タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

次の実験の全体的な目標は、タンパク質の吸収と細胞増殖を制御するための2次元パターン化された基質を開発することです。これは、フォトリソグラフィーを使用してパターン化されたマスターを作製し、マイクロコンタクト印刷用のA-P-D-M-Sスタンプを製造することによって実現されます。第2のステップとして、パターン化された金基板を調製し、マイクロコンタクトプリンティングを使用して、タンパク質を吸収して抵抗する領域を持つパターンを生成します。

次に、タンパク質と細胞を基質に添加して、パターンを視覚化して研究します。細胞増殖および挙動の結果は、蛍光顕微鏡および面コントラスト顕微鏡に基づいて、これらのパターン基質上に良好なタンパク質および細胞閉じ込めを示す結果が得られます。この手法が、タンパク質のMicroConプリンティングなどの他の既存の方法よりも優れている主な利点は、グリコール末端単層がパターンの背景で非特異的タンパク質および細胞吸収に抵抗することです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、印刷されるパターンごとに適切なスタンピング技術を最適化する必要があるため、苦労します。パターン化されたマスターセンター、スピンコーダー上のシリコンウェーハの準備を開始するには、2サイクルスピンプログラムの最初のステップで、ウェーハをアセトンですすいでください。スピンプログラムの第2ステップでは、アセトンが蒸発してスピンの開始時に清潔で乾燥したウェーハが残り、ウェーハにフォトレジストを塗布した後、前述の条件でスピンコートします。

フォトレジストを塗布したウェーハを110°Cで2分間ソフトベークします。次の写真のパターン。マスクアライナーシステムと適切なマスクを使用してフォトレジストコーティングされたウェーハ。

まず、マスクアライナーのバキュームトラックに基板を置きます。次に、マスクをホルダートレイに挿入し、バキュームをオンにしてマスクを所定の位置に保持し、マスクと基板が良好に接触していることを確認します。マスクに接触するまで基板を持ち上げます。

アライナーの光学系を使用して、良好な接触が行われたことを確認します。最後に、ランプをオンにして、リソグラフィーマスクを介して基板をUV光にさらします。パターン化されたウェーハを現像液で1分45秒間、穏やかに攪拌しながら現像します。

半導体グレードの脱イオン水で十分にすすぎ、UVフィルター付き顕微鏡を使用して窒素ガスチェックパターン現像の流れで乾燥させます。この手順は、10:1重量の樹脂硬化剤を準備することから始めます。葉巻180 2の混合物は完全に。

真空乾燥ドガで使い捨てのペトリ皿の混合物でフォトパターンのウェーハを覆い、気泡が見えなくなるまでPDMSはマスターを覆いました。マスターが皿の底にあることを確認した後、スタンプを摂氏65度のオーブンで1.5時間硬化させます。PDMSスタンプが硬化したら、スタンプをマスターから切り取り、適切なサイズにトリミングします。

スタンプは、ほこりや破片から保護するために、蓋付きの蓋付きの機能面を上にして保管してください。金属蒸着用の基板を準備するには、まず丸いガラスカバースリップを酸素プラズマで10分間処理します。次に、水ですすいだ後、すすぎの間に窒素ガスの流れで乾燥する脱イオン水でカバーを2回すすぎ、すすぎの間に窒素ガスの流れで再び乾燥させるエタノールで2回すすぎます。

マルチプポケット電子ビーム堆積システムを使用して、50オングストロームのチタンと150オングストロームの金を堆積させます。チタン層と金層の堆積の間に蒸発器を挟まないでください。PDMSスタンプをエタノールですすぎ、完全に乾かします。

窒素ガスを使用して、完全にコーティングされるまでスタンプにスタンピング溶液を滴下します。スタンプを窒素ガスで完全に乾かします。HEXA Decaneファイルのマイクロコンタクト印刷は、PDMSスタンプの機能に依存し、この手順の最も難しい側面の1つです。

スタンピングを成功させるには、均一な圧力を加える優れた技術の開発が必要です。スタンピング中。従来の空気中でのマイクロコンタクト印刷では、スタンプを金基板にそっと押し付け、単層を15秒間形成します。

