を光学的に検出 E.大腸菌のバクテリア

次の実験の全体的な目標は、ナノ構造の多孔質シリコンに基づく迅速な細菌検出のためのラベルフリー光学バイオセンサーを設計することです。これは、バイオセンサーの光トランスデューサ素子として使用される酸化多孔質シリコンを構築することによって達成されます。第2のステップとして、抗体などの特異的な捕捉プローブを多孔質表面に固定化して、バイオセンサーの活性成分を提供します。

次に、バイオセンサーを標的の細菌に曝露し、細菌細胞を抗体に直接捕捉します。バイオセンサーの薄膜光学干渉スペクトルの強度変化を示す修飾酸化多孔質シリコン表面の結果が得られます。バクテリアが捕捉されるため、バイオセンサー表面上のバクテリアの存在を確認するために、光顕微鏡が使用されます。

従来の培養法や技術に比べて、従来の培養法や技術よりも大きな利点は、1時間未満で細菌の存在を非常に迅速に検出できることです。この方法は、特定の微生物の環境モニタリング、および水と食品の安全性の確保における主要な課題に答えるのに役立ちます。また、特定の細菌種をリアルタイムで、ポイントオブケアの設定で検出することができます シリコンウェーハをフッ化水素とエタノールの水溶液に3対1で30秒間エッチングし、385ミリアンペア/平方センチメートルの定電流密度で開始します。

フッ化水素は腐食性の高い液体であり、細心の注意を払って取り扱う必要があることに注意してください。得られた貧弱なシリコンフィルムの表面をエタノールで数回すすぎます。次に、乾燥窒素ガスでフィルムを乾燥させ、次にエッチングしたばかりの多孔質シリコンサンプルを、摂氏800度の管状炉で周囲空気中で1時間酸化します。

酸化多孔質シリコンサンプルを生体官能基化するには、まずフィルムを1時間インキュベートし、95%MPTS溶液をインキュベートします。トルエン、メタノール、アセトンですすいだ後、正弦処理した酸化多孔質シリコンサンプルを乾燥窒素ガス下で乾燥させます。次に、正弦波修飾サンプルを1ミリリットルの100ミリモルPEOIオトアセチルビオチン溶液で30分間インキュベートします。

得られたビオチン処理サンプルを0.1モルリン酸緩衝生理食塩水またはPBS溶液で数回すすぎます。次に、サンプルを1ミリリットルあたり100マイクログラムの連鎖球菌証拠溶液で30分間インキュベートしてから、PBS溶液で再度数回すすぎます。次に、ストレプトアビジン修飾酸化多孔質シリコンサンプルを、1ミリリットルあたり100マイクログラム、ビオチン化大腸菌、モノクローナルIgG抗体、または1ミリリットルあたり100マイクログラムの1ミリリットルで30分間インキュベートします。

ビオチン化ウサギIgGを蛍光標識した足場。IgG修飾表面を1ミリリットルあたり15マイクログラムでインキュベートします。フルオレセインは抗ウサギIgGを40分間タグ付けしました。

リットルあたり15マイクログラムでインキュベートします。フルオレセインは、コントロールとして抗US IgGをタグ付けしました。改質したサンプルをPBS溶液で数回すすいだ後、蛍光顕微鏡でサンプルを検査します。

12ミリリットルのチューブで大腸菌K12バクテリアを培養し、5ミリリットルのルリアブリタニまたはLB培地を使用します。一晩成長した後、37°Cで振とうしながら細菌を一晩インキュベートします。LB培地では、分光光度計を使用して600ナノメートルまたはOD600の波長で光学密度を読み取り、細菌濃度を決定します。

セルの数は、OD 600の測定値に正比例します。場所。IgG修飾酸化多孔質シリコン足場とその制御。カスタムメイドのプレキシガラスフローセル内のすっきりとした酸化多孔質シリコンサンプル。

フローセルを固定して、すべての測定でサンプルの反射率が同じ場所で測定されるようにします。サンプルをColi K 12懸濁液と室温で30分間インキュベートします。次に、細胞を生理食塩水(1体積あたり0.85%重量)で30分間洗い流して、細菌懸濁液を除去します。

実験中の反射率データの変化をCCD分光器で監視します。高速4耳変換を適用して分析されたCCD分光計でスペクトルを収集した後、水性周囲ですべての光学測定を実行します。最後に、バイオセンシング実験の直後に直立光顕微鏡で試料を観察し、バイオセンサー表面上の細菌の存在を確認します。

ここに示されているのは、熱酸化後の多孔質シリコン膜の高分解能走査型電子顕微鏡写真です。酸化多孔質シリコン層は、直径が30〜80ナノメートルの範囲の明確に定義された円筒形の細孔によって特徴付けられます。酸化した多孔質シリコン表面への抗体の付着は、蛍光標識によって確認され、続いて蛍光顕微鏡で表面を観察します。

さらに、蛍光研究では、蛍光標識付き抗ウサギIgGおよび抗マウスIgGをコントロールとして結合することにより、表面固定化抗体の活性および抗原特異性の特性評価が可能になります。また、酸化多孔質シリコンナノ構造から反射された光の振幅または強度の細菌バイオセンシングの変化を実証するためのIgGなしの制御実験が示され、大腸菌細菌の導入前後のバイオセンサーの変換スペクトルがここに示されています。7 ± 1% の強度低下が記録されますが、未修飾の酸化多孔質シリコン表面にはわずかな変化が観察されます。

また、酸化した多孔質シリコン表面に捕捉された細胞の存在を確認するために、表示されたバイオセンシング実験の終了直後にバイオセンサーを光学顕微鏡で観察します。これがバイオセンサー表面に固定化された細菌細胞です。未改変のコントロールサーフェス上には細胞は観察されませんが、一度習得すると、この手法を適切に実行すれば1時間未満で実行できます。

このビデオを見れば、ターゲット分析物をモニタリングするための特定の光学バイオセンサーの計画方法について十分に理解できるはずです。