Name: を光学的に検出 E.大腸菌のバクテリア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぼう、ラベルフリー光学バイオセンサーを用いた大腸菌の迅速検出法。ナノ構造多孔質シリコンとモノクローナル抗体を組み合わせ、前処理なしで低濃度細菌を数分で検出する革新的アプローチです。

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この作品は、イスラエル科学財団（助成番号1118から1108と認可番号1146から1112年）と、みんなのクロール記念研究基金によってサポートされていました。 ESは感謝ラッセルBerrieのナノテクノロジー研究所の財政支援を認めるものです。

1。酸化された多孔性のSiO 2の調製<ol><li>定電流で30秒間水性HFおよび無水エタノールの3:1（v / v）の溶液中でエッチングSiウエハ（片面が&lt;100&gt;面に研磨し、高濃度にドープされたp型、0.0008Ω·cm）で385ミリアンペア/ cm 2の密度。 HFは腐食性の高い液体であり、それは、細心の注意を払って処理する必要がありますのでご注意ください。 </li><li>無水エタノールで得られた多孔質Siの（PSI）膜の表面を数回すすぎ、乾燥窒素ガス下でフィルムを乾燥させる。 </li><li> （オフにし、1時間、炉内に残して、800℃まで炉を加熱し、室温で炉内にサンプルを置き、周囲の空気中で1時間、800℃で管状炉中の新たエッチングのPSIサンプルを酸化炉のみ室温で炉からサンプルを削除します）。 </li></ol> 2。 PSIO 2足場の生体機能化<ol><li>酸化したPSi（PSIをインキュベートメル中で1時間（トリ-3）95％のO 2）のサンプル（MPTS）溶液（トルエン中108 mm）である。 </li><li>トルエン、メタノール、アセトンでシラン処理PSIO 2サンプルをすすぎ、乾燥窒素ガス下で乾燥させます。 </li><li> 100 mMのPEO-ヨードアセチルビオチン溶液を1ミリリットル中に30分間シラン変性PSIO 2サンプルをインキュベートする。 </li><li> 0.1Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で数回、ビオチン処理PSIO 2サンプルを洗浄します。 </li><li> 100μg/ mlのストレプトアビジン（SA）の溶液1ミリリットル中に30分間ビオチン修飾PSIO 2サンプルをインキュベートする。 </li><li> 0.1MのPBS溶液で数回、SA処理PSIO 2サンプルを洗浄します。 </li><li> 100μg/ mlのビオチン化Eの1ミリリットル中に30分間その結果、SA-修正PSIO 2サンプルをインキュベート大腸菌モノクローナル抗体（免疫グロブリンG、IgG）の溶液または100μg/ mlのビオチン化ウサギIgGで（モノクローナル抗体のモデルとして）。 </li></ol> 3。蛍光標識し、蛍光顕微鏡<ol><li> 15μg/ mlのフルオレセイン（FITC）でIgGを修飾された表面をインキュベート40分間抗ウサギIgGをタグ付け15μg/ mlのフルオレセイン（FITC）でコントロールとして抗マウスIgGタグ付き。 </li><li> 0.1MのPBS溶液で数回変更されたサンプルを洗浄します。 </li><li>蛍光顕微鏡下でサンプルを調べる。 </li></ol> 4。細菌培養物<ol><li> Eを養う大腸菌 K12（1Lの脱イオン水で培地組成：NaClを5gの酵母エキス5g、及びトリプトン10g）をルリアベルターニ（LB）培地5mlで10mlチューブ中の細菌。細菌は一晩37℃で振とう培養する</li><li>波長600nmでの光学密度（OD）を読み取ることにより、細菌濃度を監視します。 LB培地で一晩増殖させた後、細菌濃度を決定するために分光光度計を用いてOD 600を読む。細胞の数は悲惨ですOD 600の測定値（1 OD 600 = 10 8個/ ml）にCTLY比例。 </li></ol> 5。細菌検出<ol><li>カスタムメイドのプレキシグラスフローセル中のIgGで修飾されたPSIO 2できちんとPSIO 2（対照として）サンプルを置きます。サンプルの反射率は、全ての測定中に同じ場所で測定されることを確実にするために、フローセルを修正します。 </li><li> Eでサンプルをインキュベート大腸菌 K12懸濁液（10 4細胞/ ml）を、室温で30分間インキュベートした。その後、30分間のW / V食塩水0.85％でセルをフラッシュすることによって、細菌懸濁物を除去します。 </li><li>実験を通して反射率データの変化を監視する。全ての光学測定は、周囲の水性中で実施される必要がある。先に説明したように25,26スペクトルは、CCDスペクトロメーターを用いて収集し、高速フーリエ変換（FFT）を適用することによって分析されるべきである。 </li><li>上の細菌の存在を確認バイオセンサ表面は、すぐにバイオセンシング実験後の直立光顕微鏡下での試料の観察による。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

