はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング 2基板

この手順の全体的な目標は、パラリンの事前定義された基本設計に従って、二酸化ケイ素サービス上の細胞をパターン化することです。これは、最初に目的のパターンの写真マスクを作成することによって実現されます。2番目のステップは、シリコンウェーハを酸化してからパラリンでコーティングすることです。

次に、マイクロエレクトロニクスのクリーンルーム施設で行われるフォトリソグラフィープロセスを使用して、パララインコーティングを選択的にエッチングし、目的のデザインを明らかにします。最後のステップは、最初にピラニア酸を使用してチップを活性化し、次にウシの胎児血清で3〜12時間インキュベートした後、細胞懸濁液を培養に適用できることです。最終的に、細胞のパターニングは、解剖顕微鏡を使用したライブセルイメージングによって、または共焦点蛍光顕微鏡を使用した固定後に評価できます。

この技術が既存のいくつかの細胞パターニングプラットフォームと比較した場合の主な利点は、生物学的薬剤をクリーンルームに持ち込む必要がないことです。また、パターンチップは、最初にパー酸、次に血清で活性化されるまで無期限に保持できます。目的のパララインC構成を設計するには、CIFまたはGDSの2つのファイルの読み取り、書き込みが可能なレイアウトエディタソフトウェアパッケージを使用します。

フォトマスクメーカーを適切なマイクロエレクトロニクス施設にアウトソーシングするか、社内で製造します。施設がある場合は、シリコンウェーハを摂氏950度の大気圧水平炉で40分間酸化し、200ナノメートルの二酸化ケイ素層を生成します。その後、小さなスポットで厚さを確認します。

分光反射率計。ウェーハを真空蒸着システムに入れ、チャンバー蓋の内側に正弦接着促進剤を塗布します。ポンプダウンサイクル中、正弦接着促進剤は、真空蒸着システムを使用して、周囲温度で酸化したウェーハ負荷パララインをダイマー1ミリグラムあたり1.3ナノメートルの速度で炉堆積パラリンCにコーティングします。

その後、パララインコーティングされたウェーハにHMDS接着促進剤を堆積させます。適切なフォトレジストコーティングシステムを使用して、フォトレジストコーティングシステムを使用して1ミクロンの厚さを得るためにポジフォトレジストを塗布しながら、ウェーハを4、000RPMで30秒間回転させ、その後、ウェーハを90°Cで60秒間ソフトベークします。次に、ウェーハと製造済みのフォトマスクの両方をマスクアライナーに挿入します。

フォトレジストでコーティングされたウェーハにUV光を照射して、目的のパターンをフォトレジストに転写します。その後、露出したウェーハを摂氏110度で60秒間焼きます。次に、酸素プラズマエッチングシステムを使用して保護されていないパララインであるHoffの適切な現像液で現像することにより、ウェーハから露光されたすべてのフォトレジストを除去し、下にある二酸化ケイ素を明らかにします。

次に、さいの目に切った後のチップを、必要になるまでほこりのない箱に保管します。この手順では、アセトンを10秒間洗浄して、チップから残留フォトレジストを取り除きます。次に、脱イオン蒸留H2Oで3回すすぎ、その後、酸ヒュームフードで新鮮なピラニア酸を作り、ピアナ酸に10分間浸してチップをきれいにし、エッチングします。

次に、チップを脱イオンH2Oで3回すすぎ、層流組織培養フード内の滅菌培養皿に移します。セルパターニング用のチップを活性化するには、ウェルごとに2つのチップを6ウェルプレートに配置します。次に、すべてのチップを完全に浸すように、2ミリリットルのウシ胎児血清を追加します。

チップを血清中で摂氏37度で3〜12時間インキュベートします。次に、チップをアクティベーションソリューションから取り外します。ハンクのバランス塩溶液で10秒間1回洗います。

次に、チップを培養ウェルに入れ、選択した細胞タイプを通常の増殖培地に懸濁液としてプレートします。最適なセルめっき密度は、パララインCオンチップのセルタイプと幾何学パターンの両方に依存します。1ミリリットルあたり10の4番目の細胞の5倍の密度が賢明な出発点です。

イメージングは、細胞パターニングの根本的な動機に合わせて調整されますが、生細胞の挙動は、解剖顕微鏡と適切なリレーレンズを備えたデジタルカメラを使用して簡単に評価できます。これは、パララインC二酸化ケイ素上で培養したHEC 2 93細胞の3日後のライブセルイメージングです。インビトロでは、船をウシ胎児血清中で3時間インキュベートし、細胞を1ミリリットルあたり10〜4細胞の5倍の濃度で懸濁液に播種した。

パララインCは細胞接着を促進し、むき出しの二酸化ケイ素は細胞をはじきます。この図は、二酸化ケイ素上のパラリンCのさまざまなパターンで増殖した原発性ヒト神経膠腫由来幹様細胞の免疫蛍光画像を示しています。ここでは、概略図は、網様パラリン設計、グリア線維性酸性タンパク質について染色された固定細胞の蛍光顕微鏡写真、および同じチップ上の生細胞の光顕微鏡写真を示しています。

これは、異なるパララインデザイン上のGFAP染色細胞を示す蛍光画像と、スポークパララインデザインにおけるノードの反射率画像です。そして、この図は、パララインC二酸化ケイ素上で培養された3つのT、3、L、1つの細胞のライブセルイメージングを示しています。in vitroで4日後、チップをウシ胎児血清中で3時間活性化し、細胞を1ミリリットルあたり4番目の細胞の10の5倍の濃度で懸濁液に播種した。

この場合、プラットフォームは、細胞がLene Cおよび二酸化ケイ素領域で等しくコンフルエントになるパターニングを可能にしません。このプロトコールを行う際には、ピラニア治療の直後に血清の活性化が起こらなければならないことを覚えておくことが重要です。そうしないと、パターニングプロセスが損なわれます。

ピラニア酸の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。ピラニア酸は、化学薬品のヒュームフードで準備して使用し、適切なゴーグル、白衣、手袋を着用してください。