Name: はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング 2基板 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学ぶパリレン-Cを用いたSiO₂上での細胞パターニング法。フォトリソグラフィとプラズマエッチングで設計通りのパターンを形成し、細胞接着と排斥を制御します。クリーンルームでの生物学的汚染リスクを回避し、長期保存可能なチップで神経科学研究に応用できます。

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1。 SiO 2上パリレンパターンの作製：プロセスフロー（図1を参照してください） <ol><li>デザインは、CIF（カリフォルニア工科中間形式）またはGDS-II（グラフィックデータベースシステム-II）ファイルの書き込み/読み込みが可能なレイアウトエディタソフトウェアパッケージを使用して、パリレン-Cの設定を希望する。 CIFとGDS-IIは、集積回路のアートワークのレイアウトのための業界標準のファイル形式です。 </li><li>手数料フォトマスクは、適切なマイクロエレクト​​ロニクス施設に製造、または施設が存在する場合、社内で行う。 </li><li> 200nmのSiO 2層（小さ ​​なスポットの分光反射率と厚さを確認する）を生成するために40分間950℃で大気圧の水平炉（H 2 1.88 SLMとO 2 1.25 SLM）のシリコンウェーハを酸化する。 </li><li>素数シラン接着促進剤で酸化されたウエハ。今具体的にパリレンを堆積させるために設計された真空蒸着装置を用いて、二量体の1.298Å/ミリグラムの速度で22℃、パリレン-Cを堆積させる。 100膜厚パリレン-C被膜は、以下に示す全ての実施例に使用した。 </li><li>好適なフォトレジストコーティングシステムを用いて、パリレンコーティングされたウェハ上の次のデポジットヘキサメチルジシラザン（HMDS）接着促進剤。 </li><li>今陽性上記と同じフォトレジストコーティングシステムを用いて、（1μmの理論的な厚さをもたらす）、フォトレジストを塗布しながら、30秒間、4000rpmでスピンウェハ。 </li><li>ソフト90℃で60秒間ウェハを焼く</li><li>マスクアライナにウェハと予め製造フォトマスクの両方を挿入します。 </li><li>希望のパリレン-C構成の紫外線ネガティブ表現とフォトレジストでコーティングされたウェハを公開します。 </li><li> 110℃で60秒間露光したウエハを焼く</li><li>すべての露出フォトレジストの適切な現像液で現像することによってウエハからを削除します。 </li><li>保護されていないパリレンをエッチング除去。 50ミリトールのチャンバ圧で酸素プラズマエッチングシステム（49 SCCMのO 2、13.56MHzの100WのRFパワー、を使用下地SiO 2を明らかに100Å/分）のエッチング速度。 </li><li>適切なダイシングソー（スピンドル回転数30000rpmで、送り速度7ミリメートル/秒）を用いてウェハをダイシング。 </li><li>脱イオンH 2 O中のチップをすすぎ、窒素で乾燥吹く。 </li><li>埃箱に保管してチップ（無期限）が必要になるまで。 </li></ol> 2。チップ洗浄と活性化：プロトコル<ol><li> 10秒間アセトンに洗浄することにより、チップからの残留フォトレジストを除去。 </li><li>脱イオン蒸留H 2 Oの3倍にすすいでください。 </li><li>新鮮ピラニア酸（午前5時03分30％過酸化水素の比および98％硫酸）を構成する。 注意：細心の注意を払ってピラニア酸を準備します。それは、非常に強力な酸化剤である強酸性であり、および硫酸と過酸化水素水とを混合して発熱反応である。酸ドラフト内で、この段階を実行します。 2分ピラニア酸を混合した後に通過させますが、20分以内に使用しています。 </li><li> PIに浸漬することにより、クリーンでエッチチップ10分間ranha酸。 </li><li>すすぎのチップは、脱イオンH 2 Oで3倍と無菌培養皿に移す。 </li><li>ここでセルパターニングのためのチップをアクティブにします。例えば、6ウェルプレートにウェル当たり2つのチップを追加し、完全にすべてのチップを浸漬するように、次いで、ウシ胎児血清2 mlを加える。層流の組織培養フード内で無菌条件下でこれと、後続のすべての細胞培養段階を実行する。 </li><li> 37℃で3月12日時間にわたって血清中のチップをインキュベート 注：ステップ2.4​​から2.7に順次ステップ間の遅延なく実行する必要があります。血清活性化はピラニア·治療後≥24時間遅れで表示されている場合は、細胞のパターニングをSiO 2地域から低下による細胞の反発に損なわれている。 特定の細胞接着タンパク質を含む代替的な活性化溶液は、ウシ胎児血清の代わりに使用することができる。