蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

次の実験の全体的な目標は、新規のインフルエンザ原性、DNA、Zyme probes First、完全な遺伝子DNAを使用して、大腸菌などの特定の細菌の存在を迅速に検出することです。ザイムプローブはライゲーションによって生成されます。次に、細菌を培養して標的分子の数を増やし、上清から蓄積された細胞外混合物を調製します。

次いで、粗細胞外混合物をDNAザイムプローブとDNAザイムプローブと標的分子との間の相互作用と結合すると、プローブの切断が生じ、その後、蛍光が使用されています。プローブとターゲット間の蛍光計の相互作用は、相対的な蛍光の増加として見られます。その後、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を使用して結果を検証します。

PCRまたは抗体ベースの方法と比較した場合のこの手法の主な利点は、手順がより簡単で簡単に実行できることです。この方法はモデル細菌大腸菌で開発されましたが、他の食品媒介性または院内細菌性病原体の検出に適用することができます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、合成DNAプローブや細菌の取り扱いに慣れていない可能性があるため、苦労します 手順を実証するのは、私の研究室の研究助手であるセルジオ・アギレとポスドク研究員のモンソ・アリです このプロトコルの場合。

R-F-D-E-Cの1つは、注目のDNAザイムです。これは、黒で下線が引かれた触媒配列ECと緑色で下線が引かれた基質配列FSで構成され、基質内に含まれるRNA結合は、青rで示され、Fで示されるFluor標識付きDTとキューRFで示されるQUNCHERラベル付きDTで示されます。SSはRFD EECのスクランブルバージョンであり、触媒配列EEC1が部分的にSSにシャッフルされています。 しかし、FSの1つの部分は変わりません。RF DEC oneおよびRF SS oneは、オリゴヌクレオチドFS oneとオリゴヌクレオチドEC oneまたはSS oneの存在下でのテンプレート媒介酵素ライゲーションによって作られ、ライゲーションテンプレートとしてLTワンの存在下で、R-F-D-E-C oneのターゲットとして使用される粗細胞外混合物またはcemを調製することから始めます。

次に、滅菌ピペットチップを使用して、オーガープレートから大腸菌の単一のコロニーを選び、lbを含む培養チューブにドロップします。チューブを摂氏37度に設定されたインキュベーターに入れ、インキュベーション後14時間250RPMで振とうします。1%reの接種培養物を生成するには、2ミリリットルの新鮮なLBを14ミリリットルの培養チューブに分注し、前のステップから20マイクロリットルの細菌培養物を追加します。

チューブを摂氏37度でインキュベートし、250 RPMで振とうしながら、各細菌溶液が約1回の移動のOD 600に達するまでインキュベートします。新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に各培養物の1ミリリットルを、11, 000 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。スピン後、透明な上清を新鮮な1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

上清はマイナス20°Cで保管します。DNA酵素と粗細胞抽出物との相互作用により蛍光シグナルが生成されるかどうかを判断するためにすぐに使用しない場合は、サンプルをスペクトル測光法でアッセイします。蛍光分光光度計の電源を入れ、488ナノメートルの励起と520ナノメートルの発光でデータ取得パラメータを設定します。

また、1分間毎分読み取りを行うように機器を設定します。3つの水晶キュベットを最初に蒸留脱イオン水で洗い、次に100%エタノールで洗います。窒素ガスを点滅させてキュベットを乾燥させます。

コントロール1のためのC 1、コントロール2のためのC 2、およびテストのためのTとしてキュベットにラベルを付け、次に蒸留脱イオン水の24マイクロリットルをC 1に、準備された大腸菌粗細胞外混合物の24マイクロリットルをC 2およびT.Addに25マイクロリットルの25マイクロリットルを各Q獣医に2つのX RBに移し、それらを蛍光分光光度計に置きます。5分後に蛍光データの収集を開始し、5マイクロモルRFS S 1をC 2に1マイクロリットル、5マイクロモルの1マイクロリットル、RFD eec 1をTとC 1に追加して、蛍光の読み取りが中断されないようにします。ピペッティングで各溶液を混合し、その後、取得期間の残りの間反応を継続させます。

データをExcelファイル形式で保存します。次に、データをパソコンに転送し、Excelを使用してグラフィカルイメージを作成します。Spectraによる分析に使用されたのと同じ反応混合物。

測光法は、ゲル電気泳動による分析に使用できます。取得から1時間後。分光光度計からキュベットを取り外し、溶液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

5マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと125マイクロリットルの100%エタノールを加えて反応を急冷します。各溶液をボルテックスして混合し、インキュベーション遠心分離機の後1時間、チューブをマイナス20°Cの冷凍庫に置きます。反応混合物を11, 000Gで摂氏4度で20分間混合し、ピペッティングで上清を慎重に除去します。

DNA濃縮器を使用してペレットを10分間乾燥させます。20マイクロリットルのゲルローディングバッファーを加え、短時間ボルテックスします。卓上型遠心分離機で短時間スピンダウンします。

次に、ラン後、10%Dageゲルのウェルあたり10マイクロリットルの反応サンプルをロードします。ガラス皿を取り外し、水道水でよく洗います。ゲル片を取り除くには、キムワイプでプレートを拭きます。

タイフーンスキャナーを使用してゲルプレートの蛍光をスキャンします。得られた画像を画像定量ソフトウェアを使用して解析し、システムの感度を評価します。段階希釈した培養物は、より多くの期間にわたって成長します。

単一の細菌を検出するために必要な最小インキュベーション期間を決定するには、2ミリリットルのlbを含む10本の培養チューブを準備し、各培養物に大腸菌のグリセロールストック1ミリリットルあたり100マイクロリットルの2CFUを接種し、摂氏37度でインキュベートし、4時間、8時間、12時間、16時間、および24時間で250RPMで振とうします。接種した各培養チューブから300マイクロリットルを採取します。これは、採取したサンプルに検出可能な細菌が存在しない可能性があるためです。ポイント 4 8 12.

残りの培養物を24時間増殖させて、細菌を含む培養物を特定します。OD 600を測定し、11, 000 Gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させます。CEMSを含む上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、翌日使用するまで摂氏マイナス20度で保管します。.

培養物の成長を検査します。10種類の培養物のうち、接種後に大腸菌を含むことができるのは1つまたは2つだけで、残りのチューブには細胞は含まれていません。指定された時点で陽性培養物から回収したCEMSを使用して、RFD EEC oneとの切断反応を調製し、前述のようにDAGEゲル電気泳動を使用して反応混合物を分析し、RFD EEC oneおよびRF SS oneプローブの両方を、DNAザイム部分を基質に酵素的にライゲーションすることにより調製した。

次に、CEM EECとRFD EEC OneまたはRF SS OneのFS One相互作用を分光法で評価しました。ここで見ることができるように。R-F-D-E-C oneは、CEM ecを添加すると高レベルの蛍光シグナルを生成しました。

対照的に、R FS Sの1つは強い蛍光シグナルを生成されませんでした。したがって、RFD EEC 1の蛍光生成機能。CEM ECに連絡すると、シーケンシングされます。

観察された蛍光の増加がRNA結合の切断によるものであることを確認するための特異的なもの。反応混合物をRFD eecのdage開裂により分析したところ、1個ずつ0.25モルの水酸化ナトリウムで2D NAフラグメント、Fluorを保持する5プライムフラグメント、およびクエンチャーを保持する3プライムフラグメントを生成することが期待されます。ここで見ることができるように。

RFD EEC CEM EEC反応混合物は、実際に期待通りの劈開生成物を生成しました。さらに、蛍光イメージングによって検出できたのは、UNC切断されたR-F-D-E-C oneとfive-primeフラグメントのみでした。RFD EECの特異性を調べるために、他のいくつかのグラム陰性菌およびグラム陽性菌からのみ採取したCEMSを使用して、1つの蛍光アッセイを実施しました。

CEM ECを含むサンプルでは、蛍光が増加しました。他の細菌由来のCEMSとの交差反応性の欠如は、R-F-D-E-C oneが、増殖培地で4、8、12、16、および24時間培養した100マイクロリットルで1ミリリットルあたり1CFUに希釈された単一の大腸菌細胞e大腸菌を検出するために必要な最小培養時間を決定するために、大腸菌にとって非常に選択的であることを示しています。得られたCEMSをR-F-D-E-C oneと混合し、切断したCEMSを、ここに示すようにdageで評価しました。

Dageアッセイの画像は、R-F-D-E-Cが期待された切断産物を生成できなかったことを示しています。CEMと反応したとき。ECSは、成長の4時間および8時間で収集され、習得すると12時間の培養時間が必要であることを示しています。

この技術の重要な構成要素は、DA酵素ベースのアッセイは、この開発後に適切に実行されれば60分で行うことができます。この手順により、バイオ分析の分野の研究者が、さまざまな細菌性病原体を検出するための同種DNA酵素を探索する道が開かれました。