PSIO 2ナノ構造（ファブリペロー薄膜）に基づくラベルフリー光学免疫センサーは、製造されており、細菌検出用バイオセンサーとしての適用可能性が確認された。 修正とトラブルシューティング免疫センサの設計の主要な関心事の一つは、バイオセンサの感度31,32の低下につながる可能性固体基板上に堆積及びパターニング中の望ましくないコンフォメーション変化を受けるための抗体の感受性である。この問題を最小限に抑えるために、PSIO 2表面への抗体の結合は、ビオチン-SAブリッジを介して達成される。 SAとビオチンは、一般に、それらの高い結合親和性（K dが約10 -13 M）に多くの生物工学用途で使用されている。ビオチン-SAリンクは、バイオセンサーの開発10,32,33,34で実践受容体固定化のための最も一般的な化学的性質の一つである。固定化抗体の接近は、固体表面とのIgG 31,35間の柔軟...

病原菌の早期かつ正確な識別は、食品や水の安全性、環境モニタリング、およびポイントオブケア診断の1のために極めて重要である。伝統的な微生物学技術は時間がかかり、面倒であり、「リアルタイム」で微生物を検出する能力を欠いているか、実験室環境の外ように、バイオセンサーは、これらの課題2-5を満たすように進化している。 近年では、多孔質Si（PSI）は、センサーやバイオセンサー6月20日の設計のための有望なプラットフォームとして浮上している。過去十年間PSI-ベースの光学センサーやバイオセンサーに関する多くの研究は、21,22を発表した。ナノ構造のPSi層は、典型的には単結晶Siウェハからの電気化学陽極エッチングにより作製される。ナノ材料は、このような大規模な表面と、自由体積など多くの有利な特性を示し、その結果、PSI制御され、調整可能な最適可能な孔の大きさCALの特性10,16。このような光ルミネ8,11と白の光の反射率に基づく干渉7,19などのPSI層の光学特性は、強く、環境条件の影響を受けている。フォトルミネッセンススペクトルの変調として又は反射率スペクトル10の波長シフトとして観察されたフィルムの平均屈折率の変化、多孔質層における結果内でゲスト分子/標的分析物の捕捉。 PSiは、光バイオセンサー技術の広大な革新が、細菌検出6,8,20,23-29ためのPSI-ベースのプラットフォームでのみ報告は少ない。さらに、これらの概念実証研究のほとんどは、「間接的」細菌検出を実証した。したがって、細胞の溶解は、一般的に従来検討細菌に特徴的な29、標的タンパク質/ DNA断片を抽出するために必要とされる。我々のアプローチを直接標的細菌を捕捉することであるのPSIバイオセンサーへの細胞。したがって、細菌を標的とする特異的であるモノクローナル抗体は、多孔質表面上に固定化される。抗体-抗原相互作用を介して、細菌細胞の結合は、バイオセンサーの表面に反射率スペクトル24-26の振幅（強度）の変化を誘導する。 本研究では、光PSI-ベースのバイオセンサーの構築に報告し、 大腸菌の検出（モデル微生物として使用される）（ 大腸菌 ）K12菌用のラベルフリーバイオセンシングプラットフォームとしての用途を示しています。監視対象光信号は、光によるファブリペロー薄膜干渉（ 図1A）へのPSiナノ構造からの反射である。光振幅/強度の変化は、細菌の迅速な検出および定量を可能にする、バイオセンサー表面上に標的細菌細胞の特異的な固定化に相関している。