このようなソリューションは、（例えば代表的な結果を参照してください）​​2対照的な基質の細胞接着特性を変更。 </li&gt; </ol> 3。オンチップメッキ細胞株：プロトコル<ol><li>それらの活性化溶液からチップを取り外し、ハンクス液で10秒間に一度洗う。 </li><li>培養ウェルにチップを置き、その通常の増殖培地中の懸濁液として選択された細胞型プレート。最適な細胞播種密度は、細胞型及びオンチップパリレン-Cの幾何学的パターンの両方に依存する。 5×10 4細胞/ mlの密度は、賢明な出発点である。 </li><li>イメージングは​​、細胞パターニングのための基礎となる動機に合わせて調整されるが、生細胞の挙動を容易に適切なリレーレンズとの解剖顕微鏡およびデジタルカメラを用いて評価することができる。 </li></ol>

<ol><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staying+alive%3A+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li>
<li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li>
<li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cell+adhesion%2C+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li>
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<li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li>
<li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+and+micro-+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+World%22%5BJournal%5D)">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li>
<li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurochip%3A+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li>
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<li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+molecular+assembly+patterning%3A+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li>
<li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li>
<li>Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. 85 (2), 530-538 (2008).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li>
<li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+MA+%22J.+Biomed.+Mat.+Res.+Mater.+A%22">J. Biomed. Mat. Res. Mater. A</a>. 101 (2), 349-357 (2013).</li>
<li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C%2Fsilicon+dioxide+substrates%3A+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

ピラニア酸中のチップの浸漬は、任意の残留有機材料を除去するだけでなく機能するだけでなく、基板表面をエッチングする。これはウシ胎児血清で効果的な活性化を可能にするための鍵となります。これを怠ると、細胞のパターニングを防ぎ、深く、オンチップ細胞の挙動を変更します。ピラニア酸で洗浄後にチップを滅菌する必要はない。実際、UV照射による滅菌は、用量依存様式で細胞13のパターニングを弱体化させることが示されている。ケアは、フォトリソグラフィ工程の後に、すべての残留フォトレジストを洗い流すように注意しなければならない。持続フォトレジストはparylene-C/SiO 2形状によって決まるパターン化を優先します不要なCYTO接着層として機能することができます。指定された試薬を用いて説明した上記およびフォトリソグラフィプロセスを使用するとき、アセトンは有効である。しかし、フォトレジストの他のタイプの異なる溶媒が必要な場合があります。 