Name: 蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 学ぶ蛍光性DNAzymeプローブを用いた大腸菌の迅速検出法。RFD-EC1プローブと細菌培養上清を混合し、蛍光強度を測定することで、PCRや抗体法より簡便な細菌検出を実現します。

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この仕事のための資金は、自然科学とカナダの工学研究会（NSERC）とSentinel生理活性紙ネットワークによって提供されました。

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<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+and+rational+engineering+of+trans-acting+pH6DZ1%2C+an+RNA-cleaving+and+fluorescence-signaling+deoxyribozyme+with+a+four-way+junction+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+BioChem%22%5BJournal%5D)">Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure.</a> Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).</li>
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<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224(2007).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).</li>
<li>Kandadai, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5.</a> Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).</li>
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<li>Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li>
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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

今日一般的な細菌の検出方法のほとんどは、低速（古典的な微生物）または技術的に（抗体、PCR）を求めています。そこで、検出ツールの次の世代は、スピードとシンプルさに向かって応えるべきだと思います。この目的のために、我々は、RNA切断し、蛍光シグナルの生成を介して細菌の存在を報告するためにシンプルなアッセイを開発するために使用することができ、蛍光シグナルDNAザイムを作成しました。注目のDNAザイムプローブ、RFD-EC1は、E.の成長時に生成CEMによって活性化される培養培地中の大腸菌 。提案手法は、検出の対象として細菌の粗細胞混合物を使用して、面倒なターゲットの抽出と増幅のステップをバイパスしているので、それは細菌検出のためのアッセイの非常に単純な、 &quot;ミックス·アンド·読む&quot;のタイプを設定するために使用することができます。私たちのDNAザイムの使用は、蛍光ベースの検出方法に限定されません。同じDNAザイムシステムアッセイcを使用して、例えば、比色検出有機色素と一緒にローリングサークル増幅を利用し、以前に報告された方法を用いて設計することができます。32我々は、より大きな運用の簡素化と新たな細菌のバイオセンサーを生成するための魅力的な道のような細菌を検出するためのDNAzymesの使用を予見する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号またはモデル </td></tr><tr><td>寒天</td><td> BioShopカナダ</td><td> AGR003 </td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム（APS） </td><td> BioShopカナダ</td><td> AMP001 </td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビスアクリルアミド（40％、29:1） </td><td> BioShopカナダ</td><td> ACR004 </td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td> BioShopカナダ</td><td> BOR001 </td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> EMサイエンス</td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td>塩酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 38281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshopカナダ</td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> LBブロス</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl 2を </td><td> EMD化学品</td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> BioShopカナダ</td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> EMDケミカルズ</td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOHで</td><td> EMDケミカルズ</td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> BioShopカナダ</td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShopカナダ</td><td> TEM001 </td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td> BioShopカナダ</td><td> BST666 </td></tr><tr><td> Tween 20を</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P9416 </td></tr><tr><td>尿素</td><td> BioShopカナダ</td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> X4126 </td></tr><tr><td> DNAコンセントレータ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SavantのDNA Speed​​Vac 120 </td></tr><tr><td>マイレクスフィルタユニット</td><td>ミリポア</td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td>ゲルローディングのヒント</tD&gt; <td> Diamed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> ImageQuantソフトウェア</td><td>分子動力学</td><td>バージョン5.0 </td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>キンバリークラークプロフェッショナル</td><td> 34705 </td></tr><tr><td>ミニボルテックス</td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td> Pechineyプラスチック包装</td><td> PM996 </td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> Fisherbrand 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettorプラス（ピペットガン） </td><td>コー​​ニング</td><td> 07764714 </td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td>バリアン社</td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td>シェーカー/インキュベーター</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>クラシックシリーズC24 </td></tr><tr><td>台風スキャナ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 9200可変モード</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>ベックマン·コールター</td><td>アレグラX22-R </td></tr><tr><td> UV分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td>蛍光分光光度計</td><td>バリアン社</td><td>ケアリーのEclipse </td></tr></tbody></table>