<table><tbody><tr><td>Siウェーハ</td><td>シルトロニクス(株)</td><td></td><td>高Bドープ、p型、0.0008&Omega;-cm抵抗率、<</td></tr><tr><td>50 mM Na2HPO4、17 mM NaH2PO4、および 68 mM NaCl を Milli-Q 水 (18.2 M&Omega;) に溶解して調製した</td> 100> 配向水性 HF (48%)Merck 101513 Ethanol absolute Merck 818760<td>PBS 緩衝液 (pH 7.4)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.85 g NaCl を 100 mL Milli-Q 水 (18.2 M&Omega;) に溶解して調製</td>した<td>生理食塩水 0.85% w/v</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% (3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン (MPTS)</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>PEO-iodoacetyl biotin</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>B2059</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-000-114</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン(DTAF)-ストレプトアビジン</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-010-084</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ウサギIgG Jackson</td><td>ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>011-060-003</td><td></td></tr><tr><td>蛍光タグ付き抗ウサギIgG Jackson</td><td>ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>111-095-003</td><td></td></tr><tr><td>蛍光タグ付き抗マウスIgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>115-095-003</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化大腸菌抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (K-12)</td><td></td><td></td><td>は、テクニオンのシマ・ヤロン教授から寛大に提供されました</td></tr></tbody></table>

を光学的に検出 e.大腸菌のバクテリア

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

<html>ナノ多孔質Siに基づくラベルフリー光学バイオセンサーは、モデル微生物として、 大腸菌 K12細菌の迅速な捕捉および検出のために設計されています。研究された試料の前処理なし（細胞溶解などにより ） が必要とされないながら、バイオセンサーは、その表面に標的細菌細胞の直接結合に依存しています。メソポーラスSi薄膜は、バイオセンサの光変換素子として使用される。白色光照明の下では、多孔質層は、その反射率スペクトルでよく解像ファブリ·ペロー干渉縞を表示する。高速フーリエ変換は、単一のピーク反射率データの結果に変換（FFT）を適用する。 FFTピークの強度の変化が監視される。したがって、標的細菌がバイオセンサー表面上に捕獲抗体 - 抗原相互作用を介して、細菌付着の「リアルタイム」の観察を可能にする、FFTのピークの強度における測定可能な変化を誘導する。 ntの &quot;&gt;電気化学的陽極酸化法により製造されたメソポーラスSi膜は、標的細菌に特異的なモノクローナル抗体とコンジュゲートされている。抗体の固定化、免疫活性および特異性を、蛍光標​​識実験により確認されている。バイオセンサーが曝露されると標的細菌は、細胞を直接抗体修飾多孔Si表面上に捕捉され、これらの特異的捕捉のイベントは、バイオセンサーの薄膜光干渉スペクトルの強度変化をもたらす。我々は、これらのバイオセンサ（検出比較的低い細菌濃度を検出することができることを実証時間未満で10 4細胞/ ml）の上限。

プロトコルのテキストセクションに記載したように酸化されたPSi（PSIO 2）膜が調製される。 図1Bは、熱酸化後に得られたPSi膜の高分解能走査電子顕微鏡写真を示す。 PSIO 2層は30〜500nmの範囲の直径を有する明確に定義された円筒状の細孔によって特徴付けられる。 モノクローナル抗体（IgG）の分子は、ビオチン-SAシステムと結合された十分に確立されたシラン化技術を用いてPSIO 2の表面上にグ ​​ラフトされている。詳細な合成スキームを図2に概説されている。まず、熱酸化表面がチオールシラン化表面（ 図2c）、その結果、MPTSによりシラン化されている。次のステップでは、活性化された表面は、ビオチン-SA架橋を介してビオチン修飾表面へのSAタンパク質の結合に続いて、SH-反応性ビオチンリンカー分子（ 図2d）とインキュベートする図2E）。バイオセンサー表面の機能化...