のdiffereの影響と成功を評価するために、ntの製造工程、対照的な二つの基板の接触角を測定することができる。 図2は、チップの活性化プロセス中に発生する変化を示す。これは、血清中の特定の接着剤と反発タンパク質成分は、最終的にそれぞれのCYTO-接着剤またはインサイト·反発特性を発揮するためにパリレンパターン化されたチップを有効にすることを、しかし、可能性があります。 我々は正常に厚く、より薄いパリレン層の両方を使用してパターン化しているものの、すべての代表的な結果は、100nmのパリレン厚でチップを用いる。重要なことに、このフォトリソグラフィエッチング技術は、ここに示されるものとはパリレン構成のはるかに大きな三次元の制御を可能にする。例えば、フォトマスクの組み合わせを用いて、混合の厚さのパリレン領域を作成することが可能である。これは、細胞接着/ repul単に口述領域を越えて行く、定義された三次元地形で細胞培養物を作成するための道を開くシオンは、潜在的に構築物にマイクロ流体チャネルを統合する手段を提供しています。 図示のように、しかしながら、このパターニングプラットフォームは、細胞タイプにわたって普遍的に有効ではない。ときは、このプラットフォーム上で培養した種々の細胞株は、彼らの様々な細胞接着分子のプロファイルと、当然異なる動作をします。私たちは、まだこの細胞パターニングプラットフォームを支える血清中の主要コンポーネント、また無料の細胞膜受容体を、確認されていません。将来的にこれを行うと、その有用性と特異性を広げることを約束。例えば、「非パターニング &#39;細胞株は遺伝的に必要な接着分子を発現するので、パターニングを促進するために変更することができる。

合成材料に細胞接着やパターニングを決定メカニズムを理解することは、組織工学、創薬、およびバイオセンサー1-3の製作などのアプリケーションのために重要である。多くの技術が利用可能であり、進化している、細胞接着に影響を与える無数の生物化学的、​​および物理的因子の各々を活かし。 ここでは、最初にマイクロエレクト​​ロニクス製造のために開発されたプロセスを利用した細胞パターニング技術を記載している。このように、プラットフォームは、パターン化プラットフォームに、このような多国間環境協定のような超小型電子技術の下流の統合を可能にするためによく置かれている。 細胞膜と隣接する材料との間のインターフェースは、双方向かつ複雑である。 インビボにおいて 、細胞外マトリックスタンパク質は、構造及び強度と細胞接着受容体との相互作用を介して細胞挙動に影響を与える。 Vにおいても同様に、細胞物理化学的な影響にも接着力を調節しながらitroタンパク質4の吸収された層を介して合成基質と相互作用します。例えば、ポリマー表面は、イオンや紫外線照射、または酸もしくは水酸化5での処理によるエッチングによって（親水性）以上の「湿潤性」にすることができる。細胞パターニングのための確立された方法は、これらおよび他の細胞接着メディエーターを利用する。例としては、インクジェット6を印刷、マイクロ7スタンピング 、物理的な固定化8、マイクロフルイディクス9、リアルタイムの操作10、および選択的な分子集合体のパターニング（SMAP）11が含まれています。それぞれが特定の利点と制限があります。我々の仕事で重要なドライバは、しかし、微小電気機械システム（MEMS）を用いて細胞のパターン化を統合することです。 MEMSは、電気で駆動さ非常に小さい機械装置を参照してください。これは、ナノスケールの当量nanoelectromechに重なっanicalシステム。この概念は、半導体戦略はマイクロスケールで行われるように製作を可能にした場合にのみ実用的になりました。半導体エレクトロニクスのために独自に開発した微細加工技術が誤って、例えば、セルラ電気生理学など、他の用途に有用であることが見出された。重要な下流の目的は、（バイオMEMSデバイスを形成する）高忠実度セルパターニングプロセスでそのようなマイクロエレクト​​ロニクス技術を組み合わせることである。いくつかの既存の、そうでなければ、信頼性の高い実用的な細胞パターニング技術は、この考え方と互換性がありません。例えば、任意の埋め込まれたマイクロエレクト​​ロニクスやバイオセンサーの正確な位置合わせは、それらの有効性の基本であるが、このようなマイクロスタンピングのような技術を用いて達成することは極めて困難である。 この問題を回避するために、我々はフォトリソグラフィで印刷されたパリレン-Cを使用していますSiO 2系のパターン形成のプラットフォームに取り組んでいます。フォトリソグラフィは、からの幾何学的特徴の移動を含むUV照射を介して基板にマスク。マスクは、適切なコンピュータ支援設計プログラムを用いて設計される。ガラス板の際に、不透明なクロムの薄層は、所望の幾何学的パターンを（1-2程度の特徴の解像度が可能である）を表す。パターン形成される基板は、フォトレジストの薄層（UV感受性ポリマー）でコーティングされている。コー​​ティングされたポリマーは、その後、位置合わせされたマスクに密着する。 