あるいは、非常に小さな特徴と高いアスペクト比で構成されるパターンの場合は、金基板を18.2メガomの脱イオン水が入ったシャーレに入れ、基板が水没するようにします。次に、スタンプを金の基板にそっと押し付け、モノA層を15秒間形成します。次に、刻印された基板を窒素ガスでエタノール乾燥させて2回すすぎます。

各すすぎ後、基板をペトリ皿に入れ、基板をバックフィル液で覆います。蒸発を防ぐために、皿をパラメータで密封します。背景の単層が暗闇で12〜14時間形成されるのを待ちます。

最後に、パターン化されたカバースリップをバックフィルディング溶液から取り出し、各すすぎ後に窒素ガスでエタノール乾燥させて2回すすぎます。パターン化されたカバースリップにタンパク質を適用するには、カバースリップを小さなペトリ皿または細胞培養チャンバーのカバーに500マイクロリットルから1ミリリットルのデルコスリン酸緩衝生理食塩水で置きます。DPBSは、タンパク質のインキュベーション中に基質を完全に覆う必要があります。

タンパク質の被覆率を均一にするには、濃縮されたタンパク質溶液をDPBSに加え、数回ピペッティングして溶液を混合します。タンパク質混合物を基質と摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、基質を乾燥させたり、空気と水の界面に持ち込んだりしないように注意しながら、基質をDPBSで十分にすすいで未結合のタンパク質を取り除きます。

3回のすすぎの後、DPBSを吸引します。次に、約500マイクロリットルの完全細胞増殖培地を添加して、湿った基質を維持します。基質のすすぎに使用した成長培地を交換します。

新しい培地を使用して、基板をセルでプレーティングする準備が整いました。通常、1平方ミリメートルあたり30〜200個の細胞が基板上に播種されます。この画像は、A-P-D-M-Sスタンプをガラスカバースリップ(スケールバーは100マイクロメートル)にスタンプの特徴を下にして置いて顕微鏡で視覚化したものです。

適切なスタンピングにより、LOR 6 47標識フィブロネクチンなどの蛍光標識タンパク質を塗布することで視覚化できる、シャープでクリアなタンパク質パターンが得られます。ここでは、chk one細胞のタンパク質パターンへの閉じ込めを示しています。これらの画像では、スケールバーは100マイクロメートルです。

あるいは、免疫組織化学を使用して、SU固定後のタンパク質パターンを視覚化することもできます。ここでは、LOR three 50標識抗ラミネート抗体を用いて、E 18マウス海馬ニューロンを播種したパターン化ラミネートを4日間in vitroで可視化し、E 18マウス海馬ニューロンをMITトラッカーred five 80で染色したところ、細胞増殖がタンパク質パターンによく閉じ込められていることを示しています。この手法は簡単に習得できますが、LOR 6 47標識フィブロネクチン吸収によって視覚化されたこれらのパターン基質調製物に示されているように、いくつかの一般的な問題が発生する可能性があります。

濃縮されたタンパク質溶液をDPBSに十分に混合せずにタンパク質を適用すると、タンパク質パターンが不均一になる可能性があります。不適切なスタンピングは、部分的なパターンの転写やスタンプの崩壊につながる可能性があります。さらに、吸収されたタンパク質を含むパターン基板を空気にさらすと、単層が破壊され、抵抗が低下する可能性があります。

バックグラウンドでは、水中パターニングにより、従来のマイクロコンタクト印刷やエアー印刷では印刷が難しかった小さな特徴を持つパターンを生成することができます。これらの2つの画像は、同じパターンの異なる領域を空気中で印刷したか、脱イオン水サポートラインを左側の画像に示して、パターンの小さな特徴のみが正常に印刷できなかったことを示しています。スケールバーは20マイクロメートル 一度習得すれば、このテクニックは適切に実行されれば18〜24時間で行うことができます。

このビデオを見れば、パターン基板の作製方法について十分に理解できるはずです。A-P-D-M-Sスタンプを作成します。マイクロコンタクト印刷を利用してパターン金基板を作製し、タンパク質と細胞を使用してこのパターンを視覚化します。