蛍光性dnazymesを使用した細菌の検出

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

発生はそれぞれ毎年死亡と入院の何百万人と同様に巨大な経済的損失のために食品を媒介と院内感染病原体のアカウントにリンクされています。進行中の流行の場所の影響を正確に早い段階で犯人の病原体を識別することができる分析法のためにますます需要のような流行と最小化の防止。高い特異性（興味のある唯一の細菌を検出）、高感度（低として検出することができる：病原体を検出するための効果的な方法の大きな配列があるが、それらのどれも理想的な検出方法のために具現すべて次の5つの最初の要件を満たすことはできません単一のライブ細菌細胞など）を、短時間-結果に（数分から数時間）、偉大な運用の簡素化（長いサンプリング手順や特殊な装置の使用の必要はありません）、および費用対効果。例えば、古典的な微生物学的方法は非常に特異的であるが、長い時間（DAを必要とする週間YS）が1 PCRおよび抗体ベースの技術は短い待機時間（数時間から数日）を提供しています。決定的な結果を取得するために、彼らは高価な試薬および/ ​​または洗練された装置の使用。結果2-4を必要とする、まだある前述の要件の1つまたは複数の特性の改善を提供する革新的な細菌の検出方法を開発に向けた科学研究のための大きな需要。当研究室では、細菌の検出を含むバイオセンシングアプリケーションのための分子プローブの新規クラスとしてDNAzymesの可能性を調べるに興味がある5。 DNAzymes（またdeoxyribozymesまたはDNA酵素として知られている）は人工の化学反応を触媒する機能を備えた一本鎖DNA分子を6-8、これらの分子は、多くの10とを含む広大なランダムシーケンスDNAプール（から単離することができる16個の配列）o &quot;はin vitroでの選択で &quot;として知られるプロセスによってR &quot;SELEX&quot;（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）。9月16日これらの特別なDNA分子は、広くバイオセンシングアプリケーションのための分子ツールとして近年検討されている6-8。 我々の研究室ではRNA-切断蛍光DNAzymes（RFDs、図1）を単離するためのインビトロでの選択の手順で確立したと分析のツールとしてRFDsの使用を検討した17から29 RFDsは、単一のリボヌクレオチドでDNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。蛍光体（F）およびクエンチャー（Q）によって挟まれているジャンクショ​​ン（R）。 FとQの近くには未開基板最小限の蛍光をレンダリングします。しかし、切断イベントは、蛍光強度の顕著な増加を伴っているFとQの分離につながる。 最近では、我々は、細菌を検出するためのRFDsを単離する方法を開発しました。5これらの特別なRFDsは&quot;に分離された粗混合物を使用すると、浄化の退屈なプロセスを回避します。自分の環境で、またはそれらが培養されているメディアの中の細菌の特定のタイプ（ 図1）によって残された原油の細胞外液（CEM）の存在下で、 &quot;点灯し、バイオセンサーの開発（完了するまで数ヶ月または数年かかる可能性がある）の対象となる微生物から適切なターゲットを識別します。外のターゲットを使用すると、細胞内のターゲットを取得する手順については、必要はありませんので、検定の手順はシンプルであることを意味します。 のみE.によって生成されたCEMの存在下で、上記のアプローチを使用して、我々は（ 図2A。FS1）は、その基板を切断するRFDを導出した大腸菌 （CEM-EC）。5このE. RFD-EC1（ 図2A）という名前の大腸菌検出RFDは、厳密にCEM-ECへの応答が他の細菌のホスト（ 図3）からのCEMに応答しなくなることが判明した。 ここでは、presaの複数形NT E.を設定するための重要な実験手順RFD-EC1と代表的な結果を用いて大腸菌の検出アッセイ。

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを &quot;ミックス·アンド·読む&quot;を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、 &quot;RFD-EC1&quot;を表すモデルの細菌の検出のために採用されている重要な実験手順を説明します。<em&gt;大腸菌（Escherichia coli）</em&gt;。