UV源は、非保護領域が照射されるように適用され、従って背後にマスクパターンのパリレン-C表現を残して、次の現像工程で可溶性およびリムーバブルなっている。このプロセスは、半導体デバイスの開発時に始まった。このように、シリコンウェーハは、しばしば、基板として使用される。 SiO 2上パリレン-Cのフォトリソグラフィ堆積は、それゆえ、日常のマイクロエレクトロニクスクリーンルーム施設内で ​​行われる簡単で信頼性の高いプロセスである。 パリレンはきたが（非生分解性、化学的に不活性な）いくつかの望ましい生体工学特性、細胞のパターニングでの直接の使用を制限する要因は、その極度の疎水性に一部起因し、その本質的に貧弱な細胞接着性である。それにもかかわらず、パリレン-Cは、以前に剥ぎ取りセルラ鋳型12,13として、例えば、細胞パターン形成のために間接的に使用されている。このアプローチは、貧しい人々の解像度によって制限され、複数の手順を必要としている。代わりに、ここで説明する処理は、そのパリレン-Cの領域を確保するために、血清のインキュベーションに続いて、酸エッチングステップを利用する疎水性の減少および血清タンパク質結合の組み合わせを介して、細胞接着になる。 最終結果は、生物学的活性化後に、それぞれのインサイト、接着剤またはインサイト反発特性を発揮し、従って有効な細胞パターニングプラットフォームを表し、二つの異なる基材からなる構築物である。重要なことに、生物学的AGを導入する必要はない（これらは、ウシ胎児血清または他の活性化溶液を用いて活性化されるところ）パターン化された基質としてクリーンルーム設備にエントは、使用前に無期限に保存することができる。 製造プロセスは、非常に密接に超小型電子製造に使用されているものを鏡として、このparylene-C/SiO 2パターン化プラットフォームは、そのためのMEMS構成要素との連立のための良い候補である。

<table><tbody><tr>WieWeb<td></td>の<td>レイアウトエディタソフトウェアパッケージ</td><td>CleWin 5.0</td><td>CIFまたはGDS-IIファイルの読み取り/書き込みが可能です。フォトマスク製造用のパリレンデザインを作成するために使用されます。 http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td></tr><tr><td>オーダーメイドのフォトマスク</td><td>Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland</td><td></td><td>自社で製造するか、または委託しています。 www.compugraphics-photomasks.com</td></tr><tr><td>3 in Silicon wafers</td><td>Siltronix, Archamps, France</td><td></td><td>http://www.siltronix.com</td></tr><tr><td>Atmospheric horizontal furnace</td><td>Sandvik</td><td></td><td>シリコンウェーハの酸化に使用します。http://www.mrlind.com</td></tr><tr><td>スモールスポット分光反射率計</td><td>ナノメトリクス</td><td></td><td>二酸化ケイ素層の深さを測定する www.nanometrics.com/</td></tr> <tr><td>シラン接着促進剤</td><td>メルク・ケミカル</td><td>ズ 1076730050</td><td>パリレンの堆積を促進するためにウェーハにあらかじめ塗布されています。 www.merck-chemicals.de/</td></tr> <tr><td>パリレン-C</td><td>ウルトラエレクトロニクス</td><td></td><td>www.ultra-cems.com</td></tr><tr><td>SCS Labcoter 2 蒸着ユニット、モデル PDS2010</td><td>SCS Equipment、英国サリー</td><td>モデル PDS2010</td><td>www.scscoatings.com/</td></tr> <tr><td>ヘキサメチルジシラザン (HMDS) 接着促進剤</td><td>SpiChem</td><td></td><td>www.2spi.com</td></tr><tr><td>ウェーハ上にフォトレジストを分注するための自動トラックシステム。 3インチフォトレジストトラック</td><td>SVG(silicon Valley Group)</td><td></td><td>ウェーハにフォトレジストを塗布するための自動トラックシステム。プライムオーブンでウェーハを焼き、接着促進剤であるHMDSを分注します。コンビネーションスピナーはフォトレジストをディスペンスします。プレベイクオーブンはレジストを硬化させます。