迅速な細菌検出用ラベルフリー光学バイオセンサーを導入する。バイオセンサーは、直接的にその表面上に標的細菌の細胞を捕捉するように設計されているナノ多孔質Siに基づいている。私たちは、捕捉プローブとして、多孔質のトランスデューサに固定化モノクローナル抗体を使用しています。我々の研究は、（例えば、細胞溶解など）なし優先検体処理に数分以内に、低濃度の細菌の検出のためのこれらのバイオセンサーの適用可能性を実証する。

を光学的に検出 E.大腸菌のバクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

次の実験の全体的な目標は、ナノ構造の多孔質シリコンに基づく迅速な細菌検出のためのラベルフリー光学バイオセンサーを設計することです。これは、バイオセンサーの光トランスデューサ素子として使用される酸化多孔質シリコンを構築することによって達成されます。第2のステップとして、抗体などの特異的な捕捉プローブを多孔質表面に固定化して、バイオセンサーの活性成分を提供します。次に、バイオセンサーを標的の細菌に曝露し、細菌細胞を抗体に直接捕捉します。バイオセンサーの薄膜光学干渉スペクトルの強度変化を示す修飾酸化多孔質シリコン表面の結果が得られます。バクテリアが捕捉されるため、バイオセンサー表面上のバクテリアの存在を確認するために、光顕微鏡が使用されます。従来の培養法や技術に比べて、従来の培養法や技術よりも大きな利点は、1時間未満で細菌の存在を非常に迅速に検出できることです。この方法は、特定の微生物の環境モニタリング、および水と食品の安全性の確保における主要な課題に答えるのに役立ちます。また、特定の細菌種をリアルタイムで、ポイントオブケアの設定で検出することができます シリコンウェーハをフッ化水素とエタノールの水溶液に3対1で30秒間エッチングし、385ミリアンペア/平方センチメートルの定電流密度で開始します。フッ化水素は腐食性の高い液体であり、細心の注意を払って取り扱う必要があることに注意してください。得られた貧弱なシリコンフィルムの表面をエタノールで数回すすぎます。次に、乾燥窒素ガスでフィルムを乾燥させ、次にエッチングしたばかりの多孔質シリコンサンプルを、摂氏800度の管状炉で周囲空気中で1時間酸化します。酸化多孔質シリコンサンプルを生体官能基化するには、まずフィルムを1時間インキュベートし、95%MPTS溶液をインキュベートします。トルエン、メタノール、アセトンですすいだ後、正弦処理した酸化多孔質シリコンサンプルを乾燥窒素ガス下で乾燥させます。次に、正弦波修飾サンプルを1ミリリットルの100ミリモルPEOIオトアセチルビオチン溶液で30分間インキュベートします。得られたビオチン処理サンプルを0.1モルリン酸緩衝生理食塩水またはPBS溶液で数回すすぎます。次に、サンプルを1ミリリットルあたり100マイクログラムの連鎖球菌証拠溶液で30分間インキュベートしてから、PBS溶液で再度数回すすぎます。次に、ストレプトアビジン修飾酸化多孔質シリコンサンプルを、1ミリリットルあたり100マイクログラム、ビオチン化大腸菌、モノクローナルIgG抗体、または1ミリリットルあたり100マイクログラムの1ミリリットルで30分間インキュベートします。ビオチン化ウサギIgGを蛍光標識した足場。IgG修飾表面を1ミリリットルあたり15マイクログラムでインキュベートします。フルオレセインは抗ウサギIgGを40分間タグ付けしました。ミリリットルあたり15マイクログラムでインキュベートします。フルオレセインは、コントロールとして抗US IgGをタグ付けしました。改質したサンプルをPBS溶液で数回すすいだ後、蛍光顕微鏡でサンプルを検査します。12ミリリットルのチューブで大腸菌K12バクテリアを培養し、5ミリリットルのルリアブリタニまたはLB培地を使用します。一晩成長した後、37°Cで振とうしながら細菌を一晩インキュベートします。LB培地では、分光光度計を使用して600ナノメートルまたはOD600の波長で光学密度を読み取り、細菌濃度を決定します。セルの数は、OD 600の測定値に正比例します。場所。IgG修飾酸化多孔質シリコン足場とその制御。カスタムメイドのプレキシガラスフローセル内のすっきりとした酸化多孔質シリコンサンプル。フローセルを固定して、すべての測定でサンプルの反射率が同じ場所で測定されるようにします。サンプルをColi K 12懸濁液と室温で30分間インキュベートします。次に、細胞を生理食塩水(1体積あたり0.85%重量)で30分間洗い流して、細菌懸濁液を除去します。実験中の反射率データの変化をCCD分光器で監視します。高速4耳変換を適用して分析されたCCD分光計でスペクトルを収集した後、水性周囲ですべての光学測定を実行します。最後に、バイオセンシング実験の直後に直立光顕微鏡で試料を観察し、バイオセンサー表面上の細菌の存在を確認します。ここに示されているのは、熱酸化後の多孔質シリコン膜の高分解能走査型電子顕微鏡写真です。酸化多孔質シリコン層は、直径が30〜80ナノメートルの範囲の明確に定義された円筒形の細孔によって特徴付けられます。酸化した多孔質シリコン表面への抗体の付着は、蛍光標識によって確認され、続いて蛍光顕微鏡で表面を観察します。さらに、蛍光研究では、蛍光標識付き抗ウサギIgGおよび抗マウスIgGをコントロールとして結合することにより、表面固定化抗体の活性および抗原特異性の特性評価が可能になります。また、酸化多孔質シリコンナノ構造から反射された光の振幅または強度の細菌バイオセンシングの変化を実証するためのIgGなしの制御実験が示され、大腸菌細菌の導入前後のバイオセンサーの変換スペクトルがここに示されています。7 ± 1% の強度低下が記録されますが、未修飾の酸化多孔質シリコン表面にはわずかな変化が観察されます。また、酸化した多孔質シリコン表面に捕捉された細胞の存在を確認するために、表示されたバイオセンシング実験の終了直後にバイオセンサーを光学顕微鏡で観察します。これがバイオセンサー表面に固定化された細菌細胞です。未改変のコントロールサーフェス上には細胞は観察されませんが、一度習得すると、この手法を適切に実行すれば1時間未満で実行できます。このビデオを見れば、ターゲット分析物をモニタリングするための特定の光学バイオセンサーの計画方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