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

食品由来および院内感染の病原体に起因するアウトブレイクは、数百万人の死者や入院患者を出すだけでなく、莫大な経済的損失をもたらしています。

本実験の目的は、新規のflu genic DNA Zymeプローブを用いて、大腸菌（e coli）などの特定の細菌の存在を迅速に検出することである。まず、ライゲーションによってgenic DNA Zymeプローブを作製する。次に、細菌を培養して標的分子の数を増やし、その上清から細胞外混合物を調製する。次に、粗抽出した細胞外混合物をDNAザイムプローブと混合します。DNAザイムプローブと標的分子との相互作用によってプローブが切断され、蛍光を発します。フルオリメーターを用いて、プローブと標的の相互作用を相対蛍光強度の増加として検出します。その後、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて結果を検証します。この手法のPCRや抗体ベースの手法に対する主な利点は、手順がより簡便で実施しやすいことです。本手法はモデル細菌であるe coliを用いて開発されましたが、その他のあらゆる食品由来または院内感染の原因となる細菌病原体の検出に適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、合成DNAプローブや細菌の取り扱いに慣れていないため苦労することがあります。本プロトコルの手順を実演するのは、私の研究室のリサーチアシスタントであるSergio Aguireと、ポストドクターのMonso Aliです。R-F-D-E-C 1は、注目すべきDNA Zymeです。これは、黒線で下線が引かれた触媒配列EC 1と、緑線で下線が引かれた基質配列FS 1で構成されています。基質内には、青色のrで示されるRNAリンカーが含まれており、Fで示されるフルオロラベル付きDTと、Qで示されるクエンチャーラベル付きDTに挟まれています。RF SS 1はRFD EEC 1のスクランブル版であり、触媒配列EEC 1は部分的にSS 1へとシャッフルされていますが、FS 1部分は変更されずに維持されています。RF DEC 1およびRF SS 1は、オリゴヌクレオチドFS 1をオリゴヌクレオチドEC 1またはSS 1と、ライゲーションテンプレートとしてLT 1の存在下でテンプレート媒介酵素ライゲーションを行うことにより作製し、R-F-D-E-C 1の標的として使用する粗抽出液（CEM）を調製します。まず、ピペットガンを用いて、滅菌済みの14 mL培養チューブに2 mLのLBを分注することから始めてください。次に、滅菌済みのピペットチップを用いて、アガープレートからe coliの単一コロニーをピックアップし、LBを含む培養チューブに投入します。チューブを37 °Cに設定したインキュベーターに入れ、14時間の培養後、250 RPMで振盪します。1%の接種培養液を作成するために、14 mLの培養チューブに2 mLの新鮮なLBを分注し、前ステップで得られた細菌培養液を20 µL加えます。各細菌溶液のOD 600が約1.0になるまで、37 °Cで250 RPMで振とう培養します。各培養液を1 mLずつ新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、11,000 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心分離後、透明な上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。上清を-20°Cで保存します。DNA酵素と粗細胞抽出液の相互作用によって蛍光信号が発生するかを直ちに確認しない場合は、分光光度計を用いてサンプルを分析します。蛍光分光光度計の電源を入れ、励起波長を488 nm、蛍光波長を520 nmに設定してデータ収集パラメータをセットアップします。また、装置を1時間にわたって1分ごとに測定を行うよう設定します。3つの石英結晶キュベットを、まず脱イオン蒸留水で洗浄し、次に100% ethanolで洗浄します。キュベットを窒素ガスで吹き付けして乾燥させます。キュベットに、コントロール1用としてC1、コントロール2用としてC2、テスト用としてTのラベルを貼ります。次に、C1に24 µLの蒸留脱イオン水を、C2とTに調製したE. coli粗細胞外混合液を24 µLずつ分注します。各キュベットに25 µLの2 X RBを加え、蛍光分光光度計に設置します。5分後に蛍光データの収集を開始し、蛍光測定を中断させないように注意しながら、C2に5 µMのRFS S1を1 µL、TとC1に5 µMのRFD eec1を1 µLずつ加えます。ピペッティングで各溶液を混合し、データ取得期間の終了まで反応を継続させます。データをExcel形式で保存します。その後、データをパーソナルコンピュータに転送し、Excelを使用してグラフ画像を作成します。Spectraによる分析に使用したものと同じ反応混合物を使用してください。光度計を用いてゲル電気泳動による解析を行うことができます。