</td></tr><tr><td>フォトレジスト</td><td>ローム&Haas</td><td>SPR350-1.2 ポジフォトレジスト</td><td>www.rohmhaas.com/</td></tr> <tr><td>MA/BA8 フォトマスクアライナー</td><td>Suss Microtech</td><td></td><td>www.suss.com</td></tr><tr><td>Microchem MF-26A 現像液</td><td>Microchem</td><td></td><td>フォトレジストの露出領域を除去 www.microchem.com</td></tr><tr><td>JLS RIE80 プラズマエッチングシステム</td><td>JLS Designs</td><td></td><td>パリレンの露出領域を除去。 www.jlsdesigns.co.uk</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>ディスコ DAD 680 ウェーハダイシングソー</td><td>ディスコ株式会社</td><td></td><td>www.disco.co.jp</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A929-4</td><td>残留フォトレジストを洗い流します。</td></tr><tr><td>30% 過酸化水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009 www.sigmaaldrich.com</td><td></td></tr><tr><td>98% 硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435589</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>10437</td><td>標準チップ活性化。&nbsp;www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>14170</td><td>www.invitrogen.com</td></tr></tbody></table>

はsio：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-c上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

セルパターニングプラットフォームは、このような事前定義されたin vitroでの神経細胞のネットワークの構築および細胞生理学の一定の中央側面の探査など幅広い研究目標をサポートしています。簡単に多電極アレイ（MEAの）との細胞のパターニングを組み合わせることや技術のシリコンベースの「チップ上の実験室」は、微細加工と互換性のあるプロトコルが必要となります。我々は、SiO 2ウエハ上のポリマーパリレン-Cの堆積を利用する方法を記載している。フォトリソグラフィは、ミクロンレベルの解像度でパリレン-Cの正確で信頼性の高いパターン形成を可能にします。ウシ胎児血清（または他の特異的活性化溶液）に浸漬することによりその後の活性化培養細胞に付着するか、またはそれぞれパリレンまたはSiO 2領域によって反発された基板が得られる。この技術は、初代マウス海馬細胞、HEK 293細胞株、ヒト神経様奇形癌を含む細胞型（広い範囲のパターニング可能にした細胞株、初代マウス小脳顆粒細胞、および初代ヒト神経膠腫由来の幹細胞様の細胞）。しかしながら、興味深いことに、プラットフォームは、普遍的ではないであり;細胞特異的接着分子の重要性を反映している。この細胞パターニング工程は、信頼できる費用効果的であり、重要なマイクロエレクト​​ロニクス技術の統合のための道を開き、標準的な微細加工（チップ製造）プロトコルに組み込むことができる。

パリレン-CのSiO 2をパターニングするフォトリソグラフィプロセスを図1に示されている。一旦調製し、ウシ胎児血清中のチップの活性化は、培養物中にパターン形成される細胞型の広い範囲を可能にする。我々のグループは正常に初代マウス海馬細胞14〜16、HEK293細胞株17、人間の神経様奇形（HNT）細胞株18、初代マウス小脳顆粒細胞、および初代ヒト神経膠腫由来の幹細胞様細胞をパターン化している。 図3は、「十字線」の拡張子を持つ円形のノードからなるパリレンパターン上のHEK293細胞の頑強なパターニングを示している。本例のチップ活性化ウシ胎児血清であった。対照的に、 図4は、代替の活性化溶液を用いてパターニングプラットフォームを増強する可能性を示している。ウシ血清アルブミン（3 mg / ml）での溶液を用いて<html> HBSS中フィブロネクチン（1μg/ ml）を、前のパターン化教訓が反転している。 図5は、異なる細胞型（高悪性度神経膠腫由来の初代ヒト由来幹様細胞株）を示している。 図4Bおよび4Cに示すように、ここでは、 図4Aに示すパターンは、薄いパリレン-Cに沿って細胞プロセスの成長を促進する基になるパターンに影響を与える細胞の挙動の形状は、追跡する。 