して、プロセス、フィルター、アンシャープマスクをクリックしてコントラストをさらに上げます。

ノイズ除去手順を実行して、アンシャープマスクによって生成される塩とコショウのノイズを除去します。ツールバーを使用して、Process(処理)、Noise(ノイズ)、Despeckle(ノイズ除去)をクリックします。画像をバイナリに変換するには、[Image]、[Adjust]、[Threshold] を選択します。

次に、ノイズ除去機能をバイナリ画像に適用して、残っている 1 ピクセルのノイズをすべて除去します。次に、[プロセス]、[バイナリ]、[閉じる]の順にクリックして閉じる機能を適用し、最大2ピクセルで区切られた暗いピクセルを接続します。次に、[Process]、[Noise]、[Remove Outliers] の順にクリックして、外れ値を削除します。

画像を後で使用するために別のファイルとして保存した後、ツールバーを使用して[プロセス]、[バイナリ]、[スケルトン化]の順にクリックして、画像をスケルトン化します。スケルトン化された画像を選択し、[Plugins]、[Skeleton]、[Analyze Skeleton] の順にクリックし、ブランチ情報ボックスにチェックを入れて、AnalyzeSkeleton プラグインを実行します。結果と分岐情報の出力からデータをコピーし、Excel スプレッドシートに貼り付けます。

Excel で、データをトリミングして、IHC と画像取得の結果として生じるスケルトン フラグメントを削除します。データセットからトリミングするフラグメントの長さを決定するには、ImageJ でスケルトン化された画像を開き、[線] ツールを選択します。平均長に注意していくつかのフラグメントを測定し、データセット全体で一貫しているカットオフ値を決定します。

Excel スプレッドシートをカスタム並べ替えるには、[並べ替えとフィルタ]、[カスタム並べ替え] の順にクリックします。端点ボクセルで最大から最小にソートし、新しいレベルでは Mx ブランチ PT で最大から最小にソートします。最大分岐長がカットオフ値より短い 2 つの端点を含むすべての行を削除します。

エンドポイント列のデータを合計して、イメージから収集されたエンドポイントの合計数を計算します。分岐情報データについても、分岐長でソートした後、この手順を繰り返します。すべてのデータがトリミングされ、合計されたら、各画像のデータを対応する画像内のミクログリア体の数で割ります。

最終的なエンドポイントとセルおよびセルごとの分岐長データを統計ソフトウェアに入力します。FracLacプラグインがダウンロードされたことを確認します。次に、長方形ツールを使用してROIを描画します。

ボックスがセル全体をキャプチャするのに十分な大きさであり、データセット全体で一貫性を維持できることを確認します。ROIマネージャーウィンドウで、[更新]を選択して、顕微鏡写真でランダムに選択したセルにROIをロックします。選択したセルを含むバイナリ イメージを開きます。

ペイントブラシツールをダブルクリックし、色を黒に設定し、必要に応じてブラシの幅を調整します。一致する顕微鏡写真を参照として使用して、Paintbrushを使用して隣接する細胞プロセスを除去し、断片化されたプロセスを結合し、目的の細胞を分離します。バイナリセルが分離されたら、バイナリファイルを保存します。

バイナリセルをアウトラインに変換するには、ツールバーを使用して、[プロセス]、[バイナリ]、[アウトライン]を使用します。ツールバーで、ツールバーを使用して FracLac を開き、[Plugins]、[Fractal Analysis]、[FracLac] の順にクリックし、ボックス カウントで [BC] を選択します。Grid Designで、Num Gを4に設定します。

[グラフィックス オプション] で、メトリック ボックスをオンにして、セルの凸包と境界円を分析します。終了したら、[OK] を選択し、[スキャン] ボタンを選択して、選択したイメージに対してボックス カウント スキャンを実行します。「ハルと円の結果」ウィンドウで、必要なデータ結果をすべてコピーします。

次に、[Box Count Summary] ウィンドウで同じ操作を行います。コピーしたデータをExcelファイルまたは統計ソフトに転送します。このグラフは、無傷および損傷した皮質組織における細胞ごとのミクログリアエンドポイントと細胞あたりの処理長の要約データを示しています。

これは、プロトコルを適用した解析結果です。いずれの場合も、Students T Testを用いて統計解析を行い、3枚の画像を解析しました。プロトコルの適用におけるユーザー間のばらつきについて注意を払う必要があります。

このような違いをここにまとめると、同じデータセットが、同じプロトコルを適用する2人の独立したユーザーによって分析されました。傾向は全体的に似ていますが、ユーザー間の変動性はデータの重要性に影響します。この手順を試行する際、目標は元の顕微鏡写真を代表するスケルトンまたはアウトラインモデルを取得することであることを覚えておくことが重要です。

これは、ステップが治験責任医師の特定のニーズに合わせて変更できる可能性があることを意味します。このビデオを見れば、すぐに利用できるコンピュータソフトウェアを使用して、免疫組織化学組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態を迅速に定量する方法を十分に理解できるはずです。