バイオセンサーは、複雑な生物学的環境とのインタフェースと表面改質を介してセンサに接続されている高度に特異的なプローブと高感度センサーを組み合わせることにより、ターゲットの検出を実行します。ここでは、センサと生物学的環境を埋めるためにシランカップリング剤を使用して、ビオチンを有するシリカ光センサーの表面官能基を示しています。...

シランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへの生物学的プローブの取り付け

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。...

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

出典: Barber、AE、 et al。 銃弾残留物の推定検出のための新しい細菌バイオセンサの調製と応用J. Vis.

細菌バイオセンサーを用いた標的分析物の検出

このビデオでは、ナノセンサーを使用して食品や水のサンプルに含まれる細菌汚染物質を検出する技術を示しています。標的となる病原菌は、磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせによって検出されます。...

蛍光磁気ナノセンサーによる細菌汚染の検出

溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性（MRSA）と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。...

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

この作業では、異常な光透過の原理で動作する高品質センシング アレイを作製するナノイン プリント リソグラフィ法について説明します。バイオ センサーが低コスト、堅牢で、使いやすいと心筋トロポニンを検出することができます私は臨床的に関連性の高い濃度 (99thパーセン タイル カットオフ ∼10 400 pg/mL、アッセイによって)...

ひと血清における心筋バイオ マーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

静電容量センサーとの組み合わせでの刷り込みが分子を使用して複雑なソリューションで検出および低分子の定量化のプロトコルを紹介します。...

分子インプリントを用いたバイオ マーカーの超高感度検出による静電容量センサー

このプロトコルでは、マイクロ流体チップに基づいて連続フローポリメラーゼ鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。ラボでの核酸分析のための簡単な方法を紹介します。...

連続フローPCRマイクロ流体チップにおける大 腸菌 の増幅とキャピラリー電気泳動システムによる検出

学ぼう、ラベルフリー光学バイオセンサーを用いた大腸菌の迅速検出法。ナノ構造多孔質シリコンとモノクローナル抗体を組み合わせ、前処理なしで低濃度細菌を数分で検出する革新的アプローチです。

を光学的に検出 E.大腸菌のバクテリア

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