確立されたウシ胎児血清の活性化プロトコルを使用する場合、いくつかの細胞型は、パターンがない。6は、パリレン-CとSiO 2領域の間に識別可能なインサイト反発またはインサイト粘着差コンフルエンスまで成長3T3 L1細胞を示す図 。 pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。 SiO 2上パリレン-Cのパターンを製造するためのプロセスを示す図で流れる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> 図2チップの活性化ステップの間、パターン化パリレン-CおよびSiO 2のドメインの接触角の変化を示すフロー図である。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> 図3。 in vitroでの 3日後にparylene-C/SiO 2上で培養したHEK293細胞の生細胞イメージングは。チップはウシ胎児血清中で3時間培養した細胞をし、その後、5×10 4細胞/ mlの濃度で懸濁状態で培養した。パリレン-Cは、裸の​​SiO 2の一方で、細胞接着を促進する細胞をはじく。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> 図4。 parylene-C/SiO 2に293細胞を培養したHEKの生細胞イメージング、in vitroで 3日後に別の合理化、活性化ソリューションで3時間活性化したチップであって、a：ウシ胎児血清、B：ビトロネクチンHBSS中（1μg/ ml）を、 C：ウシ血清アルブミン（3 mg / ml）をHBSS +、Dにおけるビトロネクチン（1μg/ ml）を：ウシ血清アルブミン（3 mg / ml）を+フィブロネクチン（156、G / ml）をHBSS中。播種した細胞は、5×10 4細胞/ mlの密度で懸濁していた。チップの異なる治療は、SiO 2を用いた以前のパターニングドグマ、今や接着剤及びパリレン-C反発の逆転をもたらした方法に注意してください。ヒューズら 17から適応パリレン-C節直径250μmのは、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> 図5。 。初代ヒト神経膠腫由来の幹細胞様細胞の免疫蛍光画像は、SiO 2上のパリレン-Cの様々なパターンA上に成長させた ：回路図BとCに示す網状パリレン設計を示 ​​す</strong&gt; B：グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）について染色（in vitroで 4日後）、固定された細胞の蛍光顕微鏡写真C：同一チップ上の生細胞の光学顕微鏡写真D：別のパリレンにGFAP染色細胞を示す蛍光画像。デザインE：反射ノードの画像とDで画像化パリレンデザインスポーク<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> 図6。 in vitroで 4日後のparylene-C/SiO 2上で培養した3T3 L1細胞の生細胞イメージング。ワットの後にウシ胎児血清中で3時間、活性化したチップHICH細胞懸濁液（3×10 4細胞/ ml）に播種した。この例では、プラットフォームは、細胞がパリレン-CとSiO 2の領域上に均等にコンフルエントになってきて、パターン化は有効になりません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、SiO 2のセルパターニングのための微細加工と互換性のある方法を記載している。事前に定義されたパリレン-Cの設計は、フォトリソグラフィによってSiO 2のウェハ上に印刷されています。血清（または他の活性化溶液）とのインキュベーション後の細胞を特異的に接着し（との適合性に応じて成長する）はSiO 2領域によって撃退されながら、基礎となるパリレン-C、。

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

本手順の目的は、あらかじめ定義されたパリレンの下地デザインに従って、二酸化ケイ素表面に細胞をパターニングすることである。これはまず、目的のパターンのフォトマスクを作成することで達成される。次に、シリコンウェハを酸化させ、パリレンでコーティングする。次に、マイクロエレクトロニクス・クリーンルーム施設でフォトリソグラフィー工程を行い、パリレンコーティングを選択的にエッチングして、目的のデザインを露出させます。最終ステップとして、まずピラニア溶液を用いてチップを活性化し、続いて胎児牛血清中で3〜12時間インキュベートします。その後、培養のために細胞懸濁液を塗布することができます。最終的に、細胞パターニングは、解剖顕微鏡を用いた生存細胞イメージング、または固定後の共焦点蛍光顕微鏡観察によって評価できます。この手法の既存の細胞パターニングプラットフォームに対する主な利点は、クリーンルーム内に生物学的剤を持ち込む必要がないことです。また、パターンチップは、最初にpar酸、次に血清で活性化されるまで、無期限に保存することが可能です。目的のparaline C構成を設計するには、CIFまたはGDS IIファイルを読み書きできるレイアウトエディタソフトウェアパッケージを使用してください。フォトマスクの製作は、適切なマイクロエレクトロニクス施設に外注するか、または学内で作成します。設備がある場合は、大気圧水平炉を用いてシリコンウェハを950 °Cで40分間酸化させ、200 nmの二酸化ケイ素層を形成します。その後、少数のスポットで膜厚を確認してください。分光反射計。ウェハを真空蒸着システムに配置し、チャンバー蓋の内側にSine密着促進剤を塗布します。ポンプダウンサイクル中に、Sine密着促進剤が酸化ウェハをコーティングします。パラリンを炉にロードし、真空蒸着システムを用いて、ダイマー1mgあたり1.3 nanometersの速度で、室温でパラリンCを蒸着させます。その後、パリレンコーティングされたウェハにHMDS密着促進剤を塗布します。適切なフォトレジスト塗布装置を用い、ポジ型フォトレジストを塗布しながらウェハを4,000 RPMで30秒間スピンコートし、厚さを1 µmに調整します。次に、ウェハを90 °Cで60秒間ソフトベイクします。その後、ウェハと作製済みのフォトマスクの両方をマスクアライナーに挿入します。レジストを塗布したウェハにUV光を照射し、目的のパターンをレジストに転写します。その後、露光したウェハを110 °Cで60秒間ベークします。次に、適切な現像液で現像し、露光されたレジストをすべてウェハから除去します。その後、酸素プラズマエッチングシステムを用いて保護されていないパリレンを除去し、下層の二酸化ケイ素を露出させます。その後、ダイシング後のチップを必要になるまで防塵ボックスに保管します。この手順では、アセトンで10秒間洗浄し、チップから残留フォトレジストを除去します。次に、脱イオン蒸留H2Oで3回すすぎます。その後、酸用ドラフトチャンバー内で新鮮なピラニア溶液を調製し、チップをピラニア溶液に10分間浸漬して洗浄およびエッチングを行います。次に、チップを脱イオンH2Oで3回洗浄し、ラミナーフロー式組織培養フード内で滅菌済みの培養皿に移します。6ウェルプレートの各ウェルにチップを2枚ずつ配置し、細胞パターニングのためにチップを活性化させます。続いて、すべてのチップが完全に浸るように、胎児牛血清を2 mL加えます。チップを血清中で37°C、3〜12時間インキュベートします。次に、チップを活性化溶液から取り出します。ハンクス平衡塩溶液で10秒間、1回洗浄します。次に、チップを培養ウェルに入れ、選択した細胞種を通常の増殖培地を用いた懸濁液として播種します。最適な細胞播種密度は、細胞種およびチップ上のparaline Cの幾何学的パターンに依存します。開始点としては、1 mLあたり5×10⁴個の密度が適切です。イメージングは細胞パターニングの根本的な目的に合わせて調整されますが、適切なリレーレンズを備えた解剖顕微鏡とデジタルカメラを使用することで、生細胞の挙動を容易に評価できます。ここでは、paraline C 二酸化ケイ素上で3日間培養した HEC 2 93 細胞の生細胞イメージングを示します。in vitro において、チップを胎児牛血清中で3時間インキュベートし、細胞を 5 × 10⁴ cells/mL の濃度で懸濁して播種しました。Paraline Cは細胞接着を促進しますが、裸の二酸化ケイ素は細胞を反発させます。この図は、二酸化ケイ素上のさまざまなパターンのParaline Cで培養されたヒト神経膠腫由来初代幹細胞様細胞の免疫蛍光画像を示しています。ここでは、網状のParaline設計の模式図、グリア線維性酸性タンパク質で染色し固定した細胞の蛍光顕微鏡写真、および同一チップ上の生細胞の光学顕微鏡写真を示しています。こちらは、異なるパラライン設計におけるGFAP染色細胞を示す蛍光画像と、スポークパラライン設計におけるノードの反射画像です。また、この図は、パララインC二酸化ケイ素上で培養された3T3-L1細胞のライブセルイメージングを示しています。in vitroで4日後、チップを胎児牛血清で3時間活性化させ、細胞を5×10⁴ cells/mLの濃度で懸濁して播種しました。この例では、Lene C領域と二酸化ケイ素領域で細胞が均等にコンフルエントになるパターニングは不可能です。本プロトコルを実施する際は、ピラニア処理の直後に血清による活性化を行うことが重要です。これを怠ると、パターニングプロセスが損なわれる結果となります。ピラニア溶液の使用は非常に危険であることに注意してください。ピラニア溶液の調製および使用は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行い、適切なゴーグル、白衣、および手袋を必ず着用してください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング

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