1時間の測定後、分光光度計からキュベットを取り出し、溶液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。3 M 酢酸ナトリウム 5 µLと100%エタノール 125 µLを加えて反応を停止させます。各溶液をボルテックスで混合し、インキュベーション後、チューブを-20 °Cのフリーザーで1時間静置します。反応混合物を4 °C、11,000 Gで20分間遠心分離し、ピペッティングで慎重に上清を除去します。DNA濃縮器を用いて、ペレットを10分間乾燥させます。ゲルロード用バッファーを20 µL加え、短時間ボルテックスします。ベンチトップ遠心機で短時間スピンダウンします。次に、泳動後、10%Dageゲルの各ウェルに反応サンプルを10 µLずつロードします。ガラスプレートを取り外し、水道水で十分に洗浄します。ゲルの破片を取り除くため、キムワイプでプレートを拭きます。Typhoonスキャナーを用いて、ゲルプレートの蛍光をスキャンします。得られた画像を画像定量ソフトウェアで解析し、システムの感度を評価します。段階希釈した培養物を、時間を変えて培養します。単一の細菌を検出するために必要な最小インキュベーション期間を決定するため、2 mLのLB培地を含む10本の培養チューブを準備します。各培養物に、2 CFU/mLに調整したE. coliのグリセロールストックを100 µLずつ接種し、37 °C、250 RPMの振盪条件下で4、8、12、16、および24時間インキュベートします。接種した各培養チューブから300 µLを回収します。なお、4、8、12時間の時点で回収したサンプルでは、検出可能な細菌が存在しない可能性があります。残りの培養液を24時間培養し、細菌を含む培養液を特定します。OD 600を測定し、11,000 Gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させます。CEMSを含む上清を新しい1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、翌日に使用するまで-20 °Cで保存します。培養液の増殖を確認します。接種後、10本の培養液のうちe coliが含まれるのは1本または2本のみであり、残りのチューブには細胞は含まれません。指定された時点で陽性培養液から回収したCEMSを使用します。RFD EEC oneを用いた切断反応を準備し、前述のDAGEゲル電気泳動を用いて反応混合物を分析します。RFD EEC oneおよびRF SS oneの両プローブは、DNA zyme部分を基質に酵素的にライゲーションさせることで調製されました。CEM EECとRFD EEC、またはRF SSの相互作用を分光法により評価しました。ここで示されているように、CEM ecの添加により、RFD EECから高レベルの蛍光信号が検出されました。対照的に、R FS S oneは強い蛍光信号を示しませんでした。したがって、CEM ECと接触した際のRFD EEC oneの蛍光産生機能が配列化されます。観察された蛍光強度の増加がRNAリンカーの切断によるものであることを確認するために、特異的な検証を行いました。反応混合物を分析しました。RFD eecのdage切断において、0.25 Mの水酸化ナトリウムによる処理では、5'末端にフルオロフォアを保持する断片と3'末端にクエンチャーを保持する断片という2つのNA断片が生成されることが予想されます。ここに見られる通りです。RFD EEC CEM EEC反応混合物により、期待通りの切断産物が実際に生成されました。さらに、UNCのみがR-F-D-E-Cを切断し、5'端フラグメントが蛍光イメージングで検出されました。RFD EECの特異性を検討するため、他のいくつかのグラム陰性菌およびグラム陽性菌からのみ回収したCEMSを用いて蛍光アッセイを実施しました。CEM ECを含むサンプルでは、蛍光の増加が認められました。他の細菌由来のCEMSとの交差反応が見られなかったことは、R-F-D-E-C oneがE. coliに対して高い選択性を持つことを示しています。単一のE. coli細胞を検出するために必要な最小培養時間を決定するため、E. coliを100 µLの増殖培地中で1 CFU/mLに希釈し、4、8、12、16、および24時間培養しました。得られたCEMSをR-F-D-E-C oneと混合し、ここに示すようにdageを用いて切断を評価しました。Dageアッセイの画像から、R-F-D-E-C 1では期待された切断産物が生成されなかったことが示されています。CEMと反応させた際、培養4時間後および8時間後に回収したECSでは、習熟後に12時間の培養時間が必要であることが示されました。この手法の重要な構成要素は、適切に実施されれば、DA酵素ベースのアッセイを60分で完了できる点にあります。この開発により、バイオ分析分野の研究者が、広範囲にわたる細菌病原体を検出するためのアロゲニックDNA酵素